专利名称：一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，具体为一种猪肉肌纤维 类型组成的mRNA定量检测方法。
背景技术：
我国的猪种资源丰富，分为地方品种、培育品种及外来品种三大类，不同的猪种之 间具有很大的差异。北京黑猪是我国较为成熟的培育品种之一，具有体型较大、生长速度较 快等优点，但其与外来品种在肉品质上的差异研究较为稀少。肉品质是一个综合的、相对模 糊的复杂概念，因此在不同国家、不同地区都具有不同的评价体系与标准。国内通常选用的 评价指标与测量方法对引进猪品种及中国地方猪品种的常规肉品质性状进行了测定，并进 行对测定结果进行了比较分析，为研究影响猪肉品质候选基因提供研究基础。与此同时，越来越多的研究表明，肌纤维作为肌肉基本组成单位，其自身理化性质 在很大程度上可能影响肉品质性状。有关肌纤维性质的研究早在上世纪70年代就已经开 始，但目前的研究主要集中于肌纤维性质的生物学特点以及简单的肌纤维类型分布状况的 探索。传统的研究肌纤维性质的方法主要为免疫组织化学方法，不同的染色方法得到的结 论不尽相同无法准确定义肌纤维类型。传统的研究肌纤维性质的方法多为组织化学染色 方法，不同染色方法得出的结论不尽相同，无法准确定义肌纤维类型。近年，随着功能基 因组学的发展，对肌球蛋白重链研究的逐渐深入，一种更为准确的分子分型方法被引入到 肌纤维类型组成的研究中。在哺乳动物的骨骼肌和心肌上总共发现了 8种肌球蛋白异构 体，分别由不同基因编码。Schiaffino (Schiaffino and Reggiani，1994，Schiaffino and Reggiani，1996)和Weiss (Weiss and Leinwand, 1996)等在对啮齿类和人类的研究中，确认 了与肌纤维类型相对应的四种肌球蛋白重链亚型。Chang和Femandes等人研究发现在猪的 骨骼肌上表达的MyHC有四种类型，I、II a、II b和II x，分别由不同的基因编码，并依据 肌纤维特有的MyHC类型将猪的肌纤维分为四种类型，从基因表达水平对猪骨骼肌中各种 类型肌纤维的组成情况进行研究，发现四种MyHC亚型表达比例不同的肌肉表现出不同的 收缩能力和ATP酶活性(Chang, et al.，2003，Klont, et al.，1998)。因此，根据不同类型 骨骼肌纤维肌球蛋白重链基因上游序列差异，设计特异引物，对肌肉组织中不同类型肌球 蛋白重链基因mRNA表达量进行测定，进而分析肌肉中不同类型肌纤维的组成比例。这种建 立在肌球蛋白重链基因mRNA表达基础上的分子分型比组织化学评定更为准确、可靠。
发明内容
本发明的目的在于提供一种建立在肌球蛋白重链基因mRNA表达基础上的，比组 织化学染色法更为准确、可靠的猪肉肌纤维类型组成的定量分子分型方法。为了达到上述目的，本实用新型采用以下技术方案一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其步骤包括引物与探针设计、总 RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于所述引物与探针是根据猪MyHC基因不同亚型cDNA上游序列差异设计合成的TaqMan探针。进一步，猪MyHC I 基因引物序列(5，-3，)为 “GGGAAAATCTGAACAAGCTGATGACTCTA TTACCCCTGGAGACTTTGTCT”，其 TaqMan 探针为 “TTGCGCTCCACACATC”，其参考序列 GenBank 登 录号为“U75316”。进一步，猪MyHC II a 基因引物序列(5，_3，)为“CCAAGAAAGGTGGCAAGAAGAAGGGTC ATCAGCTTGTTCAGATTCTCT”，其 TaqMan 探针为 “CCGTGTCTGCCCTTTT”，其参考序列 GenBank 登 录号为 “AB025260”。进一步，猪MyHC II b 基因引物序列(5，-3，)为 “ACTTTGTGCGCTGCATCATCGGACG AGTTCGTGCTCCAT”，其 TaqMan 探针为 “ATGAGACCAAAACTCC”，其参考序列 GenBank 登录号为 “AB025261”。进一步，猪MyHC II χ 基因引物序列(5，-3，)为“CTTCACTGCGCAGCAGGGGACGAG TTCGTGCTCCAT”，其 TaqMan 探针为 “ATGAGACCAAAACTCC”，其参考序列 GenBank 登录号为 “AB025262”。进一步，检测中所用内参基因，猪GAPDH基因，参考序列GenBank登录号为 "AF069649. 1”。进一步，所述的总RNA提取与质量检测分为如下步骤1)勻浆处理每10_20mg肌肉组织加300 μ 1裂解液RL，使用前加入β -巯基乙醇， 用研磨杵将组织彻底研磨，可用勻浆器；之后想勻浆液中加入590 μ 1 RNase-free ddH20和 10 μ 1蛋白酶K，混勻后56°C处理10-20分钟；2) 12，OOOrpm离心2_5分钟，取上清进行一下操作；3)缓慢加入0. 5倍上清体积无水乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 CR3，吸附柱放在收集管中，12，OOOrpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回
收集管中；4)向吸附柱CR3中加入350 μ 1去蛋白液RW1，12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液，
将吸附柱放回收集管中；5)配制DNase I工作液取10 μ 1 DNase I储存液放入新的RNase-free离心管 中，加入70 μ 1 RDD溶液，轻柔混勻；6)向吸附柱CR3中央加入80 μ 1 DNase I工作液，室温放置15分钟；7)向吸附柱CR3中加入350 μ 1去蛋白液RW1，12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液， 将吸附柱放回收集管中；8)想吸附柱CR3中加入500 μ 1漂洗液RW，使用前加入乙醇，室温静置2分钟， 12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；9)重复步骤8;10) 12，OOOrpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液；11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空 滴加30-100 μ 1 RNase-free ddH20,室温放置2分钟，12，OOOrpm离心2分钟，得到RNA溶 液；12) RNA纯度及浓度检测普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量为
618SrRNA的两倍左右，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测0D260、 0D280及0D260/0D280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA 0D260/0D280读数在 1. 8-2. 1 之间。 进一步，所述的cDNA第一链的合成(RT-PCR)采用High Capacity cDNA RT试剂 盒进行cDNA第一链的合成，反应体系及反应程序如下10XRT Buffer2. 0 μ 125 XdNTP Mix(IOOmM)0. 8 μ 110XRT Random Primers2. 0 μ 1MultiScribeTM Reverse Transcriptase1. 0 μ 1RNase InhibitorΙ.ΟμΙNuc1ease-free H203. 2 μ 1总RNA10. 0μ 1混勻后离心，置于ABI9700型PCR仪上，25°C 10分钟，37°C延伸120分钟，85°C 5 秒钟后取下，保存于-20°C。进一步，所述猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法还包括定量PCR反应体系 和程序和cDNA样品质量和引物扩增效率的检测两步骤。进一步，所述的定量PCR反应体系和程序如下所示所述的定量PCR反应体系采用20 μ 1反应体系，成分如下TaqMan Gene Expression Master Mix(2Χ)10 μ 1TayMan 探针(20 X)1 μ 1cDNA 样品及 DEPC 水9 μ 1所述的定量PCR反应程序如下表所示
步骤 温度时间
Step _Temperature_Time
1 去除 RNA 50 2γΓ
2起始变性 95 °CIOmin
3 变性 95°C15s4 退火 60°Clrain
5荧光数据收集60-95
6循环3-5步40次
7末次延伸 72 °C7min
8生成溶解曲线 65-98 0. 2°C / s
9 退火 72 °CIOmin进一步，所述的cDNA样品质量和引物扩增效率的检测步骤为在进行定量PCR试验前，应先进行预试验检测cDNA样品的质量，对cDNA样品使用 参基因GAPDH进行rt-PCR试验，根据Ct值，评价cDNA样品质量，Ct < 25的可直接进行后 期试验；若Ct ^ 30说明cDNA样品浓度偏低，需重新进行反转录；若无扩增结果，则cDNA质 量存在问题，需重新进行反转录；将cDNA模板从10倍到105倍梯度稀释，并以此为模板，对每对探针进行荧光定量 PCR反应，反映结束后，以内参基因GAPDH的五个梯度反应制作标准曲线，将其他各对引物
7的曲线斜率和R2与内参基因进行比较，保证扩增效率一致。进一步，所述猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法还包括荧光定量PCR数据 标准化统计分析和各型肌纤维比例的换算两步骤，进一步，所述的荧光定量PCR数据标准化统计分析为以GAPDH基因为内参基因校 正不同样品初始模板量以及反转录效率的差异，每次反应，每个样本的目的基因和内参基 因各重复三次，获得平均Ct值，利用美国ABI公司SDS RQManager Version 1. 2软件计算 样品Δ ACt值，以2-Δ Δ Ct法计算得到目的基因的相对表达量RQ。进一步，所述的各型肌纤维比例的换算为以不同类型MyHC相对表达量占全部 MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤维在全部肌纤维中的比例，计算公式如下MyHC(i) = [MyHC(i)/(MyHC I+MyHC II a+MyHC II b+MyHC II χ)] X 100%。通过上述技术方案，可以通过建立在肌球蛋白重链基因表达基础上的分子分型的 猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法比组织化学评定更为准确、可靠，本方法采用这 种分子定量分型的方法，可以对不同品种猪不同部位肌肉中不同类型肌纤维进行定量测定 及分析。
图1猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法流程图；图2不同类型MyHC融解曲线图
具体实施例方式1、样品采集屠宰后迅速采集相关部位肌肉组织样存放于RNAfixer样品保存液中，-20°C冷冻 保存备用。2、药品、试剂和酶动物组织总RNA提取试剂盒天根生化技术(北京)有限公司；High Capacity cDNA RT Kit 美国 Applied Biosystems 公司；TaqMan Gene Expression Master Mix 美国 Applied Biosystems 公司；TaqMan 探针的合成美国 Applied Biosystems 公司；3、主要仪器和设备Eppendorf5417R台式高速冷冻离心机Eppendorf公司；ABI9700 型热循环仪Applied Biosystems 公司；ABI7500型试试荧光定量定量PCR系统Applied Biosystems公司；Nanodrop2000 超微量分光光度计Thermo Scientific 公司；4、检测方法a)引物的设计与合成根据猪MyHC基因不同类型cDNA上游序列差异，利用Primer Express 3. O软件 (Applied Biosystems)设计并交ABI公司合成TaqMan探针。探针序列如表1所示。表1不同类型MyHC TaqMan探针引物 b)总RNA提取与质量检测采用天根生化技术有限公司生产的动物组织总RNA提取试剂盒提取肌肉组织中 的总RNA。具体步骤如下1)勻浆处理每10_20mg肌肉组织加300 μ 1裂解液RL (使用前加入β -巯基乙 醇)，用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨，可用勻浆器)；之后想勻浆液中加入 590 μ 1 RNase-free ddH20 和 10 μ 1 蛋白酶 K，混勻后 56°C处理 10-20 分钟。2) 12，OOOrpm离心2_5分钟，取上清进行一下操作。3)缓慢加入0. 5倍上清体积无水乙醇，混勻(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液 和沉淀一起转入吸附柱CR3 (吸附柱放在收集管中)，12，OOOrpm离心30-60秒，弃掉收集管 中的废液，将吸附柱放回收集管中。4)向吸附柱CR3中加入350 μ 1去蛋白液Rffl, 12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液，
将吸附柱放回收集管中。5)配制DNase I工作液取10 μ 1 DNase I储存液放入新的RNase-free离心管 中，加入70 μ 1 RDD溶液，轻柔混勻。6)向吸附柱CR3中央加入80 μ 1 DNase I工作液，室温放置15分钟。7)向吸附柱CR3中加入350 μ 1去蛋白液RW1，12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液， 将吸附柱放回收集管中。8)想吸附柱CR3中加入500 μ 1漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2分钟， 12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。9)重复步骤8。10) 12，OOOrpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底 晾干吸附材料中残余的漂洗液。11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空 滴加30-100 μ 1 RNase-free ddH20,室温放置2分钟，12，OOOrpm离心2分钟，得到RNA溶液。12) RNA纯度及浓度检测普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量约为 18SrRNA的两倍，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测0D260、0D280及 0D260/0D280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA 0D260/0D280读数在1. 8-2. 1之 间。c)cDNA 第一链的合成(RT-PCR)
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采用 Applied Biosystems 公司的 High Capacity cDNA RT 试剂盒进行 cDNA 第一
链的合成，反应体系及反应程序如下IOXRT Buffer2. O μ 125 XdNTP Mix(IOOmM)0. 8 μ 110XRT Random Primers2. 0 μ 1MultiScribeTM Reverse Transcriptase1. 0 μ 1RNase InhibitorΙ.ΟμΙNuc 1 ease-free H203. 2 μ 1总RNA10. 0μ 1 混勻后离心，置于ABI9700型PCR仪上，25°C 10分钟，37°C延伸120分钟，85°C 5
秒钟后取下，保存于-20°C。d)定量PCR反应体系和程序采用20 μ 1反应体系，成分如下TaqMan Gene Expression Master Mix(2Χ) 10 μ 1TayMan 探针(20 X)1 μ 1cDNA 样品及 DEPC 水9 μ 1定量PCR反应程序如下表所示 e) cDNA样品质量和引物扩增效率的检测在进行定量PCR试验前，应先进行预试验检测cDNA样品的质量。对cDNA样品使 用参基因GAPDH进行rt-PCR试验，根据Ct值，评价cDNA样品质量。Ct < 25的可直接进行 后期试验；若Ct ^ 30说明cDNA样品浓度偏低，需重新进行反转录；若无扩增结果，则cDNA 质量存在问题，需重新进行反转录。将cDNA模板从10倍到IO5倍梯度稀释，并以此为模板，对每对探针进行荧光定量 PCR反应。反映结束后，以内参基因GAPDH的五个梯度反应制作标准曲线，将其他各对引物 的曲线斜率和R2与内参基因进行比较，保证扩增效率一致。5、荧光定量PCR数据标准化统计分析本试验以GAPDH基因为内参基因校正不同样品初始模板量以及反转录效率的差 异。每次反应，每个样本的目的基因和内参基因各重复三次，获得平均Ct值，利用美国ABI 公司SDS RQ Manager Version 1. 2软件计算样品Δ Δ Ct值，以2_Δ Δα法计算得到目的基因的相对表达量RQ。6、各型肌纤维比例的换算以不同类型MyHC相对表达量占全部MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤维在 全部肌纤维中的比例。计算公式如下，MyHC⑴=[MyHC⑴/(MyHC I+MyHC II a+MyHC II b+MyHC II χ)] X 100%。7、统计分析用SAS Version 8. 02软件的GLM过程对不同品种猪不同类型肌纤维比例进行最 小二乘分析，并对不同类型肌纤维比例与猪肉品质及胴体性状关系进行相关性分析，构建 如下模型。Y = μ +B+e其中，Y:性状值；μ:群体均值;B:品种效应;e:随机残差。8、实验结果对不同类型MyHC基因mRNA相对表达量进行检测，融解曲线见图2。将不同类型肌 球蛋白重链表达量换算为肌纤维类型比例，并以不同类型MyHC总表达量作为评价肌纤维 数量与密度的指标，对不同类型肌纤维及MyHC表达量在品种及不同肌肉组织中的分布情 况进行分析，结果表明不同类型肌纤维及MyHC表达量在品种及肌肉部位间存在差异见表1 及图2。表1不同品种和肌肉部位猪肌纤维类型组成及MyHC表达量差异 注表中数据表示为最小二乘均值士标准误。同一行中数据标有不同上标，ab表示差异显著且水平达到P < 0. 05，AB表示差异显 著水平达到 P < 0. 01 ;* P < 0. 05 ;* * P < 0. 01。背最长肌及股二头肌中I型肌纤维比例在品种间均存在显著差异(P < 0. 05)，北 京黑猪背最长肌中I型肌纤维比例最高(0. 376士0. 028)，且与长大二元猪(0. 281 士0. 022) 差异极显著(P <0.01)，而股二头肌中I型肌纤维比例以长白猪(0. 575士0.023)为最高， 显著高于长大二元猪(0.497士0.023)及大白猪(0.491 士0.023) (P < 0. 05)。此外，I型肌 纤维比例在不同肌肉部位也存在差异。长白猪与长大二元猪股二头肌中I型肌纤维比例高 于背最长肌，且达到极显著水平(P < 0. 01)。II a型肌纤维在不同品种猪股二头肌中的比例存在差异(P < 0. 05)，长大二元猪 最高(0. 385士0. 026)，与长白猪(0. 238士0. 026)差异达到极显著水平(P < 0. 05)。长白 猪背最长肌及股二头肌中II a型肌纤维比例存在显著差异(P < 0. 05)。IIb型肌纤维在不同品种猪背最长肌中比例存在差异(P < 0. 05)，长大二元猪与 大白猪(0. 330士0. 027和0. 287士0. 030) II b型肌纤维比例高于另外两个品种，北京黑猪 中II b型肌纤维比例最低(0. 197士0.024)。股二头肌II b型肌纤维比例在不同品种中不 存在显著差异。长大二元猪背最长肌中IIb型肌纤维比例(0.330士0.027)高于股二头肌 (0. 118 士 0. 028)，且达到极显著水平(P < 0.01)。II χ型肌纤维在背最长肌或股二头肌均几乎不表达，仅在长白猪背最长肌及股二头肌中存在少量表达，分别为0. 102 士0. 031和0. 060 士0. 033，高于其他品种猪(P
<0. 05)，背最长肌中的差异达到极显著水平(P < 0. 01)。长大二元猪背最长肌与股二头 肌中II X型肌纤维比例存在显著差异(P <0.01)。II b型肌纤维仅在个别长白猪肌肉组 织中有少量表达，因此在之后的研究中不对候选基因多态或表达水平对其的影响以及其与 肉品质性状的关系进行研究。背最长肌及股二头肌MyHC表达量在不同品种的分布中不存在差异。但三个引进 品种股二头肌中MyHC表达量均高于背最长肌，其中长大二元猪的差异达到极显著水平(P
<0. 01)。本研究对肌肉组织切片分别进行不同预孵环境下ATP酶活性染色以及NADH酶活 性染色。根据ATP酶活性染色时酸性和碱性预孵育环境对肌纤维分型具有一定的对应“镜 相”关系，可判断出不同类型肌纤维。在因在酸性及碱性环境中，II b及II χ型肌纤维着 色深浅程度变化不显著，故而分型效果不如I型及IIa型肌纤维。结合NADH酶活性染色结 果，I型肌纤维呈深黑色，II b型肌纤维无色或淡染，II a与II χ型肌纤维为中等染色程 度，根据同一肌纤维在不同染色环境下着色深浅的变化，可判断出肌纤维类型。对背最长肌中基因表达量与MyHC表达量及不同类型肌纤维比例进行相关性分 析，结果如表2所示。分析结果显示3 01 、？ 41 (1、浙41^1^6￡2(；及16 1-1~基因表达量 与MyHC表达量均存在不同程度的正相关，而PPARGC1基因表达量与背最长肌中I型及II a 型肌纤维比例存在正相关。NFATcl基因表达量与背最长肌中I型肌纤维比例存在正相关， IGFl-r基因表达量与背最长肌中I型肌纤维比例存在正相关，同时与II b型肌纤维比例存 在负相关。表2背最长肌中基因表达量与肌纤维类型组成的相关性 注表中数据表示为交叉的两性状间相关系数及P值；* P <0.05;*女P < 0. 01。
权利要求
一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于所述引物和探针是根据猪MyHC I、MyHC II a、MyHC II b和/或MyHC II x基因cDNA上游序列差异设计的，所述探针为TaqMan探针，所述的猪MyHC I基因参考序列GenBank登录号为“U75316”，其基因引物序列为5’ GGGAAAATCTGAACAAGCTGATGACTCTATTACCCCTGGAGACTTTGTCT 3’，其TaqMan探针为5’ TTGCGCTCCACACATC 3’，所述的猪MyHCII a基因参考序列GenBank登录号为“AB025260”，其基因引物序列为5’ CCAAGAAAGGTGGCAAGAAGAAGGGTCATCAGCTTGTTCAGATTCTCT 3’，其TaqMan探针为5’ CCGTGTCTGCCCTTTT 3’，所述的猪MyHC II b基因参考序列GenBank登录号为“AB025261”，其基因引物序列为5’ ACTTTGTGCGCTGCATCATCGGACGAGTTCGTGCTCCAT 3’，其TaqMan探针为5’ ATGAGACCAAAACTCC 3’，所述的猪MyHC II x基因参考序列GenBank登录号为“AB025262”，其基因引物序列为5’ CTTCACTGCGCAGCAGG GGACGAGTTCGTGCTCCAT 3’，其TaqMan探针为5’ ATGAGACCAAAACTCC 3’。
2.根据权利要求1所述的mRNA定量检测方法，进一步地包括了内参基因的使用，所述 的内参基因为猪GAPDH基因，其参考序列GenBank登录号为“AF069649. 1”。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其特征 在于，所述的总RNA提取与质量检测分为如下步骤1)勻浆处理每10-20mg肌肉组织加300μ 1裂解液RL，使用前加入β-巯基乙醇， 用研磨杵将组织彻底研磨，或使用勻浆器将组织勻浆；之后向研磨或勻浆过的组织中加入 590 μ 1 RNase-free ddH20 和 10 μ 1 蛋白酶 K，混勻后 56°C处理 10-20 分钟；2)12，OOOrpm离心2-5分钟，提取上清；3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 CR3，吸附柱放在收集管中，12，OOOrpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；4)向吸附柱CR3中加入350μ 1去蛋白液RW1，12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液，将吸 附柱放回收集管中；5)配制DNaseI工作液取10 μ 1 DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加 入70 μ 1 RDD溶液，轻柔混勻；6)向吸附柱CR3中央加入80μ 1 DNase I工作液，室温放置15分钟；7)向吸附柱CR3中加入350μ 1去蛋白液RWl，12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液，将吸 附柱放回收集管中；8)向吸附柱CR3中加入500μ 1漂洗液RW，使用前加入乙醇，室温静置2分钟， 12，OOOrpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；9)重复步骤8)；10)12，OOOrpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干 吸附材料中残余的漂洗液；11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 30-100 μ 1 RNase-free ddH20,室温放置2分钟，12，OOOrpm离心2分钟，得到RNA溶液；12)RNA纯度及浓度检测普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量为18SrRNA 的两倍左右，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测0D260、0D280及0D260/0D280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA 0D260/0D280读数在1. 8-2. 1之间。
4.根据权利要求3所述的mRNA定量检测方法，其特征在于采用High CapacitycDNA RT试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应体系及反应程序如下10XRT Buffer2. 0 μ 125XdNTP Mix (IOOmM)0. 8 μ 110XRT Random Primers2. 0 μ 1 MultiScribe Reverse Transcriptase 1. 0 μ 1RNase Inhibitor1. 0 μ 1Nuclease-freeH203. 2 μ 1总 RNA10. 0μ 1混勻后离心，置于ΑΒΙ9700型PCR仪上，25°C 10分钟，37°C延伸120分钟，85°C 5秒钟 后取下，保存于_20°C。
5.根据权利要求4所述的mRNA定量检测方法，其特征在于所述猪肉肌纤维类型组成 的mRNA定量检测方法还包括定量PCR反应体系和反应条件设定，以及cDNA样品质量和引 物扩增效率的检测。
6.根据权利要求5所述的mRNA定量检测方法，其特征在于所述的定量PCR反应体系 和条件如下所示所述的定量PCR反应体系采用20 μ 1反应体系，成分如下 TaqMan Gene Expression Master Mix(2Χ) 10 μ 1 TayMan 探针(20 X)1 μ 1cDNA样品及DEPC水9μ1所述的定量PCR反应条件如下表所示
7.根据权利要求4或5所述的mRNA定量检测方法，其特征在于所述的cDNA样品质 量和引物扩增效率的检测步骤为在进行定量PCR试验前，应先进行预试验检测cDNA样品的质量，对cDNA样品使用参基 因GAPDH进行rt-PCR试验，根据Ct值，评价cDNA样品质量，Ct < 25的可直接进行后期试 验；若Ct > 30说明cDNA样品浓度偏低，需重新进行反转录；若无扩增结果，则cDNA质量存 在问题，需重新进行反转录；将cDNA模板从10倍到IO5倍梯度稀释，并以此为模板，对每对探针进行荧光定量PCR 反应，反应结束后，以内参基因GAPDH的五个梯度反应制作标准曲线，将其他各对引物的曲 线斜率和R2与内参基因进行比较，保证扩增效率一致。
8.根据权利要求7所述的mRNA定量检测方法，其特征在于所述猪肉肌纤维类型组成 的mRNA定量检测方法还包括荧光定量PCR数据标准化统计分析和各型肌纤维比例的换算。
9.根据权利要求8所述的mRNA定量检测方法，其特征在于所述的荧光定量PCR数 据标准化统计分析为以GAPDH基因为内参基因校正不同样品初始模板量以及反转录效率 的差异，每次反应，每个样本的目的基因和内参基因各重复三次，获得平均Ct值，利用美国 ABI公司SDS RQ Manager Version 1. 2软件计算样品Δ ACt值，以2_ΔΔα法计算得到目 的基因的相对表达量RQ。
10.根据权利要求8或9所述的mRNA定量检测方法，其特征在于所述的各型肌纤维 比例的换算为以不同亚型MyHC相对表达量占全部MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤 维在全部肌纤维中的比例，计算公式如下MyHC⑴=[MyHC⑴/(MyHC I+MyHC II a+MyHC II b+MyHC II χ)] X 100%。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种建立在肌球蛋白重链不同亚型基因mRNA表达基础上的比组织化学染色法更为准确、可靠的猪肉肌纤维类型组成的定量分子检测方法。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其步骤包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于所述引物设计的探针是根据猪MyHC基因不同亚型cDNA上游序列差异合成TaqMan探针。通过上述技术方案，可以通过建立在肌球蛋白重链不同亚型基因mRNA表达基础上的猪肉肌纤维类型组成的定量分子检测方法比组织化学评定更为准确、可靠，本方法采用这种分子定量分型的方法，可以对不同品种猪不同部位肌肉中不同类型肌纤维进行定量测定及分析。
文档编号G01N21/64GK101914621SQ201010255889
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者王楚端, 翟丽维 申请人:中国农业大学