专利名称：人膀胱癌肿瘤标志物及其抗体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤免疫学领域。具体地说本发明涉及一种新的人膀胱癌肿瘤标志物 AG- α 3 β 1 及其制备(AG 异常糖基化(AberrantGlycosylation))，以及抗 AG- α 3 β 1 的单克隆抗体BCMabl。细胞和组织学水平证明AG-ci 3β 1只表达于人膀胱肿瘤细胞膜上， BCMabl抗体不仅能够特异性识别AG-a 3 β 1，而且在体外细胞水平和体内动物模型中能有效地抑制人膀胱肿瘤细胞的增殖。本发明还涉及一种竞争性ELISA检测人膀胱癌的方法。 这种检测方法中的固定相抗原为本发明中的人膀胱癌肿瘤标志物AG-a 3β 1，检测抗体是本发明中的抗人膀胱癌整合素a 3 β 1抗体BCMabl。
背景技术：
膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤。尽管采用多种措施进行治疗，但仍有4070% 的患者要发生一次或多次复发，1015%的患者发展成更高级别的肿瘤或发生转移，而且这些治疗方法还有明显的毒副作用。膀胱癌在肿瘤切除后的预防复发是临床的重要课题。目前用于膀胱灌注预防复发的药物主要分以下几类(1)抗肿瘤化疗药物，如丝裂霉素C等；( 免疫增强剂，如卡介苗 (BCG)等。C3)细胞因子，如干扰素等。以上几类药物可以单独使用或联合使用，虽在降低膀胱癌术后复发率上取得一些效果，但因特异性差、肿瘤多耐药性(MDR)等问题的存在，总体疗效并不理想，高达4070%的患者要发生一次或多次复发，1015%的患者发展成更高级别的肿瘤或发生转移。且以上各类药物分子量小，不但可非特异性地作用于全膀胱及尿道，还可经膀胱及尿道粘膜吸收，因而容易产生局部及全身的毒副作用。以疗效较为肯定的丝裂霉素C及卡介苗为例使用卡介苗的患者90%有BCG膀胱炎，其它的副作用有血尿、皮疹、 发热、关节炎、尿道狭窄等，还有少见而严重的肝炎及肺炎、致命性败血症等。丝裂霉素C的副作用相对较少，但仍有〖25%的化学性膀胱炎和过敏性反应，还可见尿道狭窄、骨髓抑制、 膀胱壁钙化等副作用。整合素(integrin)是一组二价阳离子依赖的细胞表面受体，其主要功能是与相应配体结合介导细胞与基质、细胞与细胞的粘附，进而影响细胞形态、基因表达与调控、细胞增殖分化、凋亡及肿瘤细胞的迁移、浸润和转移等。整合素α 3亚单位(CD49c)可与 β 亚单位(⑶四)结合形成整合素α 3β1，其配体为层粘连蛋白(LN)和IV型胶原蛋白 (Collagen IV)。在上皮组织中，整合素α 3 β 1主要参与细胞与上皮细胞基底膜的粘连，可调节信号转导，从而影响细胞的生物学特性。它在肿瘤细胞表面的异常修饰，被认为会导致恶性度的改变。抗肿瘤靶向药物是一种具有特异性识别、杀伤肿瘤细胞的生物或化学分子(如单克隆抗体)。膀胱癌是一种人体腔内肿瘤，相当于一个人体的“肉试管”，而导向药物在体外对靶细胞具有高特异和强杀伤作用。寻找一种疗效好、副作用少的新的抗人膀胱癌的导向药物，在膀胱癌的治疗上具有重要意义。在膀胱肿瘤的筛查中，膀胱癌的早期发现和正确的预后估计对临床治疗显得极为重要。近年新用于临床的分子标记，如核基质蛋白、膀胱肿瘤抗原和卫星不稳定性等，也同样受限于灵敏度和特异性低的不足。尿脱落细胞学分析和膀胱镜检查仍然是膀胱癌诊断和监测的金标准。所以，寻求有效、便利的膀胱癌的诊断方法是非常必要的。
发明内容
本发明利用人膀胱癌细胞系TM免疫小鼠，获得杂交瘤细胞。用ELISA的方法筛选到能与TM细胞高度特异结合的抗体BCMabl。免疫组织化学和免疫荧光证实，BCMabl抗体与人膀胱癌细胞系TM及人膀胱癌组织呈强阳性反应，与人正常膀胱组织和其它非膀胱癌细胞无交叉反应。本发明利用BCMabl抗体采用免疫亲和层析的方法捕获该抗体识别的抗原，经过质谱分析和糖芯片鉴定为异常糖基化修饰的整合素α 3 β 1，命名为AG- α 3 β 1，其表位为糖结构[30S03]Galbl-4(Fucal-3) [60S03]GlcNAc 用 BCMabl 抗体证实，AG-α 3 β 1 只表达于人膀胱肿瘤细胞上，并与膀胱癌的肿瘤分期和病理分级呈正相关。AG-α 3 β 1可作为一种新的人膀胱癌肿瘤标记物。本发明利用BCMabl抗体，处理体外培养的TM细胞和裸鼠移植瘤模型，发现 BCMabl抗体能有效地抑制膀胱癌细胞系Τ24的增殖。BCMabl抗体可作为抗人膀胱癌的靶向药物。本发明利用BCMabl抗体和AG- α 3 β 1抗原制备成诊断试剂，即将人膀胱癌肿瘤标志物AG_a3i3 1作为固定相，与待测样品共同竞争AbBCl抗体，检测人尿液中的膀胱肿瘤细胞。本发明的创新点在于(1)研制了一种抗人膀胱癌的鼠单克隆抗体BCMabl，该抗体不仅能特异性地结合人膀胱癌组织，而且在体内或体外能有效抑制膀胱癌细胞系T24的增殖；⑵揭示了这种抗体识别的抗原表位AG- α 3 β 1，为一种新的人膀胱癌肿瘤标记物， 并证实了该表位只表达于人膀胱肿瘤细胞上，并与膀胱癌的肿瘤分期和病理分级呈正相关；(3)开发了一种高灵敏度的竞争ELISA方法用于人膀胱癌的检测。发明详述本发明提供了一种新的人膀胱癌肿瘤标记物——异常糖基化的整合素 AG-a 3 β 1，和产生抗该肿瘤标记物的单克隆抗体的杂交瘤细胞，及其分泌的单克隆抗体 BCMabl,BCMabl 抗体识别的抗原表位为[30S03]Galbl_4 (Fucal-3) [60S03]GlcNAc 该单克隆抗体与人膀胱癌细胞系TM及人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织和其它非膀胱癌细胞无交叉反应。同时，该单克隆抗体在体外细胞培养和动物肿瘤模型中具有抑制膀胱癌细胞系TM增殖的功能。本发明还提供了包含单克隆抗体BCMabl体外诊断试剂盒和使用单克隆抗体BCMabl检测尿脱落细胞中肿瘤标记物含量的方法。更具体地，本发明的一个目的是提供一种人膀胱癌肿瘤标志物AG-a 3 β 1， 其为异常糖基化的整合素α3β1，其特征在于带有作为抗原表位的糖结构[30S03] Galbl-4(Fucal-3) [60S03]GlcNAc 糖结构[30S03]Galbl_4(Fucal-3) [60S03]GlcNAc 的结
构式如下
权利要求
1. 一种人膀胱癌肿瘤标志物AG-α 3 β 1，其为异常糖基化的整合素α3β1，所述异常糖基化的整合素α 3 β 1的特征在于整合素α 3 β 1带有作为抗原表位的糖结构[30S03] Galbl-4(Fucal-3)[60S03]GlcNAc,其中糖结构[30S03] Galbl-4 (Fucal-3) [60S03] GlcNAc 的结构式如下
2.根据权利要求1所述的人膀胱癌肿瘤标志物AG_a3i31，其中所述整合素α3β1的 α 3亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示，所述整合素α 3β 1的β 1亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No :2所示，优选所述异常糖基化是处在α 3亚单位的第740位的氨基酸 T(苏氨酸)上。
3.针对根据权利要求1或2所述的人膀胱癌肿瘤标志物AG-α 3 β 1的抗体，其能够特异性识别所述作为抗原表位的糖结构[30S03] Galbl-4 (Fucal-3) W0S03]GlcNAc，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的抗体，其为抗人膀胱癌整合素α3β1的单克隆抗体BCMabl， 该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No. 3845的杂交瘤细胞株分泌。
5.一种用于治疗人膀胱癌的药物组合物，其包含根据权利要求3或4所述的抗体，优选还包含抗肿瘤化疗药物，如丝裂霉素C ；免疫增强剂，如卡介苗(BCG)；和/或细胞因子，如干扰素。
6.一种缀合物，其中所述抗人膀胱癌整合素α 3β1的抗体BCMabl与选自以下组成的组的物质缀合生物标记物、抗肿瘤药物、毒素和放射性活性剂。
7.一种用于检测或治疗人膀胱癌的试剂盒，其包含根据权利要求3或4所述的抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述检测是通过酶联免疫吸附法进行，优选所述酶联免疫吸附法是竞争酶联免疫吸附法，其中将权利要求1或2所述的人膀胱癌肿瘤标志物AG- α 3 β 1作为固定相，与待测样品共同竞争根据权利要求3或4所述的抗体。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中所述待测样品是含尿脱落细胞的人尿液。
10.分泌抗人膀胱癌整合素α3β 1的抗体BCMabl的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.3845。
全文摘要
本发明提供了一种新的人膀胱癌肿瘤标记物——异常糖基化的整合素AG-α3β1，和产生抗该肿瘤标记物的单克隆抗体的杂交瘤细胞，及其分泌的单克隆抗体BCMab1，BCMab1抗体识别的抗原表位为[3OSO3]Galb1-4(Fuca1-3)[6OSO3]GlcNAc。该单克隆抗体与人膀胱癌细胞系T24及人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织和其它非膀胱癌细胞无交叉反应。同时，该单克隆抗体在体外细胞培养和动物肿瘤模型中具有抑制膀胱癌细胞系T24增殖的功能。本发明还提供了包含单克隆抗体BCMab1体外诊断试剂盒和使用单克隆抗体BCMab1检测尿脱落细胞中肿瘤标记物含量的方法。
文档编号G01N33/577GK102372773SQ20101025138
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月11日 优先权日2010年8月11日
发明者唐海东, 张红莲, 戴中华, 李翀, 范祖森, 陈俊 申请人:中国科学院生物物理研究所