专利名称：乙型肝炎病毒核心抗体IgM的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM的检测试剂
品.O
背景技术：
乙肝病毒核心抗体有两种，一种为IgM抗体，出现在感染的早期，急性发作期阶段，消失得较快；另一种为IgG抗体，出现得较晚，消失得也慢，即使体内乙肝病毒被清除后，其抗体仍可持续数年，甚至终身阳性，这两种抗体分别由不同的B淋巴细胞分泌产生。 当人体受到核心抗原刺激后，先产生出HBc-IgM，它持续时间比较短，随后才逐渐分泌产生 HBc-IgG，后者能在体内保持较长时间，因此当机体HBc-IgM为阳性时，常表征为乙肝病毒近期感染。急性乙肝感染有两种情况，一种是真正的急性乙肝，另一种是慢性乙肝急性发作。慢性乙肝急性发作的病人血清中HBc-IgG水平较高，而HBc-IgM相对较低；真正的急性乙型肝炎病人，则HBc-IgM水平较高，而HBc-IgG往往为阴性或低水平。因此HBc-IgM即可作为乙型肝炎早期感染的辅助诊断指标，对病程的动态观察也有一定的辅助作用。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种检测乙型肝炎病毒核心抗体IgM的试剂盒。所述试剂盒特异性与灵敏度高，稳定性好，变异系数小于15 %。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM的检测试剂盒，包括(a)、抗人 IgM 抗体；(b)、酶标核心抗体；(C)、洗涤液；(d)、稀释液；(e)、包被液；(f)、封闭液；(g)、显色液；(h)、终止液；(i)、核心抗原；(j)、底物液。作为优选，本发明所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照以及对照品稀释液。作为优选，所述包被液为含Na2CO3 1. 59g/L、NaHC032. 93g/L 的 0. 05mol/L、pH 9. 6
碳酸盐缓冲液。作为优选，所述封闭液为含1 % BSA、8. Og/L NaCl,0. 2g/L KH2PO4,2. 9g/L Na2HPO4 · 12H20、0. 2g/L KCl、50g/L 蔗糖的 0. 01M、pH7. 4 磷酸盐缓冲液。作为优选，所述稀释液为含20 % BSA,8. Og/L NaCl,0. 2g/L KH2PO4,2. 9g/LNa2HPO4 ·12Η20、0. 2g/L KC1、0. 03%的 Proclin300，适量胭脂红的 0. 01M、pH7. 4 的磷酸盐缓冲液。作为优选，所述酶标核心抗体为辣根过氧化物酶标记的核心抗体。作为优选，所述显色液为含0. 40g/LTMB、1. 5g/L保护剂B的pH3. 0的柠檬酸磷酸
盐缓冲液。作为优选，所述底物液为含6. 084g/L NaH2PO4,21. 848g/LNa2HP04 · 12H20,0. 6585g/ L过氧化脲、0. 5734g/L保护剂A的混合溶液。作为优选，所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。作为优选，所述对照品稀释液为含8. 0g/LnaCl,0. 2g/L的KH2PO4,2. 9g/L的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g/L的KC13%牛血清白蛋白、pH为7.4的溶液。本发明应用双抗体夹心法原理，利用抗人IgM抗体制备包被板，利用乙型肝炎病毒核心抗原制备抗原溶液，利用辣根过氧化物酶标记乙型肝炎病毒核心抗体制备酶标抗体，通过免疫反应形成固相二抗-抗体-抗原-酶标抗体复合物，该复合物催化底物显色， 显色强度与乙型肝炎病毒核心抗体IgM的含量成正比，本产品可对人血清或血浆中的乙型肝炎病毒核心抗体IgM进行定性检测。本发明所述试剂盒适用于半自动或全自动板式酶标仪进行检测，具体使用过程如下a、包被、洗板将抗人IgM抗体加至酶联板孔内孵育过夜，采用洗涤液洗涤加样孔；b、封闭并加样每孔加封闭液孵育过夜，弃封闭液，吹干。在各孔中分别加入阴性对照、阳性对照以及待测样本，置37°C孵育；C、加酶在各孔加酶标抗体稀释液稀释的核心抗原、酶标核心抗体，空白对照孔不加，置37°C温育15-30分钟；d、洗板弃取各孔内液体，采用洗涤液洗涤加样孔；e、显色依次在各孔加底物液、显色剂，混勻，置室温18°C ；f、终止依次在各孔加终止液，混勻；g、测定用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的吸光度值(OD值)。本发明检测乙型肝炎病毒核心抗体IgM的试剂盒特异性与灵敏度高，稳定性好。 经灵敏度实验显示本发明所述试剂盒阳性符合率大于95% ；特异性试验显示本发明所述试剂盒阴性符合率大于95% ；精密性试验显示本发明所述试剂盒变异系数小于15%，具有广泛的应用前景。
具体实施例方式本发明公开了一种检测乙型肝炎病毒核心抗体IgM的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品以及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明实施例1 试剂盒的制备主要试剂的配方
(1)包被液0.05mol/L pH 9. 6碳酸盐缓冲液 Na2CO 31. 59g
NaHCO3 2. 93g H2O 1000ml
(2)封闭液1%BSA-0. OlM ρΗ7· 4磷酸盐缓冲液
NaCl
KH2PO4
Na2HPO4
KCl
BSA
H2O
蔗糖
12Η20
8. Og 0. 2g 2. 9g 0. 2g 10. OOg 1000ml 50克
(3)酶标记物稀释液20%牛血清-0.OlM pH7. 4磷酸盐缓冲液 NaCl 8.Og
KH2PO40. 2g
Na2HPO4 · 12H20 2. 9g KCl0. 2g
H2O800ml
20%牛血清200ml
Proclin3000.3ml
胭脂红适量
(4)对照品稀释液(pH= 7. 4) NaCl
KH2PO4
Na2HPO4 · 12H20
KCl
H2O
牛血清白蛋白
(5)底物液 NaH2PO4
Na2HPO4 · 12H20 过氧化脲保护剂A 蒸馏水
(6)显色剂 TMB
保护剂B
8. Og 0. 2g 2. 9g 0. 2g 1000ml 3%
6. 084g 21. 848g 0.6585g 0. 5734g 1000ml
0. 40g 1.5g
pH3. 0柠檬酸磷酸盐缓冲液IOOOml(7)终止液2mol/L H2SO4(8)抗人IgM抗体、核心抗原、酶标核心抗体(来源=Sigma公司)，经薄层层析和高效液相色谱分析比较，其RF值和峰形与标准抗人IgM抗体、核心抗原、核心抗体符合一致， 纯度> 98%。实施例2 用本发明所述试剂盒进行样品的检测实验准备1.从冷藏环境中取出试剂盒，将试剂盒置于室温条件(18_25°C )下至少平衡30 分钟。2.将浓缩洗液用纯化水按1 20比例稀释备用。3.将恒温箱或恒温水浴锅温度调到37°C，待温度稳定后使用。4.使用前样本用生理盐水做1 1000倍稀释，稀释后请立刻测定。检测过程1.包被将抗人IgM抗体至碳酸盐缓冲液中混勻，加至酶联板孔内，每孔100微升，孵育过夜，用含有吐温的磷酸盐缓冲液洗涤酶联板；2.封闭每孔加封闭液150微升，孵育过夜，弃封闭液，吹干。3.取出一定量的包被条，编号，留空白1孔，3孔加入阴性对照(50μ1/孔)，3孔加入阳性对照，其余板孔加入待测样本50μ 1，用板贴封版，置37°C孵育30分钟。4.洗液洗板6次(推荐使用洗板机)，最后在吸水纸上拍干。5.除空白孔外，每孔加入核心抗原溶液和酶结合物50 μ 1 (空白孔除外)，板贴封板，置37°C孵育30分钟。6.重复步骤2洗涤程序。7.每孔加入底物液、显色剂各50 μ 1 (或各1滴)，混勻，置37°C避光反应15分钟。8.每孔加入终止液50μ1(或1滴)，振荡混勻后，立即测定结果。9.测定结果时，用酶标仪450nm单波长检测，以空白孔调零测定各孔的吸光值；或直接采用450/(620-630) nm双波长测定各孔的吸光值，读数须在IOmin内完成。Cut off值=2. 1 X阴性对照孔平均值(阴性对照OD值低于0. 05，以0. 05计算； 高于0. 05，按照实际值计算)。试验有效性阳性对照OD值大于0. 8 ；阴性对照值小于0. 1。结果判定待测样本OD值彡cut off值时，判为阳性，否则为阴性。实施例3 本发明所述试剂盒的敏感性和特异性检验临床样品合计不少于1000份，其中包括HBV感染者样品和疑似感染者样品不少于350份，来自军事医学科学院微生物流行病研究所、中国人民武装警察部队总医院以及警河南总队医院。Hiv-l、HCV感染者样品各不少于50份，来自军事医学科学院微生物流行病研究所；HBV阴性的正常人群样品来自军事医学科学院微生物流行病研究所、中国人民武装警察部队总医院以及警河南总队医院；参比试剂盒乙型肝炎病毒核心抗体IgM诊断试剂盒(酶联免疫法)，上海科华生物工程股份有限公司产品。
第三方试剂盒乙型肝炎病毒核心抗体IgM诊断试剂盒(酶联免疫法)，北京科卫临床诊断试剂有限公司产品。整个临床研究工作具体流程如下a)用本发明所述试剂盒参照实施例2和参比试剂盒对样本进行检测，对检测结果不一致的样品，需用本发明所述试剂盒进行双份复试，以复试结果为最终结果。b)对本发明所述试剂盒和参比试剂盒检测结果不一致的样品利用第三方试剂盒进行检测。结果解释真阳性结果本发明所述试剂盒和参比试剂盒结果为阳性；或经确认实验证实结果为阳性。真阴性结果为本发明所述试剂盒和参比试剂盒结果为阴性；或经确认实验证实结果为阴性。假阴性结果为经本发明所述试剂盒检测结果为阴性，但其经确认实验检测为阳性。假阳性结果为经本发明所述试剂盒检测结果为阳性，但其经确认实验检测为阴性。经确证实验检测为不确定的结果将被剔除，不记入数据统计。剔除病例的数量将记录在总结报告中。统计分析a)本发明所述试剂盒和参比试剂盒的一致性采用spss软件，分析kappa值，评价本发明所述试剂盒和参比试剂盒的一致性，精密性试剂盒变异系数小于15%。b)本发明所述试剂盒的敏感性和特异性及其95% CI 敏感性真阳性/(真阳性+假阴性)X 100%特异性真阴性/(真阴性+假阳性)X 100%95% CI 计算公式:p士 1.96X [ρ (1-ρ)/η]1/2其中ρ为特异性或敏感性，η为样品数量，若ρ值为100%，则取ρ = 99. 99%进行分析。灵敏度阳性符合率大于95% ；特异性阴性符合率大于95%。c)考核试剂的阳性预期值(PPV)和阴性预期值(NPV)NPV =检测到的真阴性样品数量+ (真阴性样品数量+假阴性样品数量)；PPV =检测到的真阳性样品数量+ (真阳性样品数量+假阳性样品数量)；以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒核心抗体IgM的检测试剂盒，包括(a)、抗人IgM抗体；(b)、酶标核心抗体； (C)、洗涤液；(d)、稀释液；(e)、包被液；(f)、封闭液;(g)、显色液；(h)、终止液；(i)、核心抗原 (j)、底物液。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照、阳性对照以及对照品稀释液。
3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述包被液为含Na2CO3L59g/L、 NaHCO3 2. 93g/L 的 0. 05mol/L、pH 9. 6 碳酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含BSA、8.0g/L NaCl,0. 2g/L KH2PO4,2. 9g/L Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g/L KCl、50g/L 蔗糖的 0. 01Μ、ρΗ7· 4 磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含20%BSA、8. Og/L NaCl、0. 2g/L KH2PO4,2. 9g/L Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g/LKCl、0. 03%的Proclin300，适量胭脂红的0. 01M、ρΗ7· 4的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标核心抗体为辣根过氧化物酶标记的核心抗体。
7.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述显色液为含0.40g/LTMB、l. 5g/L 保护剂B的pH3. 0的柠檬酸磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述底物液为含6.084g/L NaH2PO4, 21. 848g/L Na2HPO4 · 12H20、0. 6585g/L 过氧化脲、0. 5734g/L 保护剂 A 的混合溶液。
9.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/LH2S04溶液。
10.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述对照品稀释液为含8.Og/L NaCl,0. 2g/L 的 KH2PO4,2. 9g/L 的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g/L 的 KCl 3%牛血清白蛋白、pH 为 7. 4的溶液。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒核心抗体IgM的试剂盒，包括抗人IgM抗体、酶标核心抗体、洗涤液、酶标记物稀释液、包被液、封闭液、显色液、终止液、核心抗原。经灵敏度实验显示本发明所述试剂盒阳性符合率大于95％；特异性试验显示本发明所述试剂盒阴性符合率大于95％；精密性试验显示本发明所述试剂盒变异系数小于15％，具有广泛的应用前景。
文档编号G01N33/576GK102243235SQ20101017189
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者蔺皓 申请人:中生方政生物技术有限公司