专利名称：一种bac dna指纹分析的标记方法
技术领域：
本发明涉及一种用于BAC-DNA指纹分析的标记方法，具体地说是采用普通Taq DNA聚合酶和一种新的荧光分子标记的dUTP (Gold 525dUTP)，可以对酶切后的BAC DNA (细菌人工染色体DNA)片段进行标记，然后用于ABI系列的测序仪上进行DNA片段分析的方法。
背景技术：
DNA是地球上各种生物的遗传物质基础。限制性核酸内切酶可以切割DNA分子， 而且每一限制性核酸内切酶都有固定的切点序列。由于不同生物群体的DNA序列千差万别，因而用同一限制性内切酶消化后，所得DNA片段的长度分布也是千变万化的；同时DNA 分子中核苷酸排列顺序的变化有可能使该酶切位点丢失或增加，或者酶切片段的长度增加或减少。这种酶切片段长度分布的多样性就称为限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)，RFLP常用于生物群体的遗传分析。近年来，基于 RFLP的原理，发展了一系列的DNA片段分析技术，如聚合酶链反应/限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)，扩增片段长度多态性(Amplification Fragment Length Polymorphism, AFLP)，限制性酶切指纹图谱(FingerprintMap)等，这些新技术使DNA片段多态性分析更为快速和完善，同时应用也越来越广泛。限制性酶切指纹图(Fingerprint Map)是指限制性酶切位点在DNA分子上的分布图，DNA分子上的酶切位点可以作为一种DNA标记定位的特征区域。基于限制性酶切指纹重叠群图谱(Fingerprint Contig Map)是将一套部分重叠的大片段基因组DNA分子(Yeast artificial chromosome YAC, Bacterial artificial chromosomeBAC克隆等的插入片段) 依其在染色体上的位置顺序排列，不间断地覆盖着染色体上一段完整的区域。重叠群图谱是目前最常见的物理图谱，因为重叠群就是克隆之间的相互重叠关系，这是物理图的基本框架，然后借助染色体特异性的分子标记可将重叠群定位在染色体上。目前构建重叠群物理图谱主要方法是用毛细管电泳法来分析BAC DNA(Bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体DNA)片段的大小，一般首先用3-4个6碱基识别位点的限制性内切酶酶切DNA以产生不同的3'粘性末端，然后用荧光染料标记；另外一个4碱基识别位点酶消化DNA后产生5'平末端，该酶主要用于增加酶切片断的数量。然后酶切产物连同分子内标在DNA分析仪上进行毛细管电泳，电泳过程中电脑自动捕获荧光信号得到DNA片段大小的信息，经编辑后用FPC软件进行重叠群的组装(Luo M. C.，Thomas C. , You F. Μ. , Hsiao J. , Ouyang S. , Buell R. , Malandro Μ. , McGuire P. Ε. , Anderson 0. D. ,and Dvorak J. ,2003,High-throughput fingerprinting of bacterial artificial chromosomes using theSNaPshot labeling kit and sizing of restriction fragments by capillary electrophoresis, Genomics, 82 (3) :378-389)。该方法具有序列分析胶的高分辨率，但又免去了序列分析胶法的放射自显影步骤，省去了目力识带及随之带来的误差， 因而具有高通量、自动化的特点。
目前采用荧光标记BAC DNA片段制作限制性酶切指纹图的方法主要有两种1.采用SNaPSiot试剂盒，这是Applied Biosystems公司开发的一种试剂盒，它带有4种荧光染料标记的 ddNTP,分别是 R6G-ddATP(绿色)，TAMRA-ddCTP(黄色)，RllO-ddGTP(蓝色)，ROX-ddTTP(红色)；实验中用4个6碱基识别位点的限制性内切酶酶切DNA以产生 4种不同的3'粘性末端，然后在FS AmpliTaq DNA聚合酶的作下标记用4种荧光染料分别标记不同的粘性末端。该方法能得到较多的条带，结果较精确；但成本很高，每个样品的花费在3美元左右。2.采用单色标记法，即一种荧光染料标记每一个克隆的所有粘性末端，通常采用HEX-ddATP (绿色)或NED-ddATP (黄色)来标记。该方法较SNaPShot试剂盒法简单，同时可以在一个通道(毛细管)中检测2个样品，虽然检测到的条带较前者少，但结果同样精确甚至更好(Xu Z. Y.，van den Berg Μ. Α.，Scheuring C.，Covaleda L. , Lu H. , Santos F. Α. , UhmT. , LeeM. , Wu C. , Liu S. , and Zhang H. , 2005, Genome physical mapping fromlarge-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis -.a robustphysical map of Penicillium chrysogenum, Nucleic Acids Research, 33 (5) :50-57)，并且成本较低每个样品大约在1美元左右。然而HEX-ddATP和 NED-ddATP非常昂贵并且没有商品出售，很难得到。
发明内容
本发明采用普通Taq DNA聚合酶和一种新的荧光分子标记的dUTP (Gold 525dUTP)，可以对酶切后的BAC DNA片段进行标记，然后用于Applied Biosystems公司的 ABI系列测序仪上进行DNA片段分析。它是采用单色标记法，但可以避免使用SNaPS1Ot试剂盒或HEX-ddATP，NED-ddATP等昂贵的荧光染料和FS AmpliTaq DNA聚合酶，得到更精确的结果同时降低了成本，每个样品大约4-5元人民币(0. 6-0. 7美元)。本发明的主要原理为(1)设计一组包括一个4碱基识别位点和3-4个6碱基识别位点的限制性内切酶的组合，酶切BAC DNA产生带有3'粘性末端的片段；(2)在Taq DNA 聚合酶的作用下，3'粘性末端被相应的dNTP补平，在此过程中Gold525dUTP (绿色)被结合到末端上，同时该DNA片段的也实现了荧光标记。(3)随后标记了荧光染料的片段被纯化，通过毛细管电泳检测得到该片段的限制性酶切指纹，实现片段分析。本发明涉及一种新的用于BAC DNA指纹分析的标记方法，其中的试剂包括如下 (1)-(3)(1)酶切混合液包含IX酶切缓冲液；lmg/ml BSA(牛血清白蛋白)；限制性内切酶每种IU ；超纯水。其中BSA和限制性内切酶使用NewEnglandBioLabs公司产品，酶切缓冲液使用所选的几种限制性内切酶在其中都具有100%活性的缓冲液(如使用Hindlll、XbaI, XhoI和 HeaIII四种限制性内切酶时，则选用Buffer2)。 (2)标记用的dNTP混合物混合物内的四种脱氧核糖核酸的摩尔比为dATP dGTP dCTP Gold 525dUTP =4 4 4 1。其中 dATP、dGTP、dCTP 购自 Promega 公司；Gold 525dUTP 购自 Enzo Life Sciences 公司.(3)标记混合液7μ L 体系中包括 IOXPCR buffer 2 μ 1 ；25mM MgCl2L 6 μ 1 ；12. 5 μ M 带有 Gold 525dUTP 的 dNTP 混合物 0. 05 μ 1 ;5U/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 16 μ 1 ；超纯水3^9μ1。其中Taq DNA聚合酶及其10 X PCR buffer和MgCl2购自Promega公司。本发明建立了一种新的荧光分子标记DNA片段的方法，可以对酶切后的BAC DNA 或者普通DNA片段进行标记，然后用于ABI 310,3100,3130或3730等ABI系列测序仪上进行DNA片段分析。本方法与SNaPSiot试剂盒相比，主要优势在于没有使用R6G_ddATP、 TAMRA-ddCTP、R110_ddGTP、ROX-ddTTP 四种荧光染料和 FS AmpliTaqDNA 聚合酶等昂贵试剂，成本大大降低；另外SNaPShot试剂盒需用EcoR I、Xba I、BamH I,XhoI和HeaIII五种限制性内切酶，而本方法一般需要3-4种内切酶即可。同时由于SNaPS1Ot试剂盒使用的五种限制性内切酶难以找到合适的缓冲液使得每种内切酶都完全发挥作用，容易产生星号活性和不完全酶切，使得得到的片段的真实性受到影响；再者，由于内切酶和染料颜色种类多，得到的片段数量多，使得最后片段分析和组装的复杂性大大增加，结果的准确性受到影口向(Xu Z. Y.，van denBerg Μ. Α.，Scheuring C.，Covaleda L，Lu H.，Santos F. Α.，Uhm Τ.， LeeM. ，Wu C. ，LiuS. ，and Zhang H. ，2005，Genome physical mapping from large-insert clones byfingerprint analysis with capillary electrophoresis :a robust physical map of Penicilliumchrysogenum, Nucleic Acids Research，33 (5) :50-57)。本方法使用 3-4种内切酶和一种荧光染料，大大简化了实验过程，实验结果更为准确。与HEX-ddATP或NED_ddATP标记法相比，本方法同样也是采用单色标记法，但 HEX-ddATP、NED-ddATP类的荧光染料和FS AmpliTaq DNA聚合酶价格昂贵并且不易得到； 而本方法所用的Gold 525dUTP和TaqDNA聚合酶价格相对便宜且容易得到。另外使用 HEX-ddATP或NED-ddATP标记法时，一般是一根毛细管同时分离两个样品(Wu C，Sun S，Lee M-K, Xu Z, Ren C, Santos, TS, Zhang H-B :ffhole-genome Physical Mapping :An Overview on Methods for DNA Fingerprinting. In The Handbook of Plant Genome Mapping Genetic and Physical Mapping. Edited by :Meksem K and Kahl G. Wiley-VCH Verlag GmbH, ffeinheim, Germany ；2005 :257-284)，两种样品虽然是不同颜色的荧光染料标记，但仍容易互相干扰，影响结果的准确性，而本方法中，一根毛细管每次只运行一个样品，不会受其他样品干扰，因此本方法降低成本的同时会到更精确的结果。本方法主要用于制作BAC DNA限制性酶切指纹构建物理图谱，当前物理图的构建已成为基因组学研究的一个活跃领域。特别是为那些由于缺乏合适的作图群体而不能建立起遗传图的物种提供了一个重要的从事基因组学研究的平台，也为全基因组测序组装和比较基因组学的研究提供了重要的工具。另外本方法也可以用于其它DNA片段分析研究工作。
图1为使用本标记方法实施例中得到的3个BAC DNA(a,b, c)的酶切指纹片段峰图 (在GeneMapper4. O软件下显示)，绿色峰为荧光染料Gold 525发出的荧光被ABI 3130x1 测序仪检测得到的信号。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。实施例1.配制dNTP混合物取四种脱氧核糖核酸dATP (IOOmM)，dGTP (IOOmM), dCTP (IOOmM), Gold 525dUTP (25mM)，等体积混合，稀释至12. 5 μ M (对Gold 525dUTP而言)，四种脱氧核糖核酸的摩尔比为 dATP dGTP dCTP Gold 525dUTP = 4 4 4 1。分装成小管，_20°C 避光保存。2待检样品BAC DNA的提取按照文献(萨姆布鲁克、拉塞尔著，黄培堂译.2002.分子克隆实验指南(第三版).科学出版社，345-347)所描述的方法进行。具体为A.将BAC文库接种到96深孔板中培养过夜，用Eppendorf 5810R离心机 3250rpm 4°C离心lOmin，弃上清液；B.每个样品悬浮于 60 μ L 溶液 I 中(0. 25mM Tris ρΗ8· 0 ； IOmM EDTA 0. Iml ；50mM 葡萄糖)置冰上5min ；C.加入 120 μ L 溶液 II(200mMNa0H ；1% SDS)，轻轻混勻，置冰上 5min ；D.加入60 μ L溶液III (3M醋酸钾；28. 5%冰醋酸pH4. 8)，轻轻混勻，置冰上 IOmin ；E.将样品以 3250rpm 4°C离心 30mm ；F.取上清并与0. 6倍体积的异丙醇混合，置-80°C 30min ；G. 3250rpm 4°C离心 30mins，弃上清；H.沉淀加 200 μ L70%冷(_20°C左右)乙醇，3250rpm 4°C离心二次，每次 15min ；I.空气干燥DNA，溶于10 μ LTE缓冲液中，即为待测样品BAC-DNA，_20°C保存。3. BAC DNA的酶切和标记A.在 IOyLBAC DNA (0. 5-1. 5 μ g/μ L)样品中加入 3yL 酶切混合物 (1. 3μ IlOXbuffer 2,0. 13 μ 1100mg/ml BSA，限制性内切酶 Hind III、Xba I、XhoI 禾口 Hea III，每种1U，前面三种试剂都为New England BioLabs公司产品；加超纯水补足3 μ 1)，混合均勻，37°C水浴放置酶切2h，置于冰上；B.每样品加入 7μ L 标记混合物(10XPCR buffer 2 μ 1 ；25mM MgC121. 6μ 1 ； 12. 5μΜ dNTPmix(dATP dGTP dCTP Gold 525dUTP = 4 :4:4: 1)0. 05 μ 1 ；5U/ μ ITaqDNA聚合酶0. 16 μ 1 ；超纯水3. 29 μ 1), 65°C水浴放置lh，置于冰上；C.每样品加2 μ 1的醋酸钠(5. 2Μ，ρΗ5. 2)和70 μ 1无水乙醇，混合均勻，置_80°C 或-20°C放置 30min ；D. 3250rpm 4°C离心 30min 沉淀 DNA ；E.倒去上清，加0. 2ml 70%冷(_20°C左右)乙醇4°C 3250rpm离心二次，每次 15min ；F.倒去上清后，DNA沉淀在超净台中干燥15-30min。4.片段分析检测在每个样品中加入9. 85 μ L去离子甲酰胺和0. 15 μ L Rox 500 Size Standard (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)，在金属浴上 95°C变性 3_5min，然后按照操作要求在Applied Biosystems公司的ABI 3130x1测序仪上进行片段分析。得到的BAC DNA酶切指纹片段在GeneMapperi 0软件下显示如附图1所示。图1为使用本标记方法实施例中得到的3个BAC DNA(a, b, c)的酶切指纹片段峰图(在GeneMapperi 0软件下显示)，绿色峰为荧光染料Gold 525发出的荧光被ABI 3130x1测序仪检测得到的信号。 其优点是灵敏度高、速度快、高通量而且成本低。
权利要求
1.一种BAC DNA指纹分析的标记方法，其特征在于1)将BACDNA样品采用限制性内切酶进行酶切，得酶切的BAC DNA片段；2)采用一种荧光标记的dUTP和TaqDNA聚合酶对酶切后的BAC DNA片段进行标记，然后即可用于ABI测序仪上进行DNA片段分析。
2.按照权利要求1所述的标记方法，其特征在于步骤1)将BACDNA样品采用2_6种不同种类的限制性内切酶进行酶切，得酶切的BAC DNA片段。
3.按照权利要求2所述的标记方法，其特征在于2-6种不同种类的限制性内切酶包括1种4碱基识别位点的内切酶和1-5种6碱基识别位点的内切酶。
4.按照权利要求1所述的标记方法，其特征在于步骤2)中的dUTP为Gold525dUTP。
5.按照权利要求1所述的标记方法，其特征在于DBAC DNA的酶切和标记的具体过程为A.在10μ L浓度为0. 5-1. 5 μ g/ μ L BAC DNA样品中加入3 μ L酶切混合物(10 X限制性内切酶buffer 1. 3μ 1 ； lOOmg/mlBSAO. 13 μ 1 ；相应的2-6种不同种类的限制性内切酶每种IU ；加超纯水补足3 μ 1)，混合均勻，37 °C水浴放置酶切1. 5-2. 5h，置于冰上；B.每样品加入7yL标记混合物(10XPCRbuffer 2μ 1 ；25mM MgCl2L 6 μ 1 ；含有 12. 5 μ M Gold 525dUTP 的 dNTP 混合物 0. 05 μ 1 ;5U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶 0. 16 μ 1 ；超纯水 3. 29 μ 1)，65°C水浴孵育45min-l. 5h，置于冰上；C.每样品加2μ1的醋酸钠(5. 2Μ，ρΗ5. 2)和70 μ 1无水乙醇，混合均勻，置_80°C 或-20°C放置 30min ；D.3250-4000rpm 4°C离心 30min 沉淀 DNA ；E.倒去上清，加0.2ml 70%冷乙醇4°C 3250rpm离心二次，每次15min ；F.倒去上清后，DNA沉淀在超净台中干燥15-30min；2)指纹分析检测在每个样品中加入9. 85 μ L去离子甲酰胺和0. 15 μ LSize Mandard，在金属浴上95°C 变性3-5min，然后按照操作要求在ABI系列测序仪上进行片段分析。
6.按照权利要求5所述的标记方法，其特征在于该方法中所使用的dNTP混合物中的四种脱氧核糖核酸的摩尔比为dATP dGTP dCTP Gold 525dUTP = 4 :4:4: 1。
全文摘要
本发明属于DNA片段分析技术，具体地说是采用普通的Taq DNA聚合酶和一种新的荧光分子标记的dUTP(Gold 525 dUTP)，可以对酶切后的BAC DNA片段进行标记，然后用于ABI系列测序仪上进行DNA指纹片段分析的方法。所用主要试剂包括限制性内切酶、限制性内切酶缓冲液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶缓冲液、包含荧光染料Gold 525 dUTP的dNTP混合物。该方法可用于包括BAC DNA指纹分析在内的所有DNA片段分析。其优点是灵敏度高、速度快、高通量而且成本低。
文档编号G01N21/64GK102399856SQ20101028013
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者张晓军, 李富花, 王兵, 相建海, 赵翠, 郇聘 申请人:中国科学院海洋研究所