专利名称：通过检测dna浓度测定基质中食用菌菌丝生物量的方法
技术领域：
本发明属测定食用菌菌丝生物量的方法领域，特别是涉及一种通过检测DNA浓度 测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法。
背景技术：
生物量是所有微生物生长状况的一项基本参数，生物量的测定是确定微生物培养 过程的生长动力学和深入研究微生物代谢调控的基础。由于多数微生物与其生长基质的混 合特性，很难直接测定其生物量，尤其在人工栽培的食用菌中菌丝深入培养基质内部，无法 进行分离测定。现有的微生物生物量测定方法有四大类(1)直接从培养基中分离计数，如浊度 法、直接计数法等；(2)通过检测代谢活动推断生物量，如氧气和二氧化碳的代谢、胞外漆 酶法等；(3)测出生物体中某些特殊物质的含量推知其生物量，如几丁质分析法、麦角固醇 法、嘌呤分析法、氮和蛋白质等；(4)利用与菌体生长有关的某些现象估测生物量。这些测 定方法都有各自的局限性，如(1)要求纯培养状态，其余的方法是对一定系统中的微生物 活动或特殊成分进行的估测，不能排除系统中其它干扰基质对结果的影响，因而不能准确 定量也无法得知估测的误差范围。本方法目的明确，在构建待测种类真菌的DNA量和提取 用菌丝量的标准曲线和相应基质对提取过程中DNA影响的基础上，采用直接测定含基质样 品的DNA量，从而快速简便地得到单位质量待测样品中的食用菌菌丝生物量参数。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用 菌菌丝生物量的方法，该方法简单，耗时少，能够快速，准确的检测培养基质中食用菌菌丝 的生物量。本发明的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法，包 括(1)培养标准菌丝取待测食用菌斜面培养物，活化后打碎，接入新鲜的标准液体培养基中，摇床培养 至菌丝稳定期；(2)菌丝处理过滤菌丝，无菌水冲洗，冷冻至固态，充分干燥；(3)构建标准曲线将步骤(2)处理后的菌丝迅速研磨，梯度称取后置于容器中，用CTAB法提取DNA， NAN0DR0P 1000紫外分光光度计确定DNA量，构建提取DNA量和提取用菌丝量的关联标准曲 线.
一入 ，(4)相应基质DNA水平确定取相应基质，用CTAB法提取DNA，NAN0DR0P 1000紫外分光光度计确定DNA量，确
3定基质DNA本底水平；(5)培养菌丝与基质混合，确定相应基质对DNA提取的影响称取步骤(2)处理后的菌丝与上述基质混合，用CTAB法提取DNA，NAN0DR0P1000 紫外分光光度计确定DNA量，与(3)和(4)的结果比较，确定该种基质对DNA提取的影响；(6)待测样品中食用菌菌丝生物量的确定取样品(该食用菌在基质中的培养物)冷冻干燥，研磨，定量秤取于容器中，用 CTAB法提取DNA，NAN0DR0P 1000紫外分光光度计确定DNA量，对照标准曲线、基质本底和 基质影响率，确定培养基质中的食用菌菌丝的生物量。所述步骤(1)中的菌丝为香菇135菌丝。所述步骤(1)中，待测食用菌标准菌丝的获得，取人工栽培的食用菌斜面菌种，活 化后转接在新鲜的标准液体培养基中(根据情况选用商业化生产的PDB培养基，高氏培养 基，查氏培养基等成分稳定，重复性好的标准液体培养基)，摇床培养至菌丝稳定期。所述步骤(1)中的标准液体培养基为PDB培养基。所述步骤(2)中的处理后的菌丝含水量接近零，且DNA在冷冻的条件下不易降解。所述步骤(2)使用冷冻干燥机充分干燥。所述步骤(3)中用CTAB法提取DNA，每处理5个重复。所述步骤(3)中构建标准曲线是样品测定的基准，在CTAB法提取DNA和 NAN0DR0P1000紫外分光光度计确定DNA量的步骤中要设置重复和不同批次培养的菌丝间 的对照，用以确定整个检测体系的误差范围。所述步骤(4)中，人工栽培的食用菌都可以以不同的农作物废弃物按不同的配方 进行人工培养，这些培养基质主要成分为主料(木屑、稻草、棉籽壳、甘蔗渣、玉米芯、麦秸 等)和辅料(麸皮、米糠、豆饼等)，有时还根据需要增加糖和无机盐等添加成分，不同的原 料和配方可能导致培养基质的DNA本底差异，这里需要在步骤(4)中确定与待测样品相同 配方的培养基质的DNA水平，消除实际测量中由基质本底带来的影响。所述步骤(4)中的相应基质取木屑先浸泡12_24h，再与麸皮混合，调整含水量至 50% -60%，灭菌，然后冷冻至固态，再充分干燥。所述步骤(5)中，经过预实验确定标准培养菌丝与基质混合比例(尽量接近待测 样品的数据)，确定基质对DNA提取的影响。所述步骤(5)中的菌丝与相应基质的质量比为1 4或3 7。通过检测DNA浓度确定真菌菌丝生物量的方法可实现对不同基质中真菌菌丝生 物量的准确定量，该方法所用时间短，线性度高，快速判断基质中真菌菌丝生物量的多少。 对特定种类真菌菌丝量和提取DNA量的标准曲线一经建立可重复使用，而确定不同基质对 提取DNA的影响则使测定不同基质中特定种类真菌的菌丝生物量成为可能。本发明通过检测DNA浓度测定基质中真菌菌丝生物量的方法，解决了生物量测定 不准确、误差范围难以评估等问题，该方法可以快速判断基质中真菌生物量的多少，且用质 量单位(mg)准确表示。检测系统一经确定可对相应培养模式或生长环境中的真菌生物量 进行长期、稳定的监测。有益效果(1)本发明的方法简单，在构建待测种类真菌的DNA量和提取用菌丝量的标准曲
4线和相应基质对提取过程中DNA影响的基础上，采用直接测定含基质样品的DNA量，从而快 速简便地得到单位质量待测样品的真菌生物量参数；(2)本发明解决了生物量测定不准确、误差范围难以评估等问题。
图1第一批次标准培养菌丝量与DNA量的关联曲线；图2第二批次标准培养菌丝量与DNA量的关联曲线；图3第三批次培养纯菌丝量与DNA量的关联曲线；图4不同批次纯培养菌丝与DNA含量关系。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1本发明以确定木屑常规基质的香菇135菌丝培养物中香菇菌丝生物量为实施例 阐述具体步骤(1)用标准PDB液体培养基培养香菇135的标准菌丝将固体PDA培养基上的香菇135菌丝活化后，用均质仪高低档间隔打碎30S，接入 含90mL新鲜标准液体PDB (美国BD公司生产)培养基的250mL三角瓶中，转速120rpm，25°C 下，培养14d至菌丝稳定期。每隔一天培养一个批次菌丝，每个批次培养5瓶，共培养3个 批次，以供构建标准曲线。(2)菌丝处理用无纺布过滤菌丝，无菌水冲洗后再用无菌吸水纸吸干多余水分，于-20°C冰箱冷 冻至固态，转入冷冻干燥机(Heto Power Dry PL3000)中充分干燥。(3)构建标准曲线冻干的菌丝在常温下迅速研磨，梯度精确称取菌丝(2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg)， 并分装在2mL离心管中，CTAB法提取DNA，每处理5个重复。取65 V预热的CTAB 800 μ L，加入离心管中，65 V水浴lh，间或摇勻混合液； 12000rpm，4°C离心20min ；取上清转入另一 2mL的离心管中，加入预冷(4°C )的等体积的 酚氯仿(1 1)，充分混勻，12000rpm，4°C离心IOmin ；取上清转入另一 2mL的离心管中， 用预冷(4°C )的等体积的氯仿异戊醇(24 1)提取两次，充分混勻，12000rpm，4°C离心 IOmin ；取上清转入1. 5mL的离心管中，加入60 μ L的NaAc (3mol/L, pH52)，并加入500 μ L预 冷(_20°C )的异丙醇，于_20°C静置20min使DNA沉淀，12000rpm，4°C离心lOmin，弃上清， 再加入ImL预冷(4°C )的70%乙醇，轻轻上下颠倒，12000rpm，4°C离心lOmin，弃去乙醇，真 空干燥机干燥IOmin (不可加热)。加50 μ L的双蒸水(含有1 μ L RNase)，轻轻敲打使沉 淀溶解，37°C水浴lh，去除RNA。用NAN0DR0P 1000紫外分光光度计确定DNA的量，构建提取DNA量和提取用菌丝
5量的关联标准曲线。1)第一批次标准香菇135菌丝情况表1第一批次标准培养菌丝提取的DNA浓度 表2第一批次标准培养菌丝DNA含量
由表2知第一批次的误差范围在0. 06% -7. 46%之间。2)第二批次标准香菇135菌丝情况表3第二批次标准培养菌丝提取的DNA浓度 表4第二批次标准培养菌丝DNA含量
由表4知第二批次的误差范围在0. 05% -11. 01%之间。 3)第三批次标准PDB液体培养的香菇135菌丝情况 表5第三批次标准培养菌丝提取的DNA浓度 表6第三批次标准培养菌丝DNA含量 由表6知第三批次的误差范围在0. 26% -9. 52%之间。将三个批次培养的标准菌丝的DNA含量归纳如表7。表7不同批次标准培养菌丝的DNA含量 将三个批次的标准曲线归纳如图4 分析从图4及表7可以看出，测量范围内每个批次标准培养菌丝量与其DNA含量 之间存在良好线性关系，相关系数均大于0. 99 ；3个不同培养批次菌丝的标准曲线重合率 高，表明本发明内容受不同批次菌丝及操作的影响较小；统计构建标准曲线的90个数据可 知，其误差范围在0. 05% -13. 74%，小于14%;香菇135标准培养菌丝中每mg菌丝提取的 DNA量在6. Ilyg左右。因此，此标准曲线可以成为通过检测DNA含量来确定香菇135菌丝 生物量的基准。(4)香菇135木屑常规培养基质DNA本底含量测定按香菇135木屑常规培养料配方取85g木屑(0. 2-0. 3X0. 5cm)浸泡过夜，再与 15g麸皮混合，调整含水量至60%，高压灭菌(121°C，1. 5h)，冷却后于-20°C冰箱冷冻至固 态，转入冷冻干燥机(Heto Power Dry PL3000)充分干燥，取适量培养料充分研磨后按步骤 (3)方法提取DNA，提取结果见表8和表9。
表8纯培养料的DNA浓度 表9纯培养料的DNA含量 由表9知每mg纯培养料的平均DNA含量为0. 689 μ g。(5)菌丝与培养料的混合，确定基质对DNA提取的影响将冻干的标准培养香菇135菌丝与冻干的香菇135木屑常规培养料[同(4)]按 两种比例(40mg菌丝+160mg培养料和60mg菌丝+140mg培养料)混合，充分研磨，分别精 确称取10mg、20mg混合物，按(3)方法提取DNA，每个处理5个重复，实验结果如表10和表 11。表1040mg标准培养菌丝与160mg培养料混合的DNA浓度 表1140mg标准培养菌丝与160mg培养料混合的DNA含量 由表11知40mg标准培养菌丝与160mg培养料混合的DNA含量的误差范围在 1. 42% -7. 37%之间。 表1260mg标准培养菌丝与140mg培养料混合的DNA浓度
表1340mg标准培养菌丝与160mg培养料混合的DNA含量关系 由表13知60mg标准培养菌丝与140mg培养料混合的DNA含量的误差范围在 0. 02% -4. 88%之间。归纳两种混合比例结果如表14。表14香菇135菌棒培养基质与标准菌丝混合的DNA含量关系 将⑷和(5)的结果比较，确定该种基质对DNA提取的影响。即基质对DNA提取的影响率=(理论值-测定值)/理论值理论值=标准培养香菇纯菌丝DNA含量X纯菌丝与相应基质混合百分比+相应 基质DNA含量X (1-纯菌丝与相应基质混合百分比)测定值=菌丝与相应基质混合物的实测值。两种混合比例分别取样10mg、20mg混合物所对应的基质影响见表15。表15基质对DNA含量的影响 由表15可知香菇135菌丝培养物对香菇135菌丝DNA提取的平均影响率为 0. 03。(6)待测样品中香菇135菌丝生物量的确定香菇135三角瓶培养物中香菇135菌丝生物量的确定按香菇135木屑常规培养料配方[同(4)方法]，制作三角瓶(250mL，装料量为 120-130g)培养料5瓶，接入新鲜的香菇135菌丝，于25°C恒温箱中培养，待菌丝长满料(培 养18天)后，取香菇135三角瓶中的培养物混勻，称取15g，于-20°C冰箱冷冻至固态，转入 冷冻干燥机(Heto Power Dry PL3000)充分干燥，充分研磨后，准确称取10mg、20mg冻干物， 按步骤(3)的方法提取DNA，每个处理5个重复，实验结果如表16和表17。表16香菇135三角瓶培养物的DNA浓度 表17香菇135三角瓶培养物的DNA含量 据表17结果与步骤(3)、(4)、(5)结果比较，知香菇135菌丝培养至18天时每 mg干燥培养物中含香菇135菌丝的生物量为0. 00701mg。香菇135培养物测定的误差在 0. 44% -4. 79%之间，未超出标准曲线的误差范围，故此次测定误差小于14%。据此结果可知，此方法可用于在混合基质中测定食用菌菌丝生物量。
权利要求
一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法，包括下列步骤(1)培养标准菌丝取待测食用菌斜面培养物，活化后打碎，接入新鲜的标准液体培养基中，摇床培养至菌丝稳定期；(2)菌丝处理过滤上述菌丝，无菌水冲洗，冷冻并充分干燥；(3)构建标准曲线将步骤(2)处理后的菌丝迅速研磨，梯度称取后置于容器中，用CTAB法提取DNA，NANODROP 1000紫外分光光度计确定DNA量，构建提取DNA量和提取用菌丝量的关联标准曲线；(4)相应基质DNA水平确定取相应基质，用CTAB法提取DNA，NANODROP 1000紫外分光光度计确定基质DNA本底水平；(5)培养菌丝与基质混合，确定相应基质对DNA提取的影响称取步骤(2)处理后的菌丝与上述基质混合，用CTAB法提取DNA，NANODROP 1000紫外分光光度计确定DNA量，与步骤(3)和(4)的结果比较，确定该种基质对DNA提取的影响；(6)待测样品中食用菌菌丝生物量的确定取待测样品，充分干燥，研磨，定量秤取后用CTAB法提取DNA，NANODROP 1000紫外分光光度计确定DNA量，对照标准曲线、基质本底和基质影响，确定含有基质的样品中食用菌菌丝的生物量。
2.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法，其特征在于所述步骤(1)中的菌丝为香菇135菌丝。
3.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法，其特征在于所述步骤(1)中的标准液体培养基为PDB培养基。
4.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法，其特征在于所述步骤(2)中的处理后的菌丝含水量接近零，且DNA在冷冻的条件下 不易降解。
5.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法，其特征在于所述步骤(2)使用冷冻干燥机充分干燥。
6.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法，其特征在于所述步骤(3)中用CTAB法提取DNA，每处理5个重复。
7.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法，其特征在于所述步骤(4)中相应基质包括主料和辅料，其中主料为木屑、稻草、棉籽 壳、甘蔗渣、玉米芯或麦秸，辅料为麸皮、米糠或豆饼。
8.根据权利要求1或7所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物 量的方法，其特征在于所述的相应基质取木屑先浸泡12-24h，再与麸皮混合，调整含水量 至50% -60%，灭菌，然后冷冻至固态，再充分干燥。
9.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法，其特征在于所述步骤(5)中的菌丝与相应基质的质量比为1 4或3 7。
全文摘要
本发明涉及一种通过检测DNA浓度测定基质中食用菌菌丝生物量的方法，包括(1)培养食用菌纯菌丝；(2)过滤菌丝，冲洗，冷冻并充分干燥；(3)梯度称取菌丝，提取DNA，构建关联标准曲线；(4)取相应基质，提取DNA，确定基质DNA本底水平；(5)取菌丝与基质混合，提取DNA，确定DNA量，与步骤(3)和(4)的结果比较，确定该种基质对DNA提取的影响；(6)取待测样品，提取DNA，确定DNA量，对照标准曲线、基质本底和基质影响，确定含有基质的样品中食用菌菌丝的生物量。本发明的方法简单，耗时短，高效、准确，一经检测系统确定可对相应培养模式或生长环境中的食用菌菌丝生物量进行长期、稳定的监测。
文档编号G01N21/33GK101914630SQ20101027583
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者余昌霞, 曹晖, 汪虹, 陈明杰 申请人:上海市农业科学院