专利名称：快速高效检测致病菌的方法、生物敏传感器及其制备方法
技术领域：
本发明涉及食品安全检测技术领域，特别是涉及一种快速高效检测致病菌的方法、生物传感器及其制备方法。
背景技术：
近年来世界范围内食品安全恶性事件屡有发生，无论发达国家还是发展中国家， 食源性致病菌发生率居高不下，食源性致病菌的快速检测一直是国内外研究关注的焦点。 现有技术一般采用如下的检测方法对食源性致病菌进行快速检测方案一、传统的微生物法，即GB13091-2002规定的检测方法，一般需要以下五个连续的阶段用非选择性液体培养基预增菌16 20小时；在选择性液体培养基上增菌24 小时；选择性培养基上划线识别24小时；分离，挑出菌落再次培养24小时；鉴定，用合适的生化和血清学实验进行鉴定76h最终得出检测结果。由上述步骤可以看出，传统的微生物法检测致病菌的步骤包括富集、选择培养、分离、生化鉴定、有时还需要种型确定，需要5 7天才能出报告，耗时长，操作繁琐。方案二、实时聚合酶链式反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)法，如 SNT1869-—2007食品中多种致病菌快速检测方法；公开号CN1536090A、名称为“食源性致病菌快速检测基因芯片及其应用”的方案；公开号为CN1814789A、名称为“畜禽肉和水产品中常见致病菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法”等，上述PCR技术均需要经过特定引物设计、增菌，DNA或PNA的制备，PCR扩增、检测等步骤。但PCR技术由于及其敏感，很容易受外界因素影响，一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果。一方面，食品是复杂的反应基质，影响PCR反应的因素很多，如果不能有效排除各影响因素的干扰，可能会出现假阳性结果；另一方面，如果在PCR操作过程中各种试验条件控制不当，很容易导致产物突变，还可能会导致假阴性结果。引物的设计及靶序列的选择是决定PCR结果的关键因素，引物不同则扩增物不同，如果引物的设计不当.则直接影响对关键靶序列的选择，从而降低PCR检测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。另外，PCR方法所需的试剂昂贵，有些还对人身体有害，并且检测过程中操作繁琐复杂，需要较长的检测时间，总体检测时间大于48 小时。方案三、ELISA方法，如GB/T22429-2008规定的检测方法，包括对样品做前增菌处理24小时，增菌液经加热处理后一如包被特异性抗体(一抗)的固相容器内，使目标菌与一抗结合，洗去未结合的其他成分；加入特异性酶标二抗，再次洗去未结合的其他成分； 加入特定底物与之反应，生成荧光化合物或有色化合物，通过检测荧光强度或吸光度，与参照值比较，经过2. 5小时得出检验结果。但ELISA方法也有其无法克服的缺点首先，该技术的操作技巧性较强，而且对关键点的控制对结果影响很大，在ELISA方法中重要的第一步加样，样品加入及混勻过程的误差会在以下的诸多操作中被逐级放大，造成检测结果偏差较大甚至出现假阳性和假阴性；其次，操作过程中易出现孔间交叉污染，出现假阳性；另夕卜，该方法检测限较高，达到IO6Cfu (ColonyForming Units，菌落形成单位)/升。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速高效检测致病菌的方法，可解决现有技术检测限高、检测时间较长、过程烦琐、成本高等问题。本发明还提供了一种生物敏传感器及其制备方法，以保证上述快速高效检测致病菌的方法在实际中的应用。为了解决上述问题，本发明公开了一种快速高效检测致病菌的方法，包括生物敏传感器制备步骤在酶标板的每个酶标孔中将嗜热菌超声破碎后形成并标记有PH敏感荧光探针的色素体，与β亚基单抗_生物素_链亲和素_生物素_目标检测物单克隆抗体捕捉复合体按4 1的体积比例混合均勻，在40转/分钟、35 38°C条件下孵育1小时，得到具有捕获检测目标能力的生物敏传感器；检测物捕获步骤在酶标板的每个酶标孔加入10微升制备好的生物敏传感器，再加入20 100微升样品检测液，同时设置空白对照和标准品阳性浓度对照，在35 38°C条件下孵育25 35分钟，捕获检测目标物；检测步骤在酶标板的每个酶标孔再加入70微升腺苷三磷酸合成缓冲液启动腺苷三磷酸合成反应，在38 45°C温度下温浴10 15分钟后，用荧光扫描仪进行检测；其中，所述荧光扫描仪的激发波长为485纳米、发射波长为538纳米；所述腺苷三磷酸合成缓冲液包括浓度为50毫摩尔/升的三(羟甲基)甲基甘氨酸，10%的丙三醇，浓度为5毫摩尔/升的磷酸二氢钠，浓度为5毫摩尔/升的氯化镁，氢氧化钠调pH值至8. 0，临用前加入终浓度为2毫摩尔的腺苷二磷酸。优选的，在所述检测物捕获步骤之前还包括样品预处理步骤将按标准处理程序制备的检测样品进行灭活处理，取1 10毫升震荡混勻的灭活后的样品溶液，进行4000转 /分钟、30分钟的离心分离处理，将得到的菌体沉淀用无菌生理盐水悬浮到原体积，再重复执行上述分离和悬浮过程1次或2次后，震荡混勻悬浮后的样品溶液，形成样品检测液。优选的，在所述检测步骤之后还包括数据处理步骤参照空白组和阳性对照组对检测样品是否含有致病菌进行定性判断。优选的，所述生物敏传感器包括具有信号转化功能的色素体和具有分子识别功能的捕获体系，所述生物敏传感器的制备方法具体包括色素体制备步骤在60 80°C高温摇床培养嗜热菌20 24小时，然后在4°C、 4000转/分钟的条件下离心30分钟，弃上清，收集菌体；得到的菌体用洗涤缓冲液重悬，然后在4°C、8000转/分钟的条件下离心10分钟，收集清洗后的菌体，在功率为200瓦、循环接通5秒断开9秒、有效时间为10分钟的条件下进行低温超声破碎；将超声破碎后的菌液在4°C、12000转/分钟的条件下离心30分钟去除细胞碎片和部分杂蛋白，收集上清液再在 40C，40000转/分钟的条件下超速离心1小时，将沉淀用三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液悬浮，得到色素体悬液；其中，所述洗涤缓冲液包括50毫摩尔/升的三(羟甲基)甲基甘氨酸， 浓度为0. 25摩尔/升的蔗糖和浓度为4毫摩尔/升的氯化镁，氢氧化钠调pH值至8. 0 ；所述羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液包括浓度为20毫摩尔/升的羟甲基氨基甲烷，浓度为100 毫摩尔/升的氯化钠，浓度为5毫摩尔/升的氯化镁和浓度为10%的甘油，氯化氢调pH值至 8. 0.
pH敏感荧光探针标记步骤取色素体悬液600微升，在12000转/分钟的条件下离心30分钟去甘油，得到的沉淀用超声缓冲液悬浮到原体积；然后加入1 2微升质量浓度为1毫克/毫升的PH敏感荧光探针，混勻，在循环接通5秒断开8秒有效时间为3分钟的条件下水浴超声，用超声缓冲液补满试管；然后在4°C、12000转/分钟的条件下离心30 分钟，用pH8. 0 8. 5的缓冲液悬浮沉淀，重复执行离心、悬浮过程4次，后三次的离心时间为15分钟，其他条件不变，最终完全去除游离的pH敏感荧光探针，得到标记好的色素体；其中，所述超声缓冲液为pH值5. 0 6. 0、浓度为0. 01毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；捕获体系的构建步骤将FOFl-ATP酶的β亚基的单抗与生物素、检测目标物的单抗与生物素均按3 2的连接比例混合，使得二种抗体的浓度均为为0.1毫克/毫升、生物素浓度为1微摩尔/升，室温条件下等待半小时；然后，将FOFl-ATP酶的β亚基单抗-生物素复合体、检测目标物单抗_生物素复合体按1 1的体积比混勻后，加入1. 1倍体积1 微摩尔的链亲和素，室温条件下15 30分钟后，得到具有捕获能力的β亚基单抗-生物素_链亲和素_生物素_目标检测物单克隆抗体组成的复合体；生物敏传感器生成步骤在酶标板的每个孔中加入40微升的β单抗-生物素-链亲和素-生物素-目标检测物单克隆抗体捕捉复合体，以及10微升标记好的色素体，轻轻敲打混勻，在40转/分钟、35 38°C环境下孵育1小时，得到可以捕获检测目标物的生物敏传感器。优选的，在所述捕获体系的构建步骤之前，还包括判断所述FOFl-ATP酶的β亚基单抗溶液和检测目标物的单抗溶液中是否含有叠氮化钠，若是，则使用ΡΗ8.0的磷酸盐缓冲液透析去除其中的叠氮化钠。 优选的，在所述捕获体系构建步骤之前还包括β亚基单抗制备步骤以嗜热菌基因组为模板，通过聚合酶链式反应方法扩增FOFl-ATP酶的β亚基的基因序列，将β亚基的序列进行克隆、外源表达、纯化，再经过单克隆抗体的制备得到FOFl-ATP酶的β亚基单克隆抗体。优选的，所述FOFl-ATP酶的β亚基的序列为ATGACMGAGGACGCGTTATCCMGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCMGTTTGAGMCGGCCACTTGCCGGCGATCTACMCGCCCTGAAMTTCMCATAMGCGCGCMCGAAMCGMGTCGACATCGACTTGACATTGGMGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTCATCCGCGGCATGGMGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGMGTCACGCTTGGCCGCGTGTTCMCGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGMGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCCGATTCACCGTCCGGCGCCAAMTTCGAGGMTTGGCGACGGMGTCGAMTTTTGGAMCGGGGATTAMGTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAMGGCGGAAAMTCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGMAMCGGTCTTGATTCMGAGCTGATCCACMCATCGCCCMGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGGCGTCGGCGMCGGACGCGCGMGGAMCGACTTGTACCATGAGATGAMGATTCCGGCGTCATCAGCAMACGGCCATGGTGTTCGGACAMTGMTGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGACGATGGCCGMTACTTCCGTGATGMCMGGCCMGACGTGTTGCTCTTTATCGATMCATCTTCCGTTTCACGCAGGCCGGTTCGGMGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCMCCGACATTGGCGACGGAGATGGGTCMTTGCMGAGCGGATCACGTCGACGGCGAMGGATCGATCACCTCGATTC
MGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGCGACGACGMCCTGGAGCGGMGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACATCGCGTGCGTTGGCGCCGGAMTCGTCGGCGAGGAGCACTACCMGTCGCCCGCAMGTGCAGCAMCGCTGCMCGTTATAMGMTTGCMGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGMCTGTCGGATGMGACMACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAMCTTCCACGTGGCGGAGCAGTTCACGGGCCMCCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAMGAMCAGTGCGCGGCTTTAMGAMTTTTGGMGGCAMTACGACCATCTTCCGGMGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGMGMGTCGTTGAAAMGCGMAGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。依据本发明的另一优选实施例，还公开了一种生物敏传感器，包括具有信号转化功能的色素体和具有分子识别功能的捕获体系，其中所述色素体为嗜热菌超声后细胞膜外翻形成的小囊泡，该小囊泡的膜上镶嵌有FOFl-ATP酶，色素体细胞内标记有pH敏感荧光探针；所述捕获体系为FOFl-ATP酶的β亚基单抗与生物素连接形成的复合体，以及，检测目标物单抗与生物素连接形成的复合体，通过链亲和素连接得到的β亚基单抗-生物素_链亲和素_生物素_目标检测物单克隆抗体捕捉复合体。依据本发明的还一优选实施例，公开了一种生物敏传感器的制备方法，包括色素体制备步骤在60 80°C高温摇床培养嗜热菌20 24小时，然后在4°C、 4000转/分钟的条件下离心30分钟，弃上清，收集菌体；得到的菌体用洗涤缓冲液重悬，然后在4°C、8000转/分钟的条件下离心10分钟，收集清洗后的菌体，在功率为200瓦、循环接通5秒断开9秒、有效时间为10分钟的条件下进行低温超声破碎；将超声破碎后的菌液在4°C、12000转/分钟的条件下离心30分钟去除细胞碎片和部分杂蛋白，收集上清液再在 440000转/分钟的条件下超速离心1小时，将沉淀用羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液悬浮，得到色素体悬液；其中，所述洗涤缓冲液所述洗涤缓冲液包括50毫摩尔/升的三(羟甲基)甲基甘氨酸，浓度为0. 25摩尔/升的蔗糖和浓度为4毫摩尔/升的氯化镁，氢氧化钠调PH值至8. 0 ；所述羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液包括浓度为20毫摩尔/升的羟甲基氨基甲烷，浓度为100毫摩尔/升的氯化钠，浓度为5毫摩尔/升的氯化镁和浓度为10%的甘油，氯化氢调PH值至8. 0 ；pH敏感荧光探针标记步骤取色素体悬液600微升，在12000 转/分钟的条件下离心30分钟去甘油，得到的沉淀用超声缓冲液悬浮到原体积；然后加入 1 2微升质量浓度为1毫克/毫升的pH敏感荧光探针，混勻，在循环接通5秒断开8秒有效时间为3分钟的条件下进行0 4°C水浴下超声，之后用浓度为10毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液补满试管；然后在4°C、12000转/分钟的条件下离心30分钟，用pH8. 0 8. 5的缓冲液悬浮沉淀，重复执行离心、悬浮过程4次，后三次的离心时间为15分钟，其他条件不变，最终完全去除游离的PH敏感荧光探针，得到标记好的色素体；其中，所述超声缓冲液为 pH值5. 0 6. 0、浓度为0. 01毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；捕获体系的构建步骤将FOFl-ATP酶的β亚基的单抗与生物素、检测目标物的单抗与生物素均按3 2的连接比例混合，使得二种抗体的浓度均为为0.1毫克/毫升、生物素浓度为1微摩尔/升，室温条件下等待半小时；然后，将FOFl-ATP酶的β亚基单抗-生物素复合体、检测目标物单抗_生物素复合体按1 1的体积比混勻后，加入1. 1倍体积1 微摩尔的链亲和素，室温条件下15 30分钟后，得到具有捕获目标检测物功能的β亚基单抗_生物素_链亲和素_生物素_目标检测物单克隆抗体组成的复合体
生物敏传感器生成步骤在酶标板的每个孔中加入40微升的β单抗-生物素-链亲和素-生物素-目标检测物单克隆抗体捕捉复合体，以及10微升标记好的色素体，轻轻敲打混勻，在40转/分钟、35 38°C环境下孵育1小时，得到可以捕获检测目标物的生物敏传感器。优选的，在所述捕获体系构建步骤之前还包括β亚基单抗制备步骤以嗜热菌基因组为模板，通过聚合酶链式反应方法扩增FOFl-ATP酶的β亚基的基因序列，将β亚基的序列进行克隆、外源表达、纯化，再经过单克隆抗体的制备得到FOFl-ATP酶的β亚基单克隆抗体。与现有技术相比，本发明具有以下优点首先，本发明方案的检测限低，检测时间短。其检测限可达到IOOcfu/孔，若按 lcfu/25g计算，整个检测过程不超过12小时，至少比常规的微生物检验方法缩短60小时， 比PCR方法缩短36小时；当菌浓度高于lCfU//25g时，所需时间更短，因此，可对食品安全和治病菌控制产生深刻影响。其次，本发明方案所需试
第三，本发明方案还具有前增菌时间短、操作简单(仅包括生物敏传感器制备、力口样和启动反应、检测等三个步骤，而且每批次可以检测多个样品)、可避免现有PCR检测方法因外界因素影响而出现假隐性或假阳性检测结果等优点。另外，本发明方案不仅可参照空白组和阳性对照组对被检测物进行致病菌类的检测，还根据不同浓度标准品的相对荧光强度建立的曲线对被检测物进行药残类检测。
图1是本发明生物敏传感器制备方法一实施例所制备的色素体结构示意图；图2是本发明生物敏传感器制备方法一实施例PH敏感荧光探针单方向标记色素体过程示意图；图3是本发明生物敏传感器制备方法一实施例捕获体系构建过程示意图；图4是本发明生物敏传感器一实施例基于FOFl-ATP酶的生物敏传感器的模型示意图；其中，41-酶标孔；42-膜上负载有FOFl-ATP酶的色素体；43-F0F1-ATP酶；44_pH 敏感荧光探针；45-F0F1-ATP酶的β亚基单抗；46-生物素；47-链亲和素；48-目标检测物单克隆抗体。
具体实施例方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。本发明的核心构思之一在于利用FOFl-ATP(Adenosine-Triphosphate，腺苷三磷酸)酶独有的酶活机理研发了高灵敏生物传感器FOFl-ATP酶的致病菌检测技术。 FOFl-ATP酶是一旋转分子马达，它既能利用跨膜H+梯度合成ATP，又能水解ATP而反向转运 H+。在ATP合成过程中，质子能够从色素体膜内泵到膜外侧，导致内膜微环境溶液H+浓度变化。在FOFl-ATP酶上连接负载会不同程度影响其旋转性能，在其β亚基上连接上不同负载引起质子转运速率的改变不同。以PH敏感的荧光探针来感应负载，其荧光强度作为信号反应并定量负载情况，最终达到检测目的。本发明方案中生物敏传感器中生物识别元件为单克隆抗体，信号转换元件为光学元件。其基本原理为待测物质和分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的光信号，再经仪表放大和输出，从而达到分析检测的目的。生物敏传感器分析技术与传统的检测方法相比具有选择性好、灵敏度高、 分析速度快、成本低等优点。对食品安全和致病菌疾病爆发的预防具有重大意义。在食品污染物的快速实时及特异性检测方面有广阔的应用前景。生物敏传感器及其制备方法实施例一种检测致病菌的生物敏传感器，包括(1)具有信号转化功能的色素体。从嗜热菌制备得到的色素体，是嗜热菌超声后细胞膜外翻形成的小囊泡，该囊泡膜上镶嵌的 FOFl-ATP酶也随之外翻——疏水端暴露。(2)具有分子识别功能的捕获体系。该生物敏传感器可采用如下步骤制备步骤一、嗜热菌ATPase的β亚基的外源表达与纯化以嗜热菌(Thermomicrobium ATCC27502)基因组为模板，以PCR方法扩增 FOFl-ATP酶的β亚基，然后对扩增基因测序并进行序列比对，确定所扩增基因为FOFl-ATP 酶的β亚基，其序列为 ATGACMGAGGACGCGTTATCCMGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCMGTTTGAGMCGGCCACTTGCCGGCGATCTACMCGCCCTGAAMTTCMCATAMGCGCGCMCGAAMCGMGTCGACATCGACTTGACATTGGMGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTCATCCGCGGCATGGMGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGMGTCACGCTTGGCCGCGTGTTCMCGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGMGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCCGATTCACCGTCCGGCGCCAAMTTCGAGGMTTGGCGACGGMGTCGAMTTTTGGAMCGGGGATTAMGTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAMGGCGGAAAMTCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGMAMCGGTCTTGATTCMGAGCTGATCCACMCATCGCCCMGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGGCGTCGGCGMCGGACGCGCGMGGAMCGACTTGTACCATGAGATGAMGATTCCGGCGTCATCAGCAMACGGCCATGGTGTTCGGACAMTGMTGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGACGATGGCCGMTACTTCCGTGATGMCMGGCCMGACGTGTTGCTCTTTATCGATMCATCTTCCGTTTCACGCAGGCCGGTTCGGMGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCMCCGACATTGGCGACGGAGATGGGTCMTTGCMGAGCGGATCACGTCGACGGCGAMGGATCGATCACCTCGATTCMGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGCGACGACGMCCTGGAGCGGMGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACATCGCGTGCGTTGGCGCCGGAMTCGTCGGCGAGGAGCACTACCMGTCGCCCGCAMGTGCAGCAMCGCTGCMCGTTATAMGMTTGCMGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGMCTGTCGGATGMGACMACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAMCTTCCACGTGGCGGAGCAGTTCACGGGCCMCCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAMGAMCAGTGCGCGGCTTTAMGAMTTTTGGMGGCAMTACGACCATCTTCCGGMGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGMGMGTCGTTGAAAMGCGMAGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。对此序列分子克隆、外源表达，纯化，进行单克隆抗体制备。制备得到的单克隆抗体进行分子筛纯化，备用。因得到的β亚基需要为期半年左右的单克隆抗体制备过程，方可得到该亚基单抗，因此本步骤需要在生物敏传感器制备之前预先执行。步骤二、色素体的制备在60 80 °C 高温摇床培养嗜热菌(Thermomicrobium ATCC27502) 20 24h (Hour,小时)。然后在 4 "C >4000rpm(Revolutions Per Minute,转 / 分钟)条件下离心30min(Minute，分钟)，弃上清，收集沉淀菌体。菌体用洗涤缓冲液(50mmol/L tricine-NaOH, ρΗ8· 0，0. 25mol/L 蔗糖，4mmol/L MgCl2 缓冲液)重悬，在 4 °C、8000rpm 条件下离心lOmin，收集清洗后的菌体进行低温超声破碎(200w，on 5s, off 9s，有效时间 IOmin)。超声破碎后的菌液在4°C、12000rpm条件下离心30min去除细胞碎片和部分杂蛋白，收集上清液再在4°C，40000rpm条件下进行超速离心lh，沉淀即为色素体。所得色素体用 Tris-HCl 缓冲液(20mmol/L Tris-Cl, 100mmol/L NaCl,5mmol/L MgCl2,10% 甘油， pH8. 0)悬浮备用。该色素体的结构如图1所示，包括超声过程中细胞膜外翻形成的囊泡和 F0F1-ATP酶；该囊泡不仅是F0F1-ATP酶的载体，同时为该酶提供质子库，而膜内外的质子梯差是该酶合成ATP的动力；F0F1-ATP酶包括Cn (10彡η彡14)环、以及α、β、δ、γ、 ε、a、b2亚基，在本发明方案中，选择在F0F1-ATP酶的活性部位(即β亚基上)负载目标检测物。步骤三、用ρΗ敏感荧光探针F1300单方向标记色素体及标记后水解活性测定取步骤二制备的色素体悬液600 μ L，在12000rpm条件下离心30min去甘油，所得的沉淀用超声缓冲液(ρΗ5· 0 6. 0,0. Olmmol/L Tris-HCl)悬浮到原体积。然后加入1 2口1^质量浓度为111^/1^的？1300荧光探针，混勻，在0 41水浴下超声(小功率下On 5s, Off 8s，有效时间3min)。超声完成后用单倍磷酸盐缓冲液(1XPBS，Phosphate Buffered Saline)补满试管，然后在4°C、12000rpm条件下离心30min，用pH8. 0-8. 5缓冲液悬浮沉淀，重复4次，后三次离心时间为15min，其他条件不变，最终完全去除游离F1300探针，得到标记好的色素体(以下简称F1300-ch)。标记流程如图2所示，包括加入荧光探针步骤21、 低PH值条件下超声步骤22以及离心去除游离探针步骤23。需要说明的是，由于超声放热，为保证0 4°C的水浴条件，可选择在水中放冰。F1300-ch的ATP水解活性测定可采用酶偶联法，通过检测NADH在340nm波长处的吸光度变化来测定ATPase水解活力。1个酶活单位定义为每毫克色素体每分钟内可水解 lymol ATP0步骤四、具有分子识别功能的捕获体系的构建将F0F1-ATP酶的β亚基的单抗(步骤一制备)与生物素、检测目标物的单抗与生物素的连接比例均按3 2混合，室温半小时。其中抗体浓度为0. lmg/mL;生物素浓度为1 μ mol/L。如果抗体的储存液中含有叠氮化钠(NaN3)，使用前先采用pH8. 0的磷酸盐缓冲液透析去除NaN3。F0F1-ATP酶的β亚基单抗-生物素、检测目标物单抗-生物素两复合体按1 1 体积比混勻后，加入1. 1倍体积1 μ mol的链亲和素，室温15 30min。得到具有捕获目标检测物的β亚基单抗-生物素-链亲和素-生物素-目标检测物单克隆抗体组成的复合体。上述捕获体系的构建过程如图3所示。步骤五、生物敏传感器的完成
在酶标板每孔中加入40 μ Li3单抗-生物素_链亲和素-生物素-目标检测物单克隆抗体捕捉复合体，10 μ IL F1300-ch，轻轻敲打混勻。在40rpm、35 38°C (优选采用 370C )条件下孵育lh，得到可以捕获检测目标的生物敏传感器，该生物敏传感器的结构示意图如图4所示。利用生物敏传感器检测样品中致病菌的方法实施例步骤一、样品预处理
将参照GB/T 4789. 30规定的程序制备的检测样品进行灭活处理，取1 IOmL震荡混勻的灭活后的样品溶液，进行4000rpm、30min的离心分离处理，将得到的菌体沉淀用无菌生理盐水悬浮到原体积，再重复执行上述分离和悬浮过程1次或2次后，震荡混勻悬浮后的样品溶液，形成样品检测液。需要说明的是，不同的致病菌灭活的温度和需要灭活的时间都是不同的，需要选择最温和的灭活条件，来保证对其破坏降低到最低限度，如0157 :H7菌55°C、5 20min即可灭活；单增李斯特70 80°C、20 30min即可灭活；而金黄色葡萄球菌一般需要80°C、 Ih灭活。步骤二、检测物的捕获在酶标板的每个酶标孔加入10 μ L前述生物敏传感器制备步骤制备好的生物敏传感器，再加入20μ L IOOyL样品处理液。同时设置空白对照和标准品阳性对照，35°C 38°C孵育25 35min (优选采用37°C孵育30min)，捕获检测目标物。步骤三、检测在酶标板的每孔再加入70 μ L ATP合成缓冲液(50mmol/L Tricine_Na0HpH8. 0、 10%丙三醇、5mmol/L NaH2PO4、5mmol/L MgCl2,临用前加入终浓度为2mmol腺苷二磷酸ADP) 启动ATP合成反应，38 45°C温浴10 15min (优选采用45°C温浴15min)后用荧光扫描仪进行检测，选择激发波长485nm、发射波长538nm。步骤四、数据处理参照空白组和阳性对照组对检测物中的致病菌进行定性判断。需要说明的是，通过本发明方案，还可以根据不同浓度标准品的相对荧光强度建立的标准曲线对食品中抗生素、药残情况进行定量判断。下面，以食品中单核细胞增生李斯特菌的检测方法为例，具体说明利用生物敏传感器检测食源性致病菌的方法，包括步骤一、样品预处理参照GB/T 4789. 30规定的程序，制备检测样品，并进行增菌培养；其中，增菌的处理过程具体为增菌液60 70°C，进行5 20min灭活，然后取1 IOmL震荡混勻的灭活后的增菌液，在4000rpm、30min条件下进行分离，所得菌体沉淀用无菌生理盐水悬浮到原体积，重复操作分离和悬浮过程两次。第三次离心得到的菌体，用无菌生理盐水悬浮到原体积，震荡混勻，作为检测液备用。步骤二、阳性对照培养标准菌株(ATCC15313) 18 24h，将菌液梯度稀释后涂板计数，算出标准菌液浓度为5. 03X 108cfu/mL，标准菌株液体的增菌处理过程与前述增菌过程相同。沉淀的菌体恢复至原体积后梯度稀释得到5X 103、5X 104、5X IO5CfVmL的阳性对照。需要说明的是，由于对致病菌检测为定性检测，理论上讲只需要一组阳性对照即可，这里设计多个阳性对照组，是为了更好的说明本技术方案的可行性。步骤三、FOFl-ATP酶免疫生物传感器的制备首先，进行制备色素体，并进行荧光标记，具体步骤为在60°C 高温摇床培养嗜热菌(Thermomicrobium ATCC27502) 24h，然后在 4 °C、 4000rpm的条件下离心30min，弃上清，收集菌体；得到的菌体用洗涤缓冲液(50mmol/L tricine-NaOH, pH8. 0,0. 25mol/L 蔗糖，4mmol/L MgCl2 缓冲液)重悬，然后在 4°C、8000rpm 的条件下离心lOmin，收集清洗后的菌体，在功率为200w、0N 5s,OFF 9s、有效时间为IOmin 的条件下进行低温超声破碎；将超声破碎后的菌液在4°C、12000rpm的条件下离心30min去除细胞碎片和部分杂蛋白，收集上清液再在4°C，40000rpm的条件下超速离心lh，将沉淀用 Tris-HCl 缓冲液(20mmol/L Tris-Cl, 100mmol/L NaCl,5mmol/L MgCl2,10%甘油，pH8. 0) 悬浮，得到色素体悬液，pH敏感荧光探针标记步骤取色素体悬液600μ ，在12000rpm的条件下离心 30min去甘油，得到的沉淀用超声缓冲液(pH5. 0 6. 0,0. 01mmol/LTris-HCl)超声悬浮到原体积；然后加入IpL质量浓度为lmg/mL的pH敏感荧光探针F1300，混勻，在小功率下 ON 5s、OFF 8s、有效时间为3min的条件下水浴超声，用超声缓冲液补满试管；然后在4°C、 12000rpm的条件下离心30min，用pH8. 0 8. 5的缓冲液悬浮沉淀，重复执行离心、悬浮过程4次，后三次的离心时间为15min，其他条件不变，最终完全去除游离的pH敏感荧光探针， 得到标记好的色素体；其次，是捕获体系的建立步骤将F0F1-ATP酶的β亚基的单抗与生物素、检测目标物的单抗与生物素均按3 2 的连接比例混合，使得二种抗体的浓度均为为0. lmg/mL、生物素浓度为lymol/L，室温条件下等待半小时；然后，将F0F1-ATP酶的β亚基单抗-生物素复合体、检测目标物单抗-生物素复合体按1 1的体积比混勻后，加入1.1倍体积1微摩尔的链亲和素，室温条件下15 分钟后，得到具有捕获目标检测物的β亚基单抗-生物素-链亲和素-生物素-目标检测物单克隆抗体组成的复合体；第三，F0F1-ATP酶免疫生物传感器的完成生物敏传感器生成步骤在酶标板的每个孔中加入40 μ L的β单抗-生物素-链亲和素-生物素-目标检测物单克隆抗体捕捉复合体，以及10 μ L标记好的色素体，轻轻敲打混勻，在40rpm、35 38°C环境下孵育lh，得到可以捕获检测目标物的生物敏传感器。步骤四、检测首先，在酶标板的酶标孔中加样，包括样品检测液、5X 103Cfu/mL阳性对照、5X 104cfu/mL阳性对照、5X 105cfu/mL的阳性对照、空白对照(无菌生理盐水)共五组，选用英国Corning公司酶标板，每组设置10个平行孔，每孔加入20 μ L，五组分别对应“未知数量”cfu/孔，IO2Cfu/孔，IO3Cfu/孔，IO4Cfu/ 孔和 Ocfu/ 孔，37 °C 孵育 30min。然后，启动合成反应并记录检测结果每孔再加入70 μ L终浓度为2mmol/L ADP的ATP合成缓冲液(50mmol/LTricine
14ρΗ8· 0、10%丙三醇、5mmol/L NaH2PO4、5mmol/L MgCl2)启动 ATP 合成反应，45°C温浴 15min， 选择激发波长485nm、发射波长538nm进行反应后相对荧光值的检测。步骤五、检测结果如下
权利要求
1.一种快速高效检测致病菌的方法，其特征在于，包括生物敏传感器制备步骤在酶标板的每个酶标孔中将嗜热菌超声破碎后形成并标记有 PH敏感荧光探针的色素体，与β亚基单抗-生物素-链亲和素-生物素-目标检测物单克隆抗体组成的捕捉复合体按4 1的体积比例混合均勻，在40转/分钟、35 38°C条件下孵育1小时，得到具有捕获目标检物能力的生物敏传感器；检测物捕获步骤在酶标板的每个酶标孔加入10微升制备好的生物敏传感器，再加入 20 100微升样品检测液，同时设置空白对照和标准品阳性对照，在35 38°C条件下孵育 25 35分钟，捕获目标检测物；检测步骤在酶标板的每个酶标孔再加入70微升腺苷三磷酸合成缓冲液启动腺苷三磷酸合成反应，在38 45°C温度下温浴10 15分钟后，用荧光扫描仪进行检测；其中，检测用到荧光扫描仪的激发波长为485纳米、发射波长为538纳米；所述腺苷三磷酸合成缓冲液包括浓度为50毫摩尔/升、pH值为8. 0的离子缓冲剂，10%的丙三醇，浓度为5毫摩尔/ 升的磷酸二氢钠，浓度为5毫摩尔/升的氯化镁，临用前加入2毫摩尔的腺苷二磷酸。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述检测物捕获步骤之前还包括样品预处理步骤将按标准处理程序制备的检测样品进行灭活处理，取1 10毫升震荡混勻的灭活后的样品溶液，进行4000转/分钟、30分钟的离心分离处理，将得到的菌体沉淀用无菌生理盐水悬浮到原体积，再重复执行上述分离和悬浮过程1次或2次后，震荡混勻悬浮后的样品溶液，形成样品检测液。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述检测步骤之后还包括数据处理步骤参照空白组和阳性对照组对检测样品是否含有致病菌进行定性判断。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述生物敏传感器包括具有信号转化功能的色素体和具有分子识别功能的捕获体系，所述生物敏传感器的制备方法具体包括色素体制备步骤在60 80°C高温摇床培养嗜热菌20 24小时，然后在4°C、4000 转/分钟的条件下离心30分钟，弃上清，收集菌体；得到的菌体用洗涤缓冲液重悬，然后在 48000转/分钟的条件下离心10分钟，收集清洗后的菌体，在功率为200瓦、循环接通5 秒断开9秒、有效时间为10分钟的条件下进行低温超声破碎；将超声破碎后的菌液在4°C、 12000转/分钟的条件下离心30分钟去除细胞碎片和大部分杂蛋白，收集上清液再在4°C， 40000转/分钟的条件下超速离心1小时，将沉淀用三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液悬浮， 得到色素体悬液；其中，所述洗涤缓冲液包括浓度为50毫摩尔/升的三(羟甲基)甲基甘氨酸，浓度为0. 25摩尔/升的蔗糖和浓度为4毫摩尔/升的氯化镁，氢氧化钠调pH值至 8.0;所述羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液包括浓度为20毫摩尔/升的羟甲基氨基甲烷，浓度为100毫摩尔/升的氯化钠，浓度为5毫摩尔/升的氯化镁和浓度为10%的甘油，氯化氢调 pH值至8. 0 ；PH敏感荧光探针标记步骤取色素体悬液600微升，在12000转/分钟的条件下离心 30分钟去甘油，得到的沉淀用超声缓冲液悬浮到原体积；然后加入1 2微升质量浓度为1 毫克/毫升的PH敏感荧光探针，混勻，在循环接通5秒断开8秒有效时间为3分钟的条件下水浴超声，用超声缓冲液补满试管；然后在4°C、12000转/分钟的条件下离心30分钟，用 PH8. 0 8. 5的缓冲液悬浮沉淀，重复执行离心、悬浮过程4次，后三次的离心时间为15分钟，其他条件不变，最终完全去除游离的PH敏感荧光探针，得到标记好的色素体；其中，所述超声缓冲液为pH值5. O 6. O、浓度为0. 01毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；捕获体系的构建步骤将FOFl-ATP酶的β亚基的单抗与生物素、检测目标物的单抗与生物素均按3 2的连接比例混合，使得二种抗体的浓度均为0.1毫克/毫升、生物素浓度为1微摩尔/升，室温条件下等待半小时；然后，将FOFl-ATP酶的β亚基单抗-生物素复合体、检测目标物单抗-生物素复合体按1 1的体积比混勻后，加入1.1倍体积浓度为1 微摩尔/升的链亲和素，室温条件下15 30分钟后，得到β亚基单抗-生物素-链亲和素_生物素_目标检测物单克隆抗体组成的捕捉复合体；生物敏传感器生成步骤在酶标板的每个孔中加入40微升的β单抗-生物素-链亲和素_生物素_目标检测物单克隆抗体捕捉复合体，以及10微升标记好的色素体，轻轻敲打混勻，在40转/分钟、35 38°C环境下孵育1小时，得到可以捕获检测目标物的生物敏传感器。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在所述捕获体系构建步骤之前还包括 β亚基单抗制备步骤以嗜热菌基因组为模板，通过聚合酶链式反应方法扩增FOFl-ATP酶的β亚基的基因序列，将β亚基的序列进行克隆、外源表达、纯化，最后通过单克隆抗体的制备得到FOFl-ATP酶的β亚基单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述FOFl-ATP酶的β亚基的序列为 ATGACAAGAGGACGCGTTATCCAAGTCATGGGTCCGGTTGTAGACGTCAAGTTTGAGAACGGCCACTTGC CGGCGATCTACAACGCCCTGAAAATTCAACATAAAGCGCGCAACGAAAACGAAGTCGACATCGACTTGAC ATTGGAAGTCGCCTTGCACCTTGGCGATGATACAGTACGGACGATCGCGATGGCGTCCACAGACGGCCTC ATCCGCGGCATGGAAGTCATCGATACCGGTGCACCGATTTCGGTGCCGGTCGGCGAAGTCACGCTTGGCC GCGTGTTCAACGTCTTGGGCGAGCCGATCGACTTGGAAGGCGACATTCCGGCTGACGCCCGCCGCGACCC GATTCACCGTCCGGCGCCAAAATTCGAGGAATTGGCGACGGAAGTCGAAATTTTGGAAACGGGGATTAAA GTCGTTGACTTGCTTGCCCCGTATATTAAAGGCGGAAAAATCGGTTTGTTCGGCGGCGCTGGCGTAGGAA AAACGGTCTTGATTCAAGAGCTGATCCACAACATCGCCCAAGAGCACGGCGGGATTTCCGTCTTTGCTGG CGTCGGCGAACGGACGCGCGAAGGAAACGACTTGTACCATGAGATGAAAGATTCCGGCGTCATCAGCAAA ACGGCCATGGTGTTCGGACAAATGAATGAGCCGCCGGGGGCGCGGATGCGCGTCGCCTTGACCGGCTTGA CGATGGCCGAATACTTCCGTGATGAACAAGGCCAAGACGTGTTGCTCTTTATCGATAACATCTTCCGTTT CACGCAGGCCGGTTCGGAAGTGTCGGCGCTGTTAGGCCGCATGCCGTCGGCCGTTGGTTACCAACCGACA TTGGCGACGGAGATGGGTCAATTGCAAGAGCGGATCACGTCGACGGCGAAAGGATCGATCACCTCGATTC AAGCGATTTACGTCCCGGCCGACGACTATACGGACCCGGCTCCGGCCACGACGTTCTCGCACTTGGATGC GACGACGAACCTGGAGCGGAAGCTCGCGGAGATGGGGATTTATCCGGCCGTTGACCCGCTCGCTTCGACA TCGCGTGCGTTGGCGCCGGAAATCGTCGGCGAGGAGCACTACCAAGTCGCCCGCAAAGTGCAGCAAACGC TGCAACGTTATAAAGAATTGCAAGACATCATCGCCATCTTGGGGATGGATGAACTGTCGGATGAAGACAA ACTCGTCGTTCATCGCGCCCGCCGCATCCAGTTCTTCTTGTCGCAAAACTTCCACGTGGCGGAGCAGTTC ACGGGCCAACCGGGCTCCTACGTGCCGGTGAAAGAAACAGTGCGCGGCTTTAAAGAAATTTTGGAAGGCA AATACGACCATCTTCCGGAAGATGCGTTCCGCTTAGTCGGCCGCATTGAAGAAGTCGTTGAAAAAGCGAA AGCGATGGGTGTCGAAGTGTGA。
7.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在所述捕获体系的构建步骤之前，还包括判断所述FOFl-ATP酶的β亚基单抗溶液和检测目标物的单抗溶液是否含有叠氮化钠，若是，则使用ΡΗ8. 0的磷酸盐缓冲液透析去除其中的叠氮化钠。
8.一种用于致病菌检测的生物敏传感器，其特征在于，包括具有信号转化功能的色素体和具有分子识别功能的捕获体系，其中所述色素体为嗜热菌超声后细胞膜外翻形成的小囊泡，该小囊泡的膜上镶嵌有 FOFl-ATP酶，色素体细胞内标记有ρΗ敏感荧光探针；所述捕获体系为FOFl-ATP酶的β亚基单抗与生物素连接形成的复合体，以及，检测目标物单抗与生物素连接形成的复合体，通过链亲和素连接得到的β亚基单抗-生物素-链亲和素_生物素_目标检测物单克隆抗体具有捕捉功能的复合体。
9.一种用于食品安全检测的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括色素体制备步骤在60 80°C高温摇床培养嗜热菌20 24小时，然后在4°C、4000转/分钟的条件下离心30分钟，弃上清，收集菌体；得到的菌体用洗涤缓冲液重悬，然后在4°C、8000转/分钟的条件下离心10分钟，收集清洗后的菌体，在功率为200瓦、循环接通5秒断开9秒、有效时间为10分钟的条件下进行低温超声破碎；将超声破碎后的菌液在4°C、12000转/分钟的条件下离心30分钟去除细胞碎片和部分杂蛋白，收集上清液再在4°C，40000转/分钟的条件下超速离心1小时，将沉淀用羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液悬浮，得到色素体悬液；其中，所述洗涤缓冲液包括50毫摩尔/升的三(羟甲基)甲基甘氨酸，浓度为0. 25摩尔/升的蔗糖和浓度为4毫摩尔/升的氯化镁，氢氧化钠调ρΗ值至8. 0 ；所述羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液包括浓度为20毫摩尔/升的羟甲基氨基甲烷，浓度为100毫摩尔/升的氯化钠， 浓度为5毫摩尔/升的氯化镁和浓度为10%的甘油，氯化氢调ρΗ值至8. 0 ；PH敏感荧光探针标记步骤取色素体悬液600微升，在12000转/分钟的条件下离心 30分钟去甘油，得到的沉淀用超声缓冲液悬浮到原体积；然后加入1 2微升质量浓度为1 毫克/毫升的PH敏感荧光探针，混勻，在循环接通5秒断开8秒有效时间为3分钟的条件下进行0 4°C水浴下超声，之后用浓度为10毫摩尔的磷酸盐缓冲液补满试管；然后在4°C、 12000转/分钟的条件下离心30分钟，用pH8. 0 8. 5的缓冲液悬浮沉淀，重复执行离心、 悬浮过程4次，后三次的离心时间为15分钟，其他条件不变，最终完全去除游离的ρΗ敏感荧光探针，得到标记好的色素体；其中，所述超声缓冲液为ρΗ值5. 0 6. 0、浓度为0. 01毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；捕获体系的构建步骤将FOFl-ATP酶的β亚基的单抗与生物素、检测目标物的单抗与生物素均按3 2的连接比例混合，使得二种抗体的浓度均为为0.1毫克/毫升、生物素浓度为1微摩尔/升，室温条件下等待半小时；然后，将FOFl-ATP酶的β亚基单抗-生物素复合体、检测目标物单抗-生物素复合体按1 1的体积比混勻后，加入1.1倍体积1微摩尔的链亲和素，室温条件下15 30分钟后，得到β亚基单抗-生物素-链亲和素-生物素_目标检测物单克隆抗体捕捉复合体；生物敏传感器生成步骤在酶标板的每个孔中加入40微升的具有捕获功能的β单抗_生物素_链亲和素_生物素_目标检测物单克隆抗体组成的复合体，以及10微升标记好的色素体，轻轻敲打混勻，在40转/分钟、35 38°C环境下孵育1小时，得到可以捕获检测目标物的生物敏传感器。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，在所述捕获体系构建步骤之前还包括 β亚基单抗制备步骤以嗜热菌基因组为模板，通过聚合酶链式反应方法扩增FOFl-ATP酶的β亚基的基因序列，将β亚基的序列进行外源表达、纯化，经过单克隆抗体的制备得到 FOFl-ATP酶的β亚基单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了一种快速高效检测致病菌的方法、生物传感器及其制备方法，其中，所述生物传感器包括具有信号转化功能的色素体和具有分子识别功能的捕获体系；所述快速高效检测致病菌的方法包括生物敏传感器的制备，用生物敏传感器捕获样品检测液，同时设置空白对照和标准品阳性浓度对照，启动腺苷三磷酸合成反应，然后用荧光扫描仪进行检测。本发明方案的检测限低，检测时间短，其检测限可达到100cfu/孔，若按1cfu/25g计算，整个检测过程不超过12小时，至少比常规的微生物检验方法缩短60小时，比PCR方法缩短36小时；当样品中菌浓度高于1cfu/25g时，所需时间更短，因此，可对食品安全和治病菌控制产生深刻影响。
文档编号G01N33/52GK102221610SQ20101015061
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者亢子佳, 伦永志, 刘清珺, 武会娟, 魏玲 申请人:北京市理化分析测试中心