专利名称：Hepcidin作为铁稳态调节剂的用途的制作方法
HEPCIDIN作为铁稳态调节剂的用途本发明涉及铁稳态(iron homeostasis)疾病的诊断和治疗。铁是几乎每个有机体生长和生存所需的必需元素。在哺乳动物中，对铁平衡的调 节主要是在十二指肠对膳食中的铁吸收的水平。吸收后，三价铁被结合于循环中的转铁蛋 白并被转运到组织中，包括红系前体细胞，其中它被转铁蛋白受体介导的胞饮作用所摄取。 网状内皮吞噬细胞在从衰老红细胞的血红蛋白的降解再利用铁中起着主要作用，而肝细胞 含有有机体大多数的以铁蛋白聚合物形式的铁储存。在过去的五年里，从对造成严重铁障 碍的人类和小鼠的遗传性缺陷的研究中获得了关于参与铁吸收和铁稳态调节的蛋白的重 要信息(综述见ANDREWS，Nat. Rev. Genet.，1，208-217，2000)。对于铁缺乏，可以很好地 理解已确认的基因缺陷的病理生理结果，因为它们通常造成了直接参与铁吸收途径的蛋白 功能的缺失。这些蛋白包括铁转运蛋白DMTl (也称为Nramp2或DCT1) (FLEMING等，Nat. Genet. ,16,383-386,1997 ；GUNSHIN 等，Nature,388,482-488,1997), ferroportin(也称 为 IREGl 或 MTP1) (DONOVAN 等，Nature，403，776-781，2000)以及结合于 ferroportin 的铜 氧化酶，即铜蓝蛋白(HARRIS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，96，10812-10817，1999 ；Y0SHIDA 等，Nat. Genet.，9，267-272，1995)以及ha印hastin(VULPE等，Nat. Genet.，21，195-199， 1999)。相反，虽然一些与遗传性铁负荷过量相关的疾病已经鉴定出各种蛋白，但对于 它们在控制铁稳态上的功能作用仍了解的很少。在人类，遗传性血色病(hereditary hemochromatosis, HH)是一种常见的常染色体隐性遗传病，它是因为对膳食中的铁的过量 吸收而引起，造成了铁在血浆和多个器官的负荷过量，包括特别是胰腺、肝脏和皮肤，并因 为铁的沉积造成了对这些器官和组织的损伤。血色病的原因通常是HLA连锁的血色病基因(称为HFE)的突变，该基因定位于染 色体6p，且大多数患者是HFE的C282Y突变的纯合子(FEDER等，Nat. Genet.，13，399-408， 1996)。另外，不同的HH家系中也含有其他的突变位点在两个HH非HLA连锁的家系中已 经报告了 7p上转铁蛋白受体2基因(TFR3)的无义突变(CAMASCHELLA等，Nat. Genet.， 25，14-15，2000)以及最近将幼年性血色病的位点定位于染色体臂lq(HFE2)。最后，尽管已 经很长时间知道铁吸收的调节是反应于体内铁储备水平和红细胞生成所需要的铁量(R0Y 等，FEBS Lett.，484，271-274，2000)，但是仍然需要继续确定调控肠细胞调节铁吸收的信 号的分子本质。最近已经报告了小鼠编码转录因子USF2的基因断裂以及它对肝葡萄糖依赖的基 因调控的影响(VALLET 等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)。本发明人现在已经惊奇地观察到，Usf2-/-miCe出现了多内脏的铁负荷过量，在基 因敲除动物中只有脾脏的铁含量显著地低于对照组。这些铁代谢异常类似于在遗传性血色 病中所观察到的。然而，在这些病理变化中没有先前已鉴定的基因改变的参与，例如已经发 现的HFE或TFR2。因此，本发明人将来自Usf2-/_小鼠和野生型小鼠的肝脏进行抑制减数 杂交以寻找新的候选基因，这些基因可以解释在Usf2-/_小鼠中所发现的铁稳态异常。它 允许进行编码h印cidin肽的cDNA的分离。
最近从人血的超滤液和从尿中纯化到!fepCidin(也被称为LEAP-1，即肝表达 的抗微生物肽)，发现它是一种有着抗微生物活性的二硫键合的肽(disulfide-bonded peptide) (KRAUSE 等，FEBS Lett. ,480,147-150,2000 ；PARK 等，J. Biol. Chem.，276， 7806-7810,2001)。该蛋白在肝脏内以前肽(prop印tide)形式被合成，该前肽包括83个 氨基酸并被转化为有着20，22或25个氨基酸的成熟肽((PARK等，J. Biol. Chem.，276， 7806-7810，2001 ；PIGEON 等，J. Biol. Chem.，276，7811-7819，2001)。最近报道 hepcidin 在 试验性或自发性铁负荷过量小鼠的肝脏内被高水平合成(PIGEON等，J. Biol. Chem.，276， 7811-7819,2001)。尽管这种过度表达和铁负荷过量的关系仍有疑问，但是它提示这可能是 慢性铁负荷过量相关炎症的结果。相反，本发明人现在已经发现在Usf2-/_小鼠中h印cidin表达的完全缺乏导致了 进行性组织铁负荷过量。进一步的，他们已经获得了有着转基因的转基因小鼠，该转基因在 组合的肝特异性启动子的调控下表达h印cidin，并发现上述的转基因动物是严重贫血的。这些发现允许计划铁稳态调控的新方法，特别是通过调节肠道对膳食中的铁的摄 取，或调节经胎盘屏障的母胎铁转运，以及调节网状内皮巨噬细胞的铁的再循环。因此，本发明建议使用一种多肽，它包括20个氨基酸序列，并在2，5，6，8，9，14，17 和18位点有半胱氨酸，以及和以下序列有着至少50%相同性或60%相似性，优选的至少 60%相同性或至少70%相似性lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr(SEQ ID No.1)或使用一种编码上述多肽的核酸，以制备用于减少铁负荷过量的药物。根据本发明，使用的优选的多肽或核酸是人类hepcidin的成熟形式，例如有着 SEQ ID No. 1的20个氨基酸多肽，或有着以下序列的22个氨基酸多肽Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr(SEQ ID No.2)或者是有着以下序列的25个氨基酸多肽Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr(SEQ ID No. 3)或编码上述多肽的核酸。也可以使用上述h印cidin成熟形式的前体，也就是proh印cidin和 preprohepcidin及编码上述前体的核酸。根据本发明，其他适合使用的多肽或核酸的实例 是脊椎动物的，优选的是哺乳动物的、人类hepcidin成熟形式的同源物或它们的前体物、 或编码上述多肽的核酸。已知脊椎动物的人类h印cidin成熟形式的同源物，包括例如大鼠 hepcidin、小鼠 hepcidin，鱼尊 hepcidin。也可以使用包括h印cidin成熟形式的序列的嵌合多肽，以及最终，所有的所述 pro-或所述pr印ro-序列的部分。本发明也包括使用上述多肽的功能等价物。这里的功能等价物定义为肽异构体， 或其他有着与hepcidin成熟形式相同的功能活性的化合物。这些功能等价物的实施例包 括被塑造成模仿任何一种有着SEQ IDNo. 1,SEQ ID No. 2，或SEQ ID No. 3的多肽的三维结 构的化合物。特别注意到上述多肽的衍生物有着稳定性和生物半衰期的改善。这些衍生物的经典实例是例如“retro-inverso”肽，其中氨基酸序列是反向的，以及用D-氨基酸取代 L-氨基酸。所有的这些多肽和核酸都可以通过已知的经典方法获得。例如，可以从血浆或从 尿液中获得20个氨基酸和25个氨基酸形式的h印cidin，如KRAUSE等或PARK等所描述的。 同样的，可以通过培养表达h印cidin的细胞并从细胞培养物中收集上述多肽来获得。根据特别的实施方案，上述细胞是用编码上述的任何一种多肽的核酸转化的宿主 细胞。也可以使用化学合成，特别是对肽衍生物。例如可以利用能与编码hepcidin的核酸选择性杂交的合适引物从脊椎动物的基 因组或cDNA库中获得上述的核酸。也可以通过多核苷酸合成的经典技术获得核酸。本发明也提供了筛选能减少铁吸收的h印cidin的功能等价物的方法。例如，利用动物很容易筛选出有着hepcidin调节铁稳态的生物学功能的功能等 价物，特别是非人类的缺失hepcidin的哺乳动物，例如有着hepcidin表达缺失造成铁负荷 过量的基因敲除小鼠。具体而言，一种筛选能减少铁吸收的h印cidin的功能等价物的方法包括以下步 骤-将化合物施用于缺失hepcidin表达的基因敲除动物以测定其减少铁吸收的能 力；-确定上述化合物对上述动物的铁负荷过量的作用。根据本发明获得的药物可以有效地预防和/或治疗-所有形式的血色病；-继发性铁负荷过量，继发于例如遗传性和/或先天性贫血如地中海贫血；以及与此相关的疾病。后者的疾病包括例如肝癌、心肌病或糖尿病。根据另一方面，本发明也提供了 h印cidin表达或h印cidin活性的抑制剂在制备 用于通过增加肠道对膳食中的铁的摄取和/或增加巨噬细胞对铁的再利用来增加铁吸收 的药物中的用途。上述药物能用于治疗贫血或贫血相关疾病。这些疾病特别包括与在例如 感染或炎症状态下发生的急性或慢性疾病相关贫血，例如骨关节病如类风湿多关节炎或恶 性肿瘤，特别是与炎性综合征相关时。Hepcidin表达的抑制剂包括例如反义RNA或DNA分子、或核酶。Hepcidin活性的抑制剂包括例如抗h印cidin抗体，特别是直接对抗h印cidin成 熟形式的抗体。本发明也提供了筛选其他的hepcidin活性抑制剂的方法，例如用转基因动物，特 别是转基因非人类哺乳动物，例如有着表达h印cidin转基因的转基因小鼠，且上述表达在 上述动物中诱导贫血。例如，一种筛选能增加铁吸收的hepcidin活性抑制剂的方法包括以下步骤-将化合物施用于具有表达h印cidin的转基因的转基因动物以测定其通过抑制 hepcidin活性增加铁吸收的能力；-确定上述化合物对上述动物的贫血的作用。根据本发明获得的药物可以通过各种途径给药，这依赖于它们的特性。
例如，h印cidin多肽或它们的功能等价物，以及h印cidin抑制剂如抗h印cidin抗 体可以单独或与合适的载体或赋形剂混合后给药。它们可以全身或局部使用。优选的给药 途径是肠外途径，包括例如肌肉内、皮下、静脉内或腹腔内注射。也可以使用口服途径，条件是该药物是以适合口服给药的形式存在，能避免胃肠 的酶类以保护活性成分。如上所述，也可以使用核酸分子例如编码上述任一 h印cidin多肽的核酸，使得能 在治疗对象的细胞内表达上述多肽，或使用能转录为反义RNA的核酸以抑制治疗对象细胞 内h印cidin的表达。在这种情况下，通过经典的基因转移技术将上述核酸分子引入目标细胞内。典型地，上述核酸分子被放置在合适的启动子的转录控制之下。启动子的选择依 赖于药物的使用目的和/或目标器官或组织。因此可以选择任何一种组成型或诱导型的和 /或任何一种遍在的或组织特异性的启动子。因此获得的能直接转移入细胞的表达框可以是裸DNA，或放置于一合适的载体中， 例如病毒载体，如腺病毒载体。转移方法和/或载体的选择依赖于目标器官或组织，和/或需要的是否是短时间 的表达(暂时表达)或稳定表达。可以体外对取自治疗对象的细胞进行基因转移，然后将上述细胞重新移植入上述 对象中，或可以通过将核酸直接施用到上述对象内进行基因转移。本发明也提供了经遗传学修饰的非人类的动物，其中遗传学修饰造成h印cidin 表达的异常。本发明也包括生物学材料，例如来自上述遗传学修饰的动物的细胞、组织和器官。这特别包括不表达h印cidin的基因敲除动物，优选的基因敲除哺乳动物，以及特 别包括小鼠。Ifepcidin的表达缺失在上述动物中诱导了铁负荷过量。但不包括VALLET等 (J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)阐述的已知的敲除小鼠，其中编码转录因子USF2 的基因是失活的。可以通过完全或部分灭活h印cidin基因以获得本发明的基因敲除动物，上述灭 活造成hepcidin产物的缺失或其功能的缺失。H印cidin基因的灭活可以靶向-编码h印cidin的序列，造成上述蛋白产物的缺失，或其功能的缺失，和/或-至少一种控制h印cidin表达的调节序列，造成h印cidin产物的缺乏，或 h印cidin产量的急剧减少。本发明的有着hepcidin表达异常的其他遗传学修饰动物是有着表达hepcidin转 基因的转基因动物，优选的转基因哺乳动物，以及特别是转基因小鼠。合适的制备转基因或敲除动物的方法在本领域是熟知的，例如在H0GAN等编，小 鼠胚胎处理，第二版，冷泉港实验出版社，1994 ;C. PINKERT编，转基因动物技术，科学出版 社，1994 ；A. L. JOYNER编，基因打靶实践方法，牛津大学出版社，1995 ；G. M. M0NASTERSKY和 J.M. ROBL编，转基因动物科学的策略，ASM出版社，1995 ；Lee M. SILVER编，小鼠的遗传学 概念和应用，牛津大学出版社，1995。不表达功能性h印cidin的基因敲除动物，以及有着表达h印cidin的转基因的转基因动物可以被用作为研究铁稳态机制的模型。它们可以被同上所述的使用以筛选有着与 hepcidin在铁吸收上同样作用的化合物，或筛选能抑制hepcidin对铁吸收作用的化合物。本发明也提供了诊断性方法以确定是否铁吸收的异常和h印cidin的突变或不正 常的h印cidin的产生相关。例如本发明提供了 -一种检测不正常的h印cidin的产生是否造成了铁吸收异常的方法，其中上述方 法包括在取自有着上述异常的对象的生物学样品中确定hepcidin的量；-一种检测铁吸收异常是否与生产功能性h印cidin不正常的突变相关，其中上述 方法包括在来自有着上述异常的对象的核酸样品中测定hepcidin基因的突变。适合于测定h印cidin量的生物学样品包括例如血、尿、或羊水样品、或组织活检， 特别是肝活检或胎盘活检。适合于测定生产功能性h印cidin不正常的突变的核酸样品包括RNA、cDNA或基因 组 DNA。生物学样品中的h印cidin的量容易被熟知的方法所测定，例如，HPLC色谱法、质 量分光光度法、或利用抗hepcidin抗体的免疫测定。可以通过对先前从测试样品的DNA样本中分离得到的上述基因或它的部分基因 的测序，以及与从无铁稳态异常的一个或几个对象中获得的相应的野生型序列进行比较， 很容易测定h印cidin基因的突变。本发明将被以下的附加描述进一步地阐述，这些描述指的是实施例，它们阐述了 基因敲除动物的h印cidin产生缺失或转基因动物的h印cidin过量生成的作用。应当认识 到给定的这些实施例只是本发明的阐述的一种方式，并不构成对本发明的任何的限制。实施例1 :h印cidin表达缺失的基因敲除动物的特点材料和方法Usf2-/_小鼠的繁殖和基因分型以往已经描述了 Usf2 基因的裂解(VALLET 等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949， 1997)。突变的等位基因包括小鼠USF2基因的7号外显子的无启动子IRESiBgeo盒。所有 研究的小鼠有着混合的遗传学背景，包括来自C57BL/6和129/Sv株。用每公斤体重含有 280mg三价碳酸铁的标准的实验室小鼠食品(A03，UAR, France)喂养小鼠。在2. 5个月到 19个月杀死小鼠。利用单次PCR反应进行小鼠尾部DNA的基因分型以确定野生型(WT)和 USF2基因敲除等位基因。将基因组DNA(0.5-1 μ g)用于包含有3种引物的50 μ 1反应物 中野生型USF2等位基因用以下引物进行扩增-正向(退火于内含子6)GCGAAGCCCTGGGTTCAATC(SEQ ID No. 4)禾口-反向(退火于内含子7)GGGGTCCACCACTTCAAGAGG(SEQ ID No. 5)。用以下引物扩增基因敲除的USF2基因_ 正向GCGAAGCCCTGGGTTCAATC(SEQ ID No. 6)禾口-反向(退火于目标构建体的Neo选择标记物)
GAATTCTCTAGAGCGGCCGGAC(SEQ ID No. 7)按照以下进行PCR :37个循环(每个循环包括94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 40 秒)以及最初的变性步骤94°C 4分钟，和终末的延伸步骤72°C 5分钟，反应体系为20mM Tris-HCKpH 8. 4), 50mM KC1,0. 05% ff-I,2mM MgCl2, 5%甘油，0. 04%溴酚蓝，0. 2mM 各种 dNTP，0. 2μΜ每种引物，2单位Taq多聚酶(Gibco)。在含有溴乙锭的1.5_2.0%琼脂糖凝 胶上分析反应产物。发现该小鼠基因分型的PCR方法得到了与先前报道的Southern印迹 法相同的结果(VALLET 等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)。校正减数杂交(SSH)生成减数文库如前描述制备总RNA (CH0MCZYNSKI 和 SACCHI，Anal. Biochem.，162，156-159， 1987)。用寡(dT)纤维素(Boehringer Mannheim Biochemica)分离聚腺苷酸 RNA。根据 生产商对所有步骤的说明利用PCR-select cDNA减数试剂盒(Clontech)，在3个5月龄 的纯合子USF2缺失小鼠(“驱动物(driver) ”)的混合的肝RNA和1个5月龄的野生型小 鼠(“测试物(tester)")的肝RNA之间进行SSH。简要的，将14ng连接的测试物和420ng 非连接的驱动物cDNA，变性并重新退火。在减数杂交后，通过两轮PCR扩增Ιμ cDNA。利 用AdvanTAgeTM PCR克隆试剂盒(Clontech)将减数cDNA文库克隆于pT-Adv载体。在用 Advantage cDNA多聚酶混合物(Clontech)进行第二次PCR(15个循环)后，将减数的PCR cDNA混合物在72°C与1单位Taq DNA多聚酶(Gibco BRL)进一步孵育10分钟以使克隆效 率最大化，以及用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。利用Cell-Porator (Gibco BRL)通过电穿孔将连接混合物引入到Electromax细菌株DHlOB (Gibco BRL)中。将文库铺 板于22x 22cm的琼脂板，其中含有青霉素(100 μ g/ml) ,40 μ 1 X-gal (40mg/ml)及40 μ 1 IPTG(0. 1Μ)。将细菌在37°C中增长直到可见菌落，并保存在4°C直到能清楚地分别出蓝/ 白菌株。反向Northern高密度印迹和筛选收集总共400个菌落，重悬于30 μ 1水中，在100°C加热10分钟，然后在冰中放置 5分钟并离心5分钟。用3 μ 1清亮的上清液和以下的引物进行PCR _ 正向5，-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3，(SEQ ID No. 8)，和-反向5，-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3，(SEQ ID No. 9)。在Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia)上印迹 PCR 产物。用 32P_dCTP-标记的 双链 cDNA((RTS RadPrime DNA Labeling System, Gibco)将印迹在 72°C杂交过夜，如上 所述该双链cDNA用2 μ g来自野生型或Usf2-/-小鼠肝的多腺苷RNA合成。在68°C用2X SSC/0. 1 % SDS洗涤印迹4次20分钟，以及用0. 2X SSC/0. 1 % SDS洗涤印迹2次20分钟。逆转录和RT-PCR总共20 μ 1的2 μ g总RNA (或减数文库的polyA RNA)，以及0. 25mM每种dNTP， 200ng随机六核甘酸引物，20单位RNAsin (Promega)，IOmM DTT和200单位M-MLV逆转录酶 (Gibco)合成双链cDNA。在加热循环器中将RNA在70°C变性10分钟后，在42°C将反应进 行1小时，后将逆转录酶在96°C灭活6分钟。在反应终末，加入80 μ 1 IOmM Tris-HCl (ρΗ 8. 0)和 0. ImM EDTA (ρΗ 8. 0)。用 5 μ 1 逆转录酶反应混合物以及 50 μ 1 20mM Tris-HCl (ρΗ8. 4), 50mM KCl, 2mM MgCl2,0. 05% (v/v) W_l，0. 2mM 每种 dNTP，Ipmol 正向和反向特异性引 物(列下)，Ipmol正向和反向对照的β -actin引物和2单位Taq多聚酶(Gibco)进行PCR 扩增。PCR条件是25个循环，其中包括94°C变性20秒，50°C退火20秒，以及72°C引物延 伸20秒。PCR后，用电泳将扩增产物(171bp的HEPCl或HEPC2及250bp的β -actin)在 .5%琼脂糖凝胶上进行分离。
0093]引物序列如下
0094]*HEPC1
0095]_ 正向
0096]5，-CCTATCTCCATCAACAGATG-3，(SEQ ID No. 10)禾口
0097]-反向
0098]5，-AACAGATACCACACTGGGAA-3，(SEQ ID No. 11)；
0099]*HEPC2
0100]-正向
0101]5，-CCTATCTCCAGCAACAGATG-3，(SEQ ID No. 12)禾口
0102]-反向
0103]5，-AACAGATACCACAGGAGGGT-3，(SEQ ID No. 13)；
0104]* β -actin
0105]_ 正向
0106]5，-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3，(SEQ ID No. 14)and
0107]-反向
0108]5，-TTTGATGTCACGCACGATTT-3，(SEQ ID No. 15).
0109]用于扩增DMTl的引物如下
0110]*无IRE的DMTl异构体
0111]_ 正向
0112]5，-TCCTGGACTGTGGACGCT-3，(SEQ ID No. 16)禾口
0113]-反向
0114]5，-GGTGTTCAGAAGATAGAGTTCAGG-3，(SEQ ID No. 17)； * 有 IRE 的 DMTl -正向
5，-TGTTTGATTGCATTGGGTCTG-3，(SEQ ID No. 18)禾口 -反向
5，-CGCTCAGCAGGACTTTCGAG-3，(SEQ ID No. 19)；
0115]
0116]
0117]
0118]
0119]
0120]*14S标准化
-正向
5，-CAGGACCAAGACCCCTGGA-3，(SEQ ID No. 20)和
0123]_ 反向
0124]5，-ATCTTCATCCCAGAGCGA-3，(SEQ ID No. 21) Northern 印迹
用于扩增用于检测特异性mRNAs的探针的引物是
0121] 0122]
0125]
0126]
9
* 小鼠血色病(HFE) cDNA 的扩增(1080bp)-正向:5，-ATGAGCCTATCAGCTGGGCT-3，(SEQ ID No. 22)禾口-反向5，-TCACTCACAGTCTGTTAAGA-3，(SEQ ID No. 23)；*小鼠转铁蛋白受体(TfR) cDNA的扩增(285bp)-正向:5，-GAAATCCCTGTCTGTTATAC-3，(SEQ ID No. 24)禾口_ 反向:5，-GGCAAAGCTGAAAGCATTTC-3，(SEQ ID No. 25)；*小鼠转铁蛋白2 (TFR2) cDNA的扩增(333bp)-正向:5，-TACAGCTCGGAGCGGAACG-3，(SEQ ID No. 26)禾口-反向5，-TTACAATCTCAGGCACCTCC-3，(SEQ ID No. 27)；*小鼠铜蓝蛋白cDNA的扩增(350bp)-正向5，-ACTTATTTCAGTTGACACGG-3，(SEQ ID No. 28)禾口-反向5，-GCAGCACATACACATACTGT-3，(SEQ ID No. 29)；*小鼠血色素加氧酶1 (Hmoxl) cDNA的扩增(258 bp)-正向:5，-ATGGAGCGTCCACAGCCCG-3，(SEQ ID No. 30)禾口-反向:5，-CCTTCGGTGCAGCTCCTCAG-3，(SEQ ID No. 31)。利用Taq聚合酶和肝总cDNA扩增每个片段，及用琼脂糖凝胶纯化(QIAquick PCR 纯化试剂盒，Qiagen)，并将它克隆于TA载体(AdvanTAge克隆试剂盒，Clontech)。根据方 案选择重组质粒并在含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中扩增和纯化(QIApr印Spin Minipr印，Qiagen)。用EcoRI降解后，将每种cDNA从载体中纯化出来，并在琼脂糖凝胶上 跑带。用于检测HEPClmRNA的探针是制备于抑制减数杂交分离的pT-Adv/HEPCl的EcoRI降 解物。将每种来源的20微克RNA在含福尔马林的缓冲液中变性，并在1 %琼脂糖，2. 2M福 尔马林凝胶中进行电泳。按以往描述的方法(VALLET等，J.Biol. Chem.，272，21944-21949， 1997)进行Northern印迹。将每个条带剥离，并用核糖体18S cDNA重新探试以核查获得 RNAs的完整性和数量。Southern ￡口迹按以往描述的方法(VALLET等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)进行 Southern印迹。用以下的引物扩增1437碱基对的小鼠基因组DNA片段以制备HEPCl探针。_ 正向:5，-GAGCAGCACCACCTATCTCCA-3，(SEQ ID No. 32)禾口
_ 反向:5，-AACAGATACCACAGGAGGGT-3，(SEQ ID No. 33)。用PvuII降解后，从琼脂糖凝胶中纯化出545碱基对片段并将其用作为Southern 印迹的探针。该HEPCl显示出了与同源的HEPC2区域的95%相同性。小鼠的血液学分析在杀死小鼠之前，通过眶后静脉切开取血，并收集在肝素化管(capiject T-MLH， Temmo 医药公司)中。用MaxM coulter自动分析仪测定血细胞数目和红细胞参数。铁的测定和组织学按以往Torrance 和 Bothwell (1968)描述的，利用 IL 实验 (Instrumentation Laboratory)进行部分或整个组织的铁水平的定量化。对于组织学，利用标准方法将组织固 定在4%福尔马林中，石腊包埋，放置于玻片上，普鲁士蓝染色以及核红复染。MMUsf2-/_小鼠肝脏和胰腺的大量铁负荷过量所有的Usf2-/_小鼠在三个月后都表现出了肝脏致密的褐色色素沉着以及胰腺 较多或较少的显著的青铜色色素沉着。这个表型性状是血色病的特点，是铁吸收异常的遗 传性疾病。我们决定分析Usf2-/_小鼠的铁状况。首先是评价铁累积的水平，对保持标准 饮食的野生型和Usf2-/_小鼠的肝脏和胰腺进行Perls’普鲁士蓝染色。结果显示在
图1(A到D)图例肝脏切片来自(A)8个月大的野生型小鼠(χ 50) ； (B) 8个月大的Usf2-/_同 窝出生的小鼠；(C) 19个月大的Usf2-/_小鼠(xlO)。(D)中的胰腺切片来自8个月大的 Usf2-/_小鼠(xl2，5)。C中的箭头指的是肝细胞核中的铁。D中的箭头指的是整个外分泌 组织中散在的胰岛(islet of Langerhans)。对照小鼠肝中显示出很少量的或没有阳性的铁染色(图1A)，而Usf2-/-小鼠肝细 胞中显示出铁的聚集(图1B-C)。这种铁的沉积主要于门脉周围的肝细胞以及被染色的肝 细胞数目随着年龄增加而增加。到了 19个月的年龄，如图IC所示，铁的累积是相当多的，而 且整个肝实质被均勻染色。此外，在一些肝细胞(图1B)上检测到核中严重的铁累积。对 于胰腺，得到了相似的结果，也就是，对照组织中没有染色，而在Usf2-/_小鼠(图1D)的外 分泌胰腺中有着严重的铁累积。为了更准确地定量动物生命中的铁负荷过量，测定了从2. 5到19个月年龄小鼠的 肝脏和胰腺的铁的水平。结果显示于图1(E和F)图例在对照组(野生型和杂合子小鼠，▲)和Usf2-/_小鼠(□)中测定了年龄 相关的肝的(E)和胰腺的(F)非血色素铁浓度(每克干组织的铁的微克数)。如图IE所示，铁累积在出生后60和100天之间的小鼠肝中，并达到一平台，几乎 是野生小鼠铁浓度的10倍。在胰腺(图1F)中，铁的累积更为严重，Usf2-/_小鼠的铁水 平比野生型小鼠最大高20倍。也测定了肾脏和心脏的铁的聚集，它们相应有着2倍和4倍 的累积。最后，发现与对照小鼠比较，Usf2-/_小鼠的血清有着1.7倍高的铁水平(对照组 3. 550士259 μ g 铁/1 [η = 15]对Usf2_/_ 小鼠 6. 274士514 μ g 铁/1 [η = 13]Ρ < 0. 0001)， 但是这种增加没有显示出年龄相关性。Usf2-/_小鼠血清铁水平的增加与1.6倍增加的转铁蛋白饱和度(对照组1 士9%饱和度[η = 6]对Usf2-/_小鼠95士9%饱和度[η = 6]P < 0.0004)相关。最后，在直到目前为止分析最老的雌性小鼠中(19个月)，铁负荷过量是 弥漫性的，测定的所有组织包括肌肉，子宫，肺和垂体(没有显示)都有着铁水平的增加。Usf 2-/-小鼠脾脏可抵抗自然的铁沉积结果显示在图2:图2的图例(A)在对照组(野生型和杂合子小鼠，▲)和Usf2-/_小鼠(口)中测定了年龄相 关的脾的非血色素铁浓度(每克干组织的铁的微克数)。脾的切片来自代表性的(B)8个 月大的野生型小鼠(x20)和(C)8个月大的Usf2-/_同窝出生的小鼠(x20)，用Perl’染色 铁。RP，红髓；WP，白髓。与所有其他测试的组织不同，在野生型小鼠的脾中观察到年龄相关的铁的累积， 如示(图2A)。观察到与Perls’普鲁士蓝染色呈阳性反应的颗粒，它们主要分布在红髓的细胞之 间(图2B)。我们发现这种累积在小鼠之间有着很大的差异，提示它可能依赖于每个动物 的杂种品系背景(129/Sv χ C57BL/6)。在C57BL/6小鼠中以往已经报道了这种自然的铁 储存，并发现主要发生在脾的巨噬细胞(VENINGA等，Lab. Anim.，23，16-20，1989)。奇怪的 是，在Usf2-/_小鼠的脾中，铁的水平仍是非常低的(图2A)，以及完全没有Perls’普鲁士 蓝染色(图2C)。Usf2-/_小鼠的红细胞参数不受影响为了除外Usf2-/_小鼠的铁累积的增加可能是因为红细胞生成障碍性贫血的可 能，测定了不同年龄的对照和Usf2-/_小鼠的红细胞参数。红细胞数目值(RBC，106/ml)， 血红蛋白浓度(Hb，g/dl)和平均红细胞体积(MCB，fl)都是正常的RBC，Hb和MCB相应地 分别为野生型 10. 3士0. 3，16. 73士0. 49 和 48. 27士0. 67 (η = 3) ；Usf2_/_ 小鼠 10. 0士0. 3， 15. 67 士 0. 06 和 48. 63 士 1. 36 (η = 3)。因此，有意思的是，在Usf2-/_小鼠中观察到的铁的异常，包括脾脏对铁累积的抵 抗和正常的血液学参数，明显地类似于HFE-/-小鼠的表型(LEVY等，Blood，94，9-ll，1999 ； ZHOU 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95，2492-2497，1998)，一种遗传性血色病的小鼠模型。Usf2-/-肝的HFE和TFR2基因的表达没有改变因此USF2是转录因子，因此检测了 USF2是否参与了编码铁代谢相关蛋白的基因 的调节。因为HFE-/-小鼠和Usf2-/_模型的相似性，首先测定了 HFE基因的表达。同时 也关注了编码转铁蛋白受体_2的基因，最近报道在HH中存在它的突变(CAMASCHELLA等， Nat. Genet.，25，14-15，2000)。结果显示在图3。图3的图例将20微克来自野生型小鼠和Usf 2-/-小鼠(从3到11个月大)的总的肝RNAs进 行电泳并印迹。用32P标记的HFE㈧和RTf2(B)的探针(PCR制成，如材料和方法中所述) 杂交印迹。如图3A的Northern印迹所述，Usf2_/_小鼠肝的HFE mRNA丰度与野生型小鼠的 丰度相当。与野生型小鼠比较，Northern印迹分析也表明Usf2-/_小鼠肝的RTf2基因的表达也没有改变(图3B)。也测定了 Usf2-/-小鼠的铜蓝蛋白、血色素加氧酶I和转铁蛋白受体mRNA水平， 因为已经报道在破坏铁平衡的疾病中这些mRNA丰度有所改变(综述见ANDREWS等，Nutr. Rev.，57，114-123，1999)。再次发现Usf2_/_小鼠的这些mRNA水平与对照小鼠是相似的。最后，分析了 DMTl基因(也称为Nramp2)的表达，一种主要的跨膜铁摄取蛋白，它 主动地将还原的膳食中的铁转运到肠的肠细胞中。利用RT-PCR (7Usf2-/-对6对照小鼠)， 通过半定量分析了十二指肠的DMTl基因的表达。在两组小鼠之间没有发现显著的统计学 差异(没有显示)。减数cDNA文库分析确证h印cidin为血色病假定的候选基因为了确定出Usf2-/_小鼠中表达水平被改变的基因，建立了 Usf2-/_(驱动者)和 野生型(测试者)小鼠肝之间的减数cDNA文库(DIATCHENKO, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,6025-6030,1996)。在分析的400个克隆中，利用反向Northern印迹(没有显示)分析 发现Usf2-/_小鼠肝的一些克隆被下调。这些克隆中的一个克隆含有编码最近认识的肽 h印cidin的全长cDNA(KRAUSE等，FEBS Lett.，480，147-150，2000 ；PARK 等，J. Biol. Chem.， 276，7806-7810，2001 ；PIGEON 等，J. Biol. Chem.，276，7811-7819，2001)。小鼠Usf2和h印cidin基因在第7号染色体上的组合小鼠基因组含有两个紧密相关的hepcidin基因，它们共同定位于相同的小鼠 基因组克隆(Genbank clone, accession number AC020841)。这两个基因被 PIGEON 等 (J. Biol. Chem.，276，7811-7819，2001)称为 HEPCl 和 HEPC2。有趣的是，基因组 CT7-8N15 克隆也发现HEPCl基因在小鼠第7号染色体上的位置与Usf2基因位置非常接近。PIGEON 等报告HEPCl是直接定位于Usf2基因的下游(PIGEON等，J. Biol. Chem.，276，7811-7819， 2001)。通过分析另一个基因组克隆，RP23-22G9 (Genbank，accession number AC087143)发 现Usf2基因的部分(包括外显子8，9和10)也是重复的，事实上，HEPCl位于缩短的Usf2 基因的下游。Usf2和h印cidin基因的基因组组合显示在图4中。图4的图例基因位点区域的图示(没有标尺)包括Usf2和h印cidin基因。靶等位基因表示 为插入外显子 7 的 betageo 盒(VALLET 等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)。数据 来自基因组RP23-22G9克隆(基因库)。至今为止，没有得到关于两个h印cidin基因之间 的定位和距离的数据。图右侧的Southern印迹来自用BglII降解和用HEPCl探针杂交的 野生型、杂合子和纯合子小鼠的尾部DNA。无论基因表型如何，都发现了两条预期大小的条 带，12. 4千碱基对和5. 1千碱基对。用USF2探针发现了相同的条带。HEPC2基因定位了功能完全的Usf2基因的下游，而HEPCl位于部分Usf2基因的下 游。目前，没有得到关于HEPCl和HEPC2的5，-3，的相对定位和两者之间距离的信息。因为Usf2基因和h印cidin基因位置相近，因此验证目标Usf2等位基因的外显子 7的重组事件是否可以剔除或缩短HEPCl和HEPC2基因。为了证实这个假说，利用HEPCl探 针(图4)对来自野生型，Usf2+/_或Usf2-/_小鼠的基因组尾部DNA进行Southern印迹。 用BglII降解基因组DNA。依照对AC087143位点的分析，预计该降解能生成两个5. 1和12. 4 千碱基对片段，它们相应地含有HEPCl和HEPC2基因。因为HEPCl和HEPC2杂交区域之间的紧密相似性(大于95% )，预计HEPCl探针都能发现这两条带。结果如图4中Southern 印迹所示。从来自Usf2-/_小鼠的DNA中观察到了同样的结果，这提示h印cidin基因存在 于Usf2-/_小鼠中并且它们没有进行大的重组。最后，该两条带也和从外显子8延伸到外 显子10的USF2探针杂交，说明USF2的外显子8到10的确是重复的。Hepcidin基因在Usf2-/_小鼠肝中是完全沉默的用Northern印迹分析测定h印cidin基因的表达水平。事实上，在Usf2-/_小鼠 肝中完全不能测到h印cidin mRNA(图5A)。值得注意的是，与野生型小鼠比较，Usf2+/_小 鼠肝含有较少的h印cidin mRNA。为了进一步评价HEPCl和HEPC2信使的特异水平，设计 了 HEPCl和HEPC2转录的特异引物。通过RT-PCR证实，两个基因在野生型小鼠肝中都被活 跃地转录(图5B-C)，而在Usf2-/_小鼠肝中完全缺失HEPCl和HEPC2基因的转录物(图 5B-C)。图5的图例(A) 20微克来自野生型，Usf2+/-和Usf2-/_动物(3个月和11个月大之间)的总 肝RNAs被电泳和印迹化。用32P标记的HEPC探针(按“材料和方法”描述的制备)杂交 印迹，该探针最主要识别HEPCl和HEPC2转录物。(B)按材料和方法所描述的RT-PCR测定 特异的HEPCl和HEPC2水平。PCR后，将扩增产物(171碱基对对HEPCl或HEPC2，及250碱 基对对β-actin)在1. 5%琼脂糖凝胶上用电泳分离。HEPCl或HEPC2的特异引物都不能 重新扩增HEPC2和HEPCl产物，相应的，说明每对引物的高特异性(没有显示)。HFE敲除小鼠和Usf 2-/_h印cidin缺失小鼠之间的铁代谢改变的相似性提示 h印cidin可能作用于和HFE相同的调节途径。已经发现HFE主要和十二指肠粘膜的隐窝细 胞的转铁蛋白受体相互作用(WAHEED 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96,1579-1584，1999)。 不被该理论所约束，可以假设这种相互作用调节了这些细胞内铁的水平，这反过来调节了 微绒毛顶部成熟细胞的顶端和基侧的转运蛋白(transporter)的表达。H印cidin可能通 过与HFE/beta2微球蛋白/转铁蛋白受体复合物的直接相互作用而影响HFE活性。相同 地，hepcidin可能调节巨噬细胞内的铁储存。根据图6的模型所示，成熟HFE蛋白的存在 和h印cidin表达的完全缺失可以造成肠道铁吸收的增加和巨噬细胞铁储存的减少。在该模型中，h印cidin通过减少肠道细胞对铁的转运和通过促进巨噬细胞储存铁 而预防铁的负荷过量。在Usf2-/_小鼠，h印cidin的缺失可以造成肠道铁转运的增加和巨 噬细胞铁储存的减少。在这两种情况下，血浆铁克服了转铁蛋白饱和度，非转铁蛋白结合的铁聚集于不 同的组织，包括心脏和胰腺。依照h印cidin在铁稳态的预期作用，hepcidin的产生可能依赖于肝细胞的TFR2 介导的转铁蛋白结合铁的摄取。这可以解释为什么TFR2缺失造成了一种人遗传性血色病， 如果这种缺失导致了 h印cidin分泌的减少，这反过来造成铁吸收的增加。通过测定TFR2 缺失患者或TFR2敲除小鼠血浆的h印cidin可以验证这种假说。实施例2 过度表达h印cidin的转基因小鼠的特点转基因小鼠的生产用以下引物扩增小鼠的h印cl cDNA的全长cDNA:
5' -GGGGGATATCAGGCCTCTGCACAGCAGAACAGAAGG-3' (SEQ ID No. 34)和5' -GGGGGATATCAGGCCTCTATGTTTTGCAACAGATACC-3' (SEQID No. 35)。两个引物都包含StuI位点(下划线部分)。将h印clPCR片段引入到小鼠甲状腺转运蛋白(TTR)启动子(包括第一外显子，第 一内含子和第二外显子的绝大多数)和SV40小-Tpoly (A)信号框之间。该构建体携带有3 千碱基对的5，连接于帽位点的小鼠TTR DNA序列(YAN等，EMBO J.，9，869-879，1990)。通 过降解将4. 7千碱基对TTR-hepcl转基因从质粒序列中分离出来并用于生殖核的微注射。PCR及Southern印迹的基因分型根据标准方法进行Southern印迹(SAMBR00K等，分子克隆，实验手册，第二版，冷 泉港实验出版社1989)。从尾部制备基因组DNA如下从每只小鼠上切下一段5毫米长的 尾巴，并放置于 500 μ 1 降解混合物中(50mM Tris, pH 8/100mM EDTA/IOOmM NaCl/l%SDS) 加入蛋白酶K(200yg)并在55°C降解过夜。加入500 μ 1苯酚/氯仿/异表乙醇(1/24/25) 直接萃取样品。涡旋和离心后，用等体积的异丙醇沉淀清亮的水相。对于southern印迹， 用BamHI降解DNA，该BamHI切割转基因两次。电泳后，将DNA转移到尼龙膜上(Hybond-N+， Amersham)。探针针对于来自以往描述的TTR质粒的1. 7千碱基对Bglll-HindIII片段 (YAN等，EMBO J.，9，869-878，1990)。利用商业可获得的试剂盒(DNA标记系统，Gibco)和 dCTP32P的随机引物标记探针。5. 3千碱基对标记的片段对应于内源的TTR基因，而4. 7千 碱基对标记的片段对应于转基因。对于PCR反应，将基因组DNA (0. 5-1 μ g)用于25μ 1反应物，该反应物包括两种引 物利用引物扩增TTR-h印cl转基因-5' -CTTTTTGCACCATGCACCTTTC-3 ‘ (SEQ ID No. 36 ；退火于 TTR 的第一内含子) 和-5' -AACAGATACCACACTGGGAA-3 ‘ (SEQ ID No. 37 ；退火于 h印cl cDNA)。如下进行PCR反应25个循环(每个循环包括94°C 40秒，50°C 40秒及72°C 40 秒)和94°C初始变性步骤4分钟及72°C终末延伸步骤5分钟，反应含有20mM Tris-HCl (pH 8.4)，50mM KC1,0. 05% ff-I,2mM MgCl2,0. 2mM 每种 dNTP，0· 2 μ M 每种引物，2 单位 Taq 聚合 酶(Gibco)。用相同大小的非特异片段扩增612碱基对特异性产物。用10单位StuI降解 PCR产物2个小时产生268碱基对和344碱基对片段后提示转基因的存在。在含有溴化乙 锭的1.5-2%琼脂糖凝胶上分析反应物。非特异片段的扩增确认转基因的缺失不能归结于 基因组DNA的缺失或降解。发现用于小鼠基因分型的该PCR方法给出了和Southern印迹 法一样的结果。MMTTR-h印Cl转基因小鼠的特点总共9只独立的转基因首建小鼠(transgenic founder mice)都用经典的线性构 建体的微注射方法生成。图7A图示了该构建体。图7B显示了不同首建小鼠的Southern印迹。三只转基因首建小鼠(TH27，TH37和TH52)与它们的野生型同窝生小鼠无区别。 三只转基因首建小鼠在出生时皮肤苍白并在出生后几个小时内死亡(bb2，3和5)。最后，剩
15余的三只转基因首建小鼠的表型是显而易见的(TH5，35，和44)它们全身无毛以及皮肤是 皱褶的)。在这些动物上进行血涂片，在有着皱褶皮肤的三只小鼠上发现了严重的异形红细 胞(poikylocytosis)和低血红蛋白的证据。 上述实施例突出表明了 hepcidin做为铁稳态的关键调节物的作用。预计 hepcidin是一种新的候选基因，当它突变时，能参与铁代谢的异常调节和HH的发生。最后， 上述的新的铁负荷过量疾病的小鼠模型表明是一种测试预防和纠正HH的铁储存的新的治 疗方法以及了解铁稳态的合适的动物模型。
权利要求
一种包含在第2，5，6，8，9，14，17和18位具有半胱氨酸残基的具有20个氨基酸、并与SEQ ID No.1具有至少50％的相同性或60％的相似性、优选地至少60％的相同性或至少70％的相似性的序列的多肽在制备用于减少铁负荷过量的药物中的用途。
2.hepcidin表达或h印cidin活性的抑制剂在制备用于增加铁吸收的药物中的用途。
3.权利要求2的用途，其中所述的药物用于治疗贫血。
4.一种产生基因敲除的非人类动物的方法，其步骤包括使hepcidin基因失活，所述基 因敲除的非人类动物不包括其中编码转录因子USF2的基因也被失活的基因敲除小鼠。
5.一种产生转基因非人类动物的方法，其步骤包括在非人类动物中表达hepcidin的转基因。
6.h印cidin基因已经被失活的基因敲除的非人类动物在筛选用于减少铁吸收的化合 物中的用途。
7.权利要求6方法产生的转基因非人类动物在筛选能抑制hepcidin对铁吸收的抑制 作用的化合物中的用途。
全文摘要
本发明涉及将hepcidin用于诊断和治疗铁稳态疾病的用途，hepcidin能被用于治疗铁负荷过量引起的疾病，而hepcidin的抑制剂可用于治疗贫血。
文档编号G01N33/15GK101884780SQ20101023275
公开日2010年11月17日 申请日期2002年5月24日 优先权日2001年5月25日
发明者格尔·尼古拉, 索菲·沃隆特, 阿克塞尔·卡恩 申请人:国家健康与医学研究院