专利名称：一种抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的筛选方法。
背景技术：
神经退行性疾病在人群中发病率逐年增加，神经退行性疾病多发于老年人群中，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease)即老年痴呆症、帕金森症(Parkinson’ s disease)等，患者会出现记忆功能减退，语言障碍，时间和空间定向力障碍，智力低下，思维 迟钝，计算力和判断力差，个性改变，生活和工作的主动性丧失等症状。尤其是老年痴呆症 已成为人类继心血管病、癌症、中风之后导致高死亡率的第四位疾病，其主要病理特征是脑 部出现β淀粉样蛋白沉积，造成细胞内神经原纤维缠结和细胞外老年斑。β淀粉样蛋白沉积的主要成分为β淀粉样蛋白，简称Αβ。Αβ多肽是淀粉样蛋 白前体APP(amyloid precursor protein)及前体类似物经β、Y分泌酶分解后的产物，是 由39-43个氨基酸残基组成的多肽。影响Αβ聚集的因素很多，包括ρΗ值，肽的长度，盐浓 度，金属离子等。过渡金属的代谢失衡可能是诱导Aβ沉积的重要原因，铜、铁、锌等金属离 子在大脑和体液之间进行了重新分配，这种失衡可能引起金属蛋白的缺失或过度表达，进 而导致疾病的产生，金属离子与老年痴呆症相关的淀粉样蛋白结合的位点位于Αβ多肽氮 端的16个氨基酸片段，因此，β -淀粉样蛋白1-16是研究与老年痴呆症相关的淀粉样蛋白 与金属离子作用的最小单元，参见生物化学杂志J. Biol. Chem.，2008，283，10784-10792。鉴于导致老年痴呆症的疾病蛋白的聚积一定程度上依赖于Cu2+离子的参与，在活 体内利用金属离子螯合剂螯合这些金属离子可以阻止Αβ的积聚和沉积，参见道尔顿会报 Dalton Trans.，2009，1080-1094。国内外目前主要工作集中在利用多种手段检测金属离子 存在下对相关蛋白聚集的加速作用，以及设计不同作用位点和作用机理的药物螯合金属离 子，或对已经形成的蛋白聚集体进行干预，使其溶解或阻止寡聚体蛋白继续聚集，避免产生 沉淀斑块，参见英国化学会评论，Chem. Soc. Rev.，2009，38，2698-2715。同时也有一些报道 利用疫苗使体内产生抗体，进而利用人体自身免疫机制清除已沉积蛋白。但一些疫苗带来 较严重的副反应，产生脑部其他疾病，如脑炎等。目前更好的抗病药物正在研究中，但往往 所需样品量大，需要大型仪器，昂贵的抗体，从而制约了药物筛选的进程。更重要的，可应用于细胞中的抑制剂类药物的发现和筛选的报道很少。发展一种 可高通量筛选抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的新方法对进一步了解老年痴呆症发病机理 和治疗老年痴呆症均有重要意义。由于无机纳米粒子，包括金，银，量子点等，具有特殊的物理和化学性质，近十年 来被广泛的应用于各种生物纳米技术和生物医学检测技术等领域，参见化学综述，Chem. Rev.，2004，104,293-346 ；化学综述，Chem. Rev.，2005，105，1547-1562，将要研究的生物分 子利用生物素一链霉亲和素反应耦合到纳米粒子表面，从而利用纳米粒子对其周围环境的 改变灵敏响应，监测其光谱或其他物理、化学性质的改变，提供了一种方便快捷，灵敏高效，可用于高通量地研究生物分子间相互作用或生物分子与相关研究对象之间联系的手段。目前未见将无机纳米粒子应用于抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的筛选的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的筛选方法，使用无机纳米粒子作为探针，将其耦合到β淀粉样蛋白上，在待测药物作用下测定无机纳米粒子紫 外可见光谱的变化。所述筛选方法操作简单，所需样品量少，识别灵敏度高，可以实现多种 药物的高通量筛选。作为优选，所述无机纳米粒子为金纳米粒子、银纳米离子或量子点。本发明所述β淀粉样蛋白包括β淀粉样蛋白单体、β淀粉样蛋白寡聚体及淀粉 样蛋白沉淀、淀粉样蛋白中的任一条或多条连续或不连续多肽片段。作为优选，所述无机纳米粒子通过链霉亲和素-生物素作用耦合到所述β淀粉样 蛋白上。本发明还提供在溶液中筛选抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的方法，具体包含以 下步骤步骤1 将生物素化的淀粉样蛋白与金属离子在溶液中孵育，形成生物素化的淀 粉样蛋白与金属离子的复合物；步骤2 将链霉亲和素耦合的金纳米粒子与所述生物素化的淀粉样蛋白与金属离 子的复合物在溶液中混合，加入待测药物，并设定不加待测药物的阴性对照；步骤3 测定步骤2所得混合溶液及其阴性对照的紫外可见光谱，并进行比较。本发明所述金属离子包括各种可以诱导淀粉样蛋白构象发生折叠、聚集、沉淀的 金属各种价态的离子，优选为Zn2+或Cu2+。在具体实施方式
中，本发明具体提供在溶液中筛选抑制β淀粉样蛋白沉积的药 物的方法，包括在水溶液中将链霉亲和素耦合的金纳米粒子和生物素耦合的淀粉样蛋白 与铜离子的复合物混合，30分钟后加入待筛选的抑制β淀粉样蛋白沉积的药物，并设定不 加药物的阴性对照，30分钟后测定混合溶液及阴性对照的紫外可见光谱并比较分析。本发明还提供在细胞上筛选抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的方法，具体包含以 下步骤步骤1 将生物素化的淀粉样蛋白与金属离子在溶液中孵育，形成生物素化的淀 粉样蛋白与金属离子的复合物；步骤2 将所述生物素化的淀粉样蛋白与金属离子的复合物加入到活的神经细胞 中进行培养；步骤3 加入待测药物继续培养，并设定不加待测药物的阴性对照；步骤4 去除细胞培养液，加入链霉亲和素耦合的金纳米粒子进行培养；步骤5 去除细胞培养液，测定其紫外可见光谱，并进行比较。作为优选，所述步骤5加入缓冲溶液悬浮进行测定。作为优选，所述金属离子终浓度为1-50 μ mol/1。作为优选，所述链霉亲和素耦合的金纳米粒子终浓度为2-lOnmol/l。作为优选，所述生物素化的淀粉样蛋白的终浓度为10-1000 μ g/ml。
由于铜离子可以诱导生物素耦合的淀粉样蛋白单体形成多聚体，每个多聚体上携 带的大量生物素分子可以与加入的链霉亲和素耦合的金纳米粒子上的链霉亲和素发生亲 和作用，使得分散态的金纳米粒子发生聚集，紫外可见光谱有明显变化。而在抑制β淀粉样蛋白沉积的药物存在的情况下，由于铜离子被络合或淀粉样 蛋白的沉积被抑制，使得淀粉样蛋白恢复或保持单体形式，加入的链霉亲和素耦合的金纳 米粒子恢复或保持分散态，紫外可见光谱恢复至或保持为金纳米粒子分散态形式的光谱。本发明以链霉亲和素耦合的金纳米粒子作为探针，利用了金纳米粒子对其周围环 境及其在溶液中的分散状态的灵敏响应，监测其溶液光谱改变，提供了 一种方便快捷，灵敏 高效的手段，来监测β淀粉样蛋白沉积抑制剂随浓度改变 的抑制效率，来筛选抑制β淀粉 样蛋白沉积的药物。在具体实施方式
中，本发明提供的链霉亲和素耦合的金纳米粒子的制备方法为13nm金纳米粒子的制备是应用经典的“Turkevich-Frens”方法，即用柠檬酸三钠 还原氯金酸。采用文献(塔兰塔Talanta，2010，80，1626-1631)的方法，将100微升多肽混 合液(CALNN与CALNNGK (biotin) G的摩尔比为9 1)与4. 8nmol柠檬酸钠-金纳米粒子 溶液混合，于室温下反应2小时，离心除去过量未反应多肽，再分散于1毫升去离子水中，加 入28. 56微升lmg/mL的链霉亲和素水溶液，于室温下反应1小时，离心两次除去过量未反 应的链霉亲和素，沉淀分散于PH 7. 4的lOmmol/L HEPES缓冲溶液中。本发明还提供一种用于筛选抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的组合物，包含链霉 亲和素耦合的无机纳米粒子、生物素化的淀粉样蛋白、金属离子。作为优选，所述金属离子为Zn2+或Cu2+。作为优选，所述无机纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子或量子点。在具体实施方式
中，本发明具体描述了在细胞上筛选抑制β淀粉样蛋白沉积的 药物的方法，包括将生物素耦合的淀粉样蛋白溶解于去离子水中，使其浓度为lmg/mL，然后取100 微升，加入9. 9毫升细胞培养基稀释至0. 01mg/mL ；在已培养有神经细胞的48孔细胞培养板的每孔中加入200微升用细胞培养液稀 释至0. 01mg/mL的生物素耦合的淀粉样蛋白，再加入lmmol/L的硫酸铜溶液，使铜离子终浓 度为 5ymol/L。在已培养有神经细胞的培养板，每孔加入200微升用细胞培养液稀释至0. Olmg/ HlL的生物素耦合的淀粉样蛋白，再加入硫酸铜溶液和待筛选的抑制β淀粉样蛋白沉积的 药物，并设定不加药物的阴性对照，12小时后，去除细胞培养液，加入链霉亲和素耦合的金 纳米粒子溶液，2小时后，去除培养板中链霉亲和素耦合的金纳米粒子溶液，加入lOmmol/L pH7. 4的HEPES缓冲溶液，在光学显微镜下观察抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的抑制效果。 再使神经细胞悬浮到溶液中，并测定混合溶液的紫外可见光谱。在细胞培养液中，铜离子在细胞培养液中将外加的老年痴呆症相关的生物素耦合 的淀粉样蛋白连接到神经细胞的细胞膜上，再加入链霉亲和素耦合的金纳米粒子时，金纳 米粒子上的链霉亲和素与生物素化的淀粉样蛋白上的生物素相互作用，使得链霉亲和素耦 合的金纳米粒子粘附到神经细胞的细胞膜表面，当β淀粉样蛋白沉积抑制剂加入时，将铜 离子络合，使得淀粉样蛋白不能粘附到神经细胞表面，从而使神经细胞的细胞膜周围聚集的金纳米粒子明显减少。利用光学显微镜可以观察β淀粉样蛋白沉积抑制剂的抑制效果。 利用紫外可见光谱可以定量考察β淀粉样蛋白沉积抑制剂的抑制率。本发明还提供了所述链霉亲和素耦合的金纳米粒子的制备方法，包括步骤1 将金纳米粒子与在氨基酸序列为CALNN的保护剂存在条件下和生物素化 的序列为CALNNGKG的多肽反应，得到生物素化的多肽耦合的金纳米粒子；步骤2 使链霉亲和素与步骤1所得生物素化的多肽耦合的金纳米粒子反应，得到 链霉亲和素耦合的金纳米粒子。所述氨基酸序列为CALNN的保护剂可稳定生物素化的多肽耦合的金纳米粒子，所 述生物素化的多肽序列为CALNNGK (biotin) G。步骤1优选反应后加入离心步骤除去多余的多肽。步骤2优选反应后加入离心步骤除去多余的链霉亲和素。作为优选，所述金纳米粒子为直径为IO-IOOhm的金纳米粒子。在具体实施方式
中，本发明用所述方法在溶液中对三种药物的抑制效果进行检 测，对于水溶液中含有1 μ mol/L的二价铜离子诱导的β淀粉样蛋白沉积，EDTA的IC5tl为 0. 970 μ mol/L, EGTA 的 IC5tl 为 0. 828 μ mol/L,组氨酸的 IC5tl 为 8. 048 μ mol/L。在细胞上的试验表明，当EDTA浓度达到细胞培养液中铜离子浓度0. 1倍，1倍， 10倍时，抑制率分别达到48. 68%,80. 73%，95. 37%。在EGTA浓度达到细胞培养液中铜 离子浓度0. 1倍，1倍，10倍时，抑制率分别达到45. 51%,68. 51%,98. 66%。在组氨酸浓 度达到细胞培养液中铜离子浓度0. 5倍，5倍，50倍时，抑制率分别达到30. 71%,67. 62%, 86. 60%。本发明将β淀粉样蛋白与金属离子混合形成淀粉样蛋白-金属离子复合体，利用 生物素-链霉亲和素反应，将链霉亲和素耦合的金纳米粒子与铜离子诱导的生物素化的β 淀粉样蛋白沉积相互作用，利用金属离子络合剂或可抑制β淀粉样蛋白沉积的药物存在 情况下，链霉亲和素耦合的金纳米粒子溶液紫外可见光谱的变化，实现抑制β淀粉样蛋白 沉积的药物的筛选，对于治疗老年痴呆症具有重要意义。利用本发明提供的方法进行抑制β淀粉样蛋白沉积的药物筛选，操作简单、检测 时间短，可以实现不同β淀粉样蛋白沉积抑制剂的抑制效果的定性区分和定量考察，同 时，本发明还提供在神经细胞体系中对不同β淀粉样蛋白沉积抑制剂的抑制效率的考察 的方法，在细胞水平考察药物的作用效果，为新药筛选提供了更为方便、快捷的途径。
图1为本发明所述方法的作用机理示意图；图2为用本发明所述方法检测不同浓度EDTA抑制β淀粉样蛋白沉积时金纳米粒 子的紫外可见光谱图；图3为用本发明所述方法检测不同浓度EGTA抑制β淀粉样蛋白沉积时金纳米粒 子的紫外可见光谱图；图4为用本发明所述方法检测不同浓度组氨酸抑制β淀粉样蛋白沉积时金纳米 粒子的紫外可见光谱图；图5示用本发明所述方法检测不同β淀粉样蛋白沉积抑制剂(EDTA、EGTA或组氨酸)抑制β淀粉样蛋白沉积时的抑制效果与抑制剂浓度关系；图6为在细胞培养液中加入抑制剂(EDTA、EGTA或组氨酸)共同孵育后在光学显 微镜下的细胞图像；图7为用本发明所述方法在细胞培养液中检测不同浓度EDTA抑制β淀粉样蛋白 沉积时金纳米粒子的紫外可见光谱图；a 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子，未加EDTA ；
b 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和0. 5 μ mol/L的EDTA ；c 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和5 μ mol/L的EDTA ；d 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和50 μ mol/L的EDTA ；e 细胞培养液未加铜离子也未加EDTA。图8为用本发明所述方法在细胞培养液中检测不同浓度EGTA抑制β淀粉样蛋白 沉积时金纳米粒子的紫外可见光谱图；a 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子，未加EGTA ；b 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和0. 5 μ mol/L的EGTA ；c 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和5 μ mol/L的EGTA ；d 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和50 μ mol/L的EGTA ；e 细胞培养液未加铜离子也未加EGTA。图9为用本发明所述方法在细胞培养液中检测不同浓度组氨酸抑制β淀粉样蛋 白沉积时金纳米粒子的紫外μ mol/L光谱图；a 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子，未加组氨酸；b 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和2. 5 μ mol/L的组氨酸；c 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和25 μ mol/L的组氨酸；d 细胞培养液加5 μ mol/L的铜离子和250 μ mol/L的组氨酸；e 细胞培养液未加铜离子也未加组氨酸。图10示本发明所述方法检测抑制剂(EDTA、EGTA或组氨酸)对金属离子诱导的β 淀粉样蛋白沉积的抑制率。
具体实施例方式本发明公开了一种筛选抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的方法，本领域技术人员 可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本 文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的筛选可抑制β淀粉样 蛋白沉积的药物的方法进行详细描述。实施例1按照以下步骤制备链霉亲和素耦合的金纳米粒子首先，制备直径13纳米的金纳米粒子(GNPs，直径为13纳米)13纳米的金纳米 粒子的制备是应用经典的“Turkevich-Frens”方法，即用柠檬酸三钠还原氯金酸。
然后制备链霉亲和素耦合的金纳米粒子采用文献(塔兰塔Talanta，2010，80， 1626-1631)的方法，将 100 微升 1. 38mmol/L 的多肽混合液(CALNN 与 CALNNGK (biotin) G 的 摩尔比为9 1)与1毫升4. Snmol的金纳米粒子溶液混合，于室温下反应2小时，离心除 去过量未反应多肽，再分散于1毫升去离子水中，加入28. 56微升lmg/mL链霉亲和素，于室 温下反应1小时，离心两次除去过量未反应的链霉亲和素，沉淀分散于lOmmol/L HEPES缓 冲溶液中(pH 7. 4)。实施例2按照以下步骤制备生物素耦合的淀粉样蛋白与铜离子的复合物溶液将生物素耦合的淀粉样蛋白(biotin-amyloidβ 1-16，即 GK(biotin)G DAEFR HDSGY EVHHQ K)溶解于去离子水中，使其浓度为0. lmg/mL，然后取1毫升，加入50mmol/L 的硫酸铜溶液1微升，使铜离子终浓度为50 μ mol/L, 37摄氏度恒温孵育72小时。实施例3按照以下步骤检测β淀粉样蛋白沉积抑制剂EDTA的抑制效果首先将实施例2中淀粉样蛋白与金属离子的复合物溶液稀释10倍，即取100微升 淀粉样蛋白与金属离子的复合物溶液加入900微升去离子水，使淀粉样蛋白溶液终浓度为 0. Olmg/mLo然后取9份40微升链霉亲和素耦合的金纳米粒子溶液(金纳米粒子浓度为 3nmol/l)与9份10微升上述稀释10倍后的淀粉样蛋白与金属离子的复合物溶液混勻， 30分钟后分别于9份混合溶液中加入1微升去离子水、1微升0. 5 μ mol/L、1微升5 μ mol/ L、1 微升 12. 5ymol/L、l 微升 25ymol/L、l 微升 37. 5ymol/L、l 微升 50ymol/L、l 微升 500 μ mol/L、1 微升 2. 5mmol/L 的 EDTA 水溶液，使 EDTA 终浓度分别为 0 μ mol/L,0. 01 μ mol/ L、0. 1 μ mol/L、0· 25 μ mol/L、0· 5 μ mol/L、0· 75 μ mol/L、1 μ mol/L、10 μ mol/L、50 μ mol/L。 将上述加入EDTA后的溶液混勻放置30分钟后，测定混合溶液的紫外可见光谱。结果参见图2和图5。图2中的曲线由右到左分别为没有加入β淀粉样蛋白沉 积抑制剂EDTA、含0. 01 μ mol/L EDTA的试剂混合液、含0. 1 μ mol/L EDTA的试剂混合液、 含0. 25 μ mol/L EDTA的试剂混合液、含0. 5 μ mol/LEDTA的试剂混合液、含0. 75 μ mol/L EDTA的试剂混合液、含1 μ mol/L EDTA的试剂混合液、含10 μ mol/L EDTA的试剂混合液、含 50 μ mol/L EDTA的试剂混合液、没有加入铜离子和EDTA的试剂混合液的紫外可见光谱图。由图可知，当EDTA浓度增加时，紫外可见光谱最大吸收峰朝低波长方向移动，这 意味着金纳米粒子在溶液中的状态由聚集趋于分散，由于金纳米粒子的聚集状态是铜离子 诱导的淀粉样蛋白的聚集态所导致，所以金纳米粒子在溶液中的状态由聚集趋于分散也就 意味着淀粉样蛋白抑制剂EDTA将铜离子螯合，使得被铜离子诱导的β淀粉样蛋白沉积趋 于单体状态；当混合溶液中EDTA浓度达到0. 5 μ mol/L时，紫外可见光谱开始发生偏移；随 着EDTA浓度的增加，紫外可见光谱的偏移程度更加明显；当浓度达到10 μ mol/L时，混合溶 液的紫外可见光谱与没有加入铜离子和EDTA的链霉亲和素耦合的金纳米粒子溶液光谱几 乎重合。参见图5，对于 EDTA，IC5Q(抑制率 50 % 时的浓度，half maximalinhibitory concentration)为0. 970 μ mol/L。IC50的计算方法紫外可见光谱代表分散态的近似峰值 527纳米处的吸光度与代表聚集态的波长650纳米处的吸光度比值对β淀粉样蛋白沉积抑制剂浓度作图，获得S形拟合曲线，S形拟合曲线上纵坐标一半处所对应的浓度即为IC50。 其具体作用机理参看图1。实施例4按照实施例3的步骤检测β淀粉样蛋白沉积抑制剂EGTA的抑制效果，参见图3 和图5，结果表明对于溶液中含有1 μ mol/L的二价铜离子诱导的β淀粉样蛋白沉积，EGTA 的 IC50 为 0. 828 μ mol/L。其具体作用机理参看图1。实施例5按照实施例3的步骤检测组氨酸的抑制效果，参见图4和图5，取9份40微升链 霉亲和素耦合的金纳米粒子溶液与9份10微升实施例2中稀释10倍后的淀粉样蛋白与 金属离子的复合物溶液混勻，30分钟后分别于9份混合溶液中加入1微升去离子水、1微 升 25 μ mol/L、1 微升 50 μ mol/L、1 微升 100 μ mol/L、1 微升 150 μ mol/L、1 微升 250 μ mol/ L、1微升500 μ mol/L、1微升1. 25mmol/L、1微升2. 5mmol/L的组氨酸水溶液，使组氨酸终 浓度分另丨J 为 0 μ mol/L、0. 5 μ mol/L、l μ mol/L、2 μ mol/L、3 μ mol/L、5 μ mol/L、10 μ mol/L、 25 μ mol/L、50 μ mol/L。将上述加入组氨酸后的溶液混勻放置30分钟后，测定混合溶液的 紫外可见光谱。结果参见图4和图5。结果表明对于溶液中含有1 μ mol/L的二价铜离子诱导的β淀粉样蛋白沉积，组 氨酸的 IC50 为 8. 048 μ mol/L。其具体作用机理参看图1。因此，本发明提供的检测方法可以有效而又方便地获得可应用于抑制与老年痴呆 症相关的β淀粉样蛋白沉积的药物的抑制效率，并可以获得可供参考的IC5tl值，后者不仅 可以直观地比较药物分子的作用效果，对于临床中药物筛选也有很大的指导意义。实施例6按照以下步骤在光学显微镜下检测神经细胞培养液中加入β淀粉样蛋白沉积抑 制剂的抑制效果首先，将神经细胞以每孔6000个细胞的密度培养于48孔细胞培养板中，在5% CO2, 37摄氏度环境下培养48小时；然后，将生物素耦合的淀粉样蛋白溶解于去离子水中，使其浓度为lmg/mL，然后取 100微升，加入9. 9毫升细胞培养液稀释至0. 01mg/mL ；接着，将48孔细胞培养板中的细胞培养液去除，每孔中加入200微升用细胞培养 液稀释至0. 01mg/mL的生物素耦合的淀粉样蛋白，再加入lmmol/L的硫酸铜溶液1微升， 使铜离子终浓度为5 μ mol/L,再在培养板的10个孔中分别加入1微升去离子水，1微升 100 μ mol/L EDTA、1 微升 lmmol/L EDTA、1 微升 10mmol/L EDTA, 1 微升 100 μ mol/L EGTA、 1 微升 lmmol/L EGTA, 1 微升 10mmol/L EGTA, 1 微升 500 μ mol/L 组氨酸、1 微升 5mmol/L 组 氨酸、1微升50mmol/L组氨酸水溶液，使细胞培养液中β淀粉样蛋白沉积抑制剂终浓度分别为 0 μ mol/L, 0. 5 μ mol/L、5 μ mol/L、50 μ mol/L EDTA,0. 5 μ mol/L、5 μ mol/L、50 μ mol/ LEGTA, 2. 5 μ mol/L、25 μ mol/L、250 μ mol/L 的组氨酸。在 5% CO2, 37 摄氏度环境下培养 12 小时；最后，12小时后，将培养液小心去除，加入150微升链霉亲和素耦合的金纳米粒子溶液(金纳米粒子浓度为2. 4nmol/l)，在5% CO2, 37摄氏度环境下培养2小时，将链霉亲 和素耦合的金纳米粒子溶液小心去除，加入100微升lOmmol/L的HEPES缓冲溶液(pH7. 4)， 通过光学显微镜观察培养板中的神经细胞。结果参见图6。结果显示，金纳米粒子集中在神经细胞的细胞膜周围，该位置呈现红色，随着β 淀粉样蛋白沉积抑制剂浓度的增加，神经细胞的细胞膜周围聚集的金纳米粒子量明显减 少。由于铜离子在细胞培养液中将外加的老年痴呆症相关的淀粉样蛋白连接到神经细胞的 细胞膜上，再加入链霉亲和素耦合的金纳米粒子时，金纳米粒子上耦合的链霉亲和素与生 物素化的淀粉样蛋白上的链霉亲和素相互作用，使得链霉亲和素耦合的金纳米粒子粘附到 神经细胞的细胞膜表面，当β淀粉样蛋白沉积抑制剂加入时，将铜离子络合，抑制淀粉样 蛋白的聚集，使淀粉样蛋白不能粘附到神经细胞表面，从而使神经细胞的细胞膜周围聚集 的金纳米粒子量明显减少。实施例6按照以下步骤利用紫外可见光谱检测神经细胞培养液中加入β淀粉样蛋白沉积 抑制剂EDTA的抑制效果按照实施例5的步骤，在与生物素耦合的淀粉样蛋白和铜离子以及β淀粉样蛋白 沉积抑制剂EDTA作用后的神经细胞中加入150微升链霉亲和素耦合的金纳米粒子溶液，在 5% CO2, 37摄氏度环境下培养2小时后，将链霉亲和素耦合的金纳米粒子溶液小心去除，用 lOmmol/L的HEPES溶液(pH 7.4)轻轻洗去没有附着在细胞上的金纳米粒子后，加入100微 升HEPES溶液，然后将粘附有链霉亲和素耦合的金纳米粒子的神经细胞吸取转移到96孔多 孔板中，测定所得溶液的紫外可见光谱，结果参见图7。将没有加入β淀粉样蛋白沉积抑制剂EDTA的溶液作为背景，以确定紫外可见光 谱信号最大值，认为抑制率为0 ；将没有加入铜离子的只有培养液与神经细胞共存的溶液 的紫外可见光谱作为信号最小值，认为抑制率为100 %。抑制率的计算方法抑制率=(|没有加入铜离子的光谱540纳米的吸光度值-加 入一定浓度抑制剂的光谱540纳米的吸光度值|)/(|没有加入铜离子的光谱540纳米的吸 光度值_没有加入抑制剂的光谱540纳米的吸光度值I)参见图7，随着β淀粉样蛋白沉积抑制剂EDTA浓度的增加，粘附有链霉亲和素耦 合的金纳米粒子的神经细胞的紫外可见光谱信号降低，趋于没有加入铜离子的神经细胞溶 液的紫外可见光谱信号，即趋于紫外可见光谱信号最小值，这意味着伴随β淀粉样蛋白沉 积抑制剂浓度的增加，链霉亲和素耦合的金纳米粒子在神经细胞表面的粘附量减少，即β 淀粉样蛋白沉积抑制剂抑制铜离子诱导的淀粉样蛋白的沉积过程。参见图10，在EDTA浓 度达到细胞培养液中铜离子浓度0. 1倍，1倍，10倍时，抑制率分别达到48. 68%,80. 73%, 95. 37%。实施例7按照实施例6的步骤利用紫外可见光谱检测神经细胞培养液中加入β淀粉样蛋 白沉积抑制剂EGTA的抑制效果参见图8，图10，在EGTA浓度达到细胞培养液中铜离子浓 度0. 1倍，1倍，10倍时，抑制率分别达到45. 51%,68. 51%,98. 66%0实施例8按照实施例6的步骤利用紫外可见光谱检测神经细胞培养液中加入β淀粉样蛋白沉积抑制剂组氨酸的抑制效果参见图9，图10，在组氨酸浓度达到细胞培养液中铜离子 浓度0. 5倍，5倍，50倍时，抑制率分别达到30. 71%, 67. 62 %,86. 60%o因此，本发明提供的检测方法可以在溶液和细胞培养液中方便而又直观地获得并 比较可应用于抑制与老年痴呆症相关的β淀粉样蛋白沉积的药物的抑制效果；进行可应 用于抑制与老年痴呆症相关的β淀粉样蛋白沉积的药物的筛选；同时可以对研究与老年 痴呆症相关的淀粉样蛋白的沉积过程和机理提供帮助。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行 若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权 利要求的保护范围内。
权利要求
抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的筛选方法，其特征在于，使用无机纳米粒子为探针，将其耦合到β淀粉样蛋白上，在待测药物作用下测定无机纳米粒子的紫外可见光谱的变化。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述无机纳米粒子为金纳米粒子、银 纳米粒子或量子点。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述0淀粉样蛋白为0淀粉样蛋白 单体、3淀粉样蛋白寡聚体、淀粉样蛋白沉淀、3淀粉样蛋白的任一条或多条连续或不连 续的多肽片段。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述无机纳米粒子通过链霉亲和 素-生物素作用耦合到所述0淀粉样蛋白表面。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，具体包含以下步骤步骤1 将生物素化的淀粉样蛋白与金属离子在溶液中孵育，形成生物素化的淀粉样 蛋白与金属离子的复合物；步骤2 将链霉亲和素耦合的金纳米粒子与所述生物素化的淀粉样蛋白与金属离子的 复合物在溶液中混合，加入待测药物，并设定不加待测药物的阴性对照；步骤3 测定步骤2所得混合溶液及其阴性对照的紫外可见光谱，并进行比较。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，具体包含以下步骤步骤1 将生物素化的淀粉样蛋白与金属离子在溶液中孵育，形成生物素化的淀粉样 蛋白与金属离子的复合物；步骤2 将所述生物素化的淀粉样蛋白与金属离子的复合物加入到活的神经细胞中进 行培养；步骤3 加入待测药物继续培养，并设定不加待测药物的阴性对照；步骤4 去除细胞培养液，加入链霉亲和素耦合的金纳米粒子进行培养；步骤5 去除细胞培养液，测定其紫外可见光谱，并进行比较。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤5去除细胞培养液后加入缓 冲溶液悬浮进行测定。
8.根据权利要求5或6所述的筛选方法，其特征在于，所述金属离子终浓度为 1-50 y mol/L
9.根据权利要求5或6所述的筛选方法，其特征在于，所述链霉亲和素耦合的金纳米粒 子终浓度为2-10nmol/l。
10.根据权利要求5或6所述的筛选方法，其特征在于，所述生物素化的淀粉样蛋白的 终浓度为 10-1000 ii g/ml。
11.根据权利要求5或6所述的筛选方法，其特征在于，所述链霉亲和素耦合的金纳米 粒子的制备方法为步骤1 将金纳米粒子与在氨基酸序列为CALNN的保护剂存在条件下和生物素化的序 列为CALNNGKG的多肽反应，得到生物素化的多肽耦合的金纳米粒子；步骤2 使链霉亲和素与步骤1所得生物素化的多肽耦合的金纳米粒子反应，得到链霉 亲和素耦合的金纳米粒子。
12.根据权利要求11所述的筛选方法，其特征在于，所述金纳米粒子为直径为10-100nm的金纳米粒子。
13.一种用于筛选抑制3淀粉样蛋白沉积的药物的组合物，包含链霉亲和素耦合的无 机纳米粒子、生物素化的淀粉样蛋白和金属离子。
14.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述金属离子为Zn2+或Cu2+。
15.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述无机纳米粒子为金纳米粒子、银 纳米粒子或量子点。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了以无机纳米粒子为探针，利用无机纳米粒子对其周围环境及其在溶液中的分散状态的灵敏响应，监测其溶液光谱改变，来筛选抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的方法。与现有技术相比，本发明提供的筛选方法操作简单，所需样品量少，识别灵敏度高，可以实现多种药物的高通量筛选，为新药筛选提供了一种方便快捷，灵敏高效的手段，具有广泛的应用前景。
文档编号G01N21/33GK101832919SQ20101016908
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者刘殿俊, 王承克, 王振新 申请人:中国科学院长春应用化学研究所