专利名称：：一种检测天麻多糖中单糖组成的方法
技术领域：
：本发明涉及多糖组分分析领域。具体涉及一种检测天麻多糖中单糖组成的方法。
背景技术：
：天麻(GastrodiaelataBlume)属兰科非自养型植物的干燥块茎，是我国传统的名贵中药，天麻具有平肝熄风止痉之功效，主要用于治疗治疗头痛眩晕、惊风抽搐、肢体麻木、面肌痉挛、高血压、冠心病等疾病。早期的研究者提取分离出天麻中许多活性成分，包括天麻素、天麻苷元、派立新、香草醇、对羟基苯甲醛、留醇、柠檬酸、琥珀酸等。近年来，许多研究工作者都从天麻中分离得到了天麻多糖，并对其药理活性进行了实验研究，结果表明，天麻多糖具有清除自由基、抗眩晕、降血压，增强免疫，抑菌等功效。多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。随着分子生物学和细胞生物学的发展，多糖及其缀合物作为支持组织和能量来源的传统观念早已被突破，而被认为是生物体内除核酸以外的又一类重要的信息分子，而且由于它们常是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息的传递和感受的关键因子，因此，具有生物活性的活性多糖的研究日益受到重视。多糖的生物活性与其平均分子质量大小和单糖组成有密切的关系，所以检测多糖中单糖的组成对多糖生物活性的研究有很大的帮助。用于多糖测定的方法主要有显色法、气相色谱法、毛细管电泳法、阴离子色谱法，C18柱HPLC-UV法等。其中显色法只能检测总多糖含量，专属性差。气相色谱法过程复杂而且会出现异构化色谱峰。毛细管电泳法存在灵敏度差的缺点。阴离子色谱法所用柱子价格昂贵，且需要很长的时间来平衡。C18柱HPLC-UV法对植物多糖中单糖组分的检测具有检测设备相对便宜，灵敏度高，准确性好等优点，被越来越多的多糖研究人员采用。目前，天麻多糖的检测主要用到上述的显色法和阴离子色谱法，未见天麻多糖中单糖检测用到C18柱HPLC-UV法的研究报道。由于干扰成分和单糖组成的不同，在直接使用文献中报道的其他多糖C18柱HPLC-UV法检测时，总会出现各种各样的问题。
发明内容本发明的目的是提供一种方便、稳定、准确的检测天麻多糖中单糖组成的方法。本发明针对天麻多糖检测过程中干扰成分和组成单糖的不同，在现有C18柱HPLC-UV法检测其他植物多糖的基础上，进一步发展和改进，形成了一种新的方法用于天麻多糖中单糖组成的检测。本发明的技术解决方案为从天麻中提取制得的天麻多糖，先通过酸水解使其成为单糖，然后加入衍生化化试剂进行衍生化，衍生化完成后，进入HPLC系统检测。在HPLC系统中，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱进行分离，柱温35°C，流动相是按一定比例混合的缓冲盐和有机溶剂，流速0.81.5ml/min，紫外检测器，波长220360nm。在本发明中，天麻多糖首先加酸水解形成单糖，所用酸选自无机酸或有机酸，包括但不限于盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸等。水解物用衍生化试剂进行衍生化，所用衍生化试剂包括但不限于1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)。在HPLC系统中，使用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱子内径、颗粒粒径和柱子长度可任意选择，只要能分离开各个单糖即可。流动相为缓冲溶液和有机溶剂的混合液，所用缓冲溶液是弱酸与其盐的混合溶液，包括但不限于磷酸二氢钾水溶液_氢氧化钠、磷酸氢二钠_磷酸二氢钾、醋酸_醋酸钠水溶液、醋酸铵水溶液_醋酸、柠檬酸_柠檬酸钠水溶液等，所用有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈等。流速在0.81.5ml/min范围内任意选择。紫外检测器的波长在220360nm间任意选择。使用本发明所述方法，可一次性分离检测出天麻多糖中各个单糖含量，方法的专属性强，灵敏度高，准确性好。所使用的仪器设备比较常见，方法容易实现，检测成分较低。图1天麻多糖HPLC检测色谱图具体实施例方式实施一1.仪器与试药1.1仪器Ultimate3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)；水浴锅BC-W203(上海贝凯)；XS105电子天平(Mettler-Tolledo)1.2试药超纯水，娃哈哈纯净水；甲醇、乙腈均为色谱纯迪马公司；氯仿、甲醇、浓硫酸、葡萄糖、NaOH、盐酸、冰醋酸、乙酸铵均为分析纯广州试剂厂；甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖均为分析纯上海试剂二厂；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)分析纯天津大茂。2.色谱条件色谱柱phenmenex-C18(150*4.6mm,5μm)；柱温35°C；波长254nm；流动相0.lmol/1醋酸铵水溶液-醋酸缓冲盐乙腈，梯度洗脱3.标准溶液制备3.1单糖对照品混合液的配制分别精密称取甘露糖0.0192g、鼠李糖0.0183g、葡萄糖0.0420g、阿拉伯糖0.0212g，置IOmL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇勻，即得3.2单糖对照品混合液的衍生精密吸取单糖对照品混合液lml，于具塞试管中，分别加入0.3mol/L氢氧化钠Iml和0.5mol/LPMP甲醇溶液1ml，涡旋混合30s,置于70°C水浴反应40min，取出，冷却至室温，加入0.3mol/L盐酸Iml进行中和，然后加入5ml氯仿涡旋混勻30s，静置5min，小心用注射器吸取下层有机相，上层水相再重复萃取2次，经0.45μm微孔滤膜滤过，进样分析4.样品溶液制备4.1样品水解精确称取天麻多糖20.Omg,置于IOmL具塞试管内，加入lmol/L的硫酸溶液2.OmL,于100°C水浴中水解2h，得水解样品溶液。用2mol/L氢氧化钠水溶液中和至pH7.0，并以纯化水稀释到5.OmL，离心，吸取上清夜，得多糖水解样品。4.2衍生化化将水解后的天麻多糖按“3.2”项下方法进行衍生化处理5.线性关系考察取适量对照品混合液按“3.2”方法进行衍生，经0.45μm微孔滤膜滤过，分别进样3.0,4.0，5.0,8.0，10.OμL，记录色谱图，以紫外测定的峰面积为纵坐标，以相应单糖的进样量为横坐标进行线性回归。结果表明各单糖的进样量(X)与峰面积(Y)有良好的线性关系，见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>6.结果天麻多糖样品水解并衍生化后，经HPLC检测，各单糖含量为甘露醇1.8%，鼠李糖1.，葡萄糖85.2%，阿拉伯糖1.5%。7.分析条件的确定7.1水解用酸的确定分别选用2mol/L盐酸、lmol/L硫酸、2mol/L甲酸、2mol/L乙酸、2mol/L三氯乙酸和2mol/L三氟乙酸进行天麻多糖的水解实验。各次实验的多糖用量、水解温度、水解时间，酸加入量均相同。结果各这些酸均能水解多糖，但是甲酸、乙酸、三氯乙酸水解后样品中各多糖含量的检测结果明显比用其他酸低。盐酸的氯离子对HPLC系统有害，所以不宜用。三氟乙酸和硫酸的结果相当，但是三氟乙酸有毒，所以也不宜用。所以，最后确定水解用酸为lmol/L硫酸。7.2流动相中缓冲溶液的确定分别选用磷酸二氢钾水溶液_氢氧化钠、磷酸氢二钠_磷酸二氢钾、醋酸_醋酸钠水溶液、醋酸铵水溶液_醋酸、柠檬酸_柠檬酸钠水溶液等缓冲溶液与有机溶剂组成流动相，恒比例洗脱，其中有机溶剂为乙腈，比例为30%。结果使用用醋酸铵水溶液_醋酸时的分离效果比较好。7.3流动相中有机溶剂的确定分别选用甲醇、乙醇、乙腈与醋酸铵水溶液-醋酸缓冲溶液按照3070组成流动相，恒比例洗脱。结果使用乙腈时的分离效果比较好。7.4梯度洗脱的确定在恒比例洗脱条件下，各单糖分离度只达到0.81.0，不是很好，所以改用梯度洗脱。从030分钟，乙腈的比例从10%50%之间调整。结果按以下梯度洗脱，各单糖分离度能到1.5以上。乙腈缓冲溶液Omin208025min4060。权利要求一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于天麻多糖首先水解成为单糖，再经衍生化试剂衍生，之后进HPLC-UV系统检测，得到各个单糖的含量。2.根据权利要求1所述一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于本检测方法是检测天麻多糖中单糖的含量。3.根据权利要求1所述一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于天麻多糖水解为酸水解，所用的酸选盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸。4.根据权利要求1所述一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于高效液相检测系统所用色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。5.根据权利要求1所述一种检测天麻多糖中单糖组成的方法，其特征在于流动相为缓冲溶液与有机溶剂的混合液，其中有机溶剂的比例在10-50%之间。6.根据权利要求5所述色谱检测的流动相条件，其特征在于所用缓冲溶液由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液，缓冲溶液选自磷酸二氢钾水溶液_氢氧化钠、磷酸氢二钠_磷酸二氢钾、醋酸-醋酸钠水溶液、醋酸铵水溶液_醋酸、柠檬酸_柠檬酸钠水溶液。7.根据权利要求5所述色谱检测的流动相条件，其特征在于所用有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈。全文摘要本发明涉及一种检测天麻多糖中单糖组成的新方法。本发明公开了天麻多糖首先水解成为单糖，再经衍生化试剂衍生，之后进HPLC-UV系统检测，得到各个单糖的含量。本方法所用高效液相检测系统条件为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为按一定比例混合的缓冲溶液和有机溶剂，流速0.8～1.5ml/min，紫外或PDA检测器。本方法重复性好，灵敏度高，可以方便、准确的检测天麻多糖中单糖组成。文档编号G01N30/02GK101825611SQ201010157658公开日2010年9月8日申请日期2010年4月21日优先权日2010年4月21日发明者侯峰,卢平华,钱陈钦申请人:广州市和藤医药研究开发有限公司