专利名称：一种定量分析蛋白质间相互作用的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域中蛋白质间相互作用的定量分析方法，特别是涉 及一种将双荧光素酶(萤火虫荧光素酶Firefly Luciferase，Flue和海肾荧光素酶 RennilaLuciferase, Rluc)用于定量分析蛋白质间相互作用的方法及其应用。
背景技术：
蛋白质间相互作用是各种生理活动的基础，与细胞的各种生命活动紧密相关。由 于很多疾病的发生与细胞内过强或过弱等不正常的蛋白质间的相互作用密切相关，很多药 物也通过调节蛋白质间相互作用的强弱实现治疗作用，因此，研究蛋白质间的相互作用，能 更好地理解各种疾病的发病机制、并发现新的药物作用靶标。鉴定蛋白质相互作用的方法多种多样。经典的免疫共沉淀(Co-IP)、Pull down技 术只能对蛋白质相互作用进行半定量分析。酵母双杂交、荧光共振能量转移(FRET)、生物发 光共振能量转移(BRET)、表面等离子体共振(SPR)、串联亲和纯化技术(TAP)、蛋白质片段 互补分析(PCA)和双分子荧光互补技术(BIFC)等方法，可用于鉴定体内外蛋白质之间的相 互作用。基于化学发光定量检测蛋白质相互作用的方法有PCA、LUMIER和LuMPIS等，PCA 只能对两种蛋白发生相互作用的总量进行确定，无法对发生相互作用的其中任何一种蛋白 进行定量；LUMIER和LuMPIS仅能对发生相互作用的其中一种蛋白进行定量。尽管上述各种方法的综合应用已经鉴定了成千上万种蛋白质的相互作用，但很多 蛋白质间的精确定量信息仍然未知，例如相互作用的各种蛋白质的量、它们之间的相对分 子数、以及发生相互作用蛋白与细胞内所有同种蛋白的比例等。精确定量分析蛋白质间的 相互作用的方法的缺乏，仍然制约着对包括致病机制在内的很多生物学过程的理解。因此， 发展简单、灵敏、高效、定量分析蛋白质间的相互作用的新方法仍然亟待研究探索。荧光素酶(Luc)是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称。双荧光素酶报告基因 (DLR)检测系统是Promega公司开发的，应用两种不同底物同时定量检测两种荧光素酶活 性的生物发光分析系统，可对同一样品中的两个报告基因-Flue和Rluc的表达水平同时进 行定量测定。样品与底物混合后，能在20秒内完成DLR定量检测，灵敏度在pg级，是灵敏 度为ng级的Western Blot的约103倍，因此该系统具有快速、灵敏、简便的优点。DLR通常 用于研究启动子、增强子的活性和研究基因表达调控的机制。检测基因表达时通常将双报 告基因(即带有实验报告基因的载体和带有不同的报告基因作为内对照的载体)共转染细 胞，报告基因表达活性的改变反映启动子转录活性的改变，实验中作为内对照的第二个报 告基因，能使实验报告基因的检测均一化，从而减少实验的变化因素，提高实验的准确性。由于双荧光素酶检测系统(DLR assay system)能快速、简便、灵敏地对裂解细胞 中两种荧光素酶的表达水平进行定量检测，因此用DLR assay取代蛋白质相互作用传统研 究方法Pull down中的蛋白检测步骤，建立一种无需SDS-PAGE、无需Western Blot、无需杂 交抗体，同时又能定量检测蛋白质之间相互作用的快速、灵敏、简便的新方法，在理论上存 在可能性。
那么如何才能用DLR assay取代Pull down实验中的蛋白检测步骤？可通过将 Flue和Rluc分别与Pull down的目的蛋白X和预测蛋白Y分别融合表达，融合蛋白在细胞 内或细胞外孵育后进行纯化，通过定量检测纯化得到的Flue和Rluc活性则可确定蛋白X、 Y之间发生相互作用的情况。如果预测蛋白Y与目的蛋白X之间存在相互作用，Y通过与X 的结合而被检测到，用DLR assay可对与磁珠结合的Fluc-X和Rluc-Y融合蛋白的Flue、 Rluc活性进行高灵敏定量检测，相互作用越强，沉淀下来的Rluc相对于Flue的比值就会越 高。反之，如果预测蛋白Y与目的蛋白X之间不存在相互作用，沉淀下来只有Fluc-X融合 蛋白，没有Rluc-Y融合蛋白，双荧光素酶系统就只能定量检测到Flue活性，而不能检测到 Rluc活性。
发明内容
本发明提供了一种简单、快速、灵敏的定量分析蛋白质间相互作用的方法。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种定量分析蛋白质间相互作 用的方法，是将Flue和Rluc分别与要定量分析相互作用的目的蛋白X和预测蛋白Y融合 表达，融合蛋白F1UC-X、R1UC-Y结合纯化后用DLR对相互作用蛋白的量进行精确定量，并对 表达蛋白的总量进行精确定量，还可对相互作用蛋白之间的分子数量比例进行定量。所述定量分析相互作用的对象目的蛋白X与预测蛋白Y可以是任何蛋白、多肽或 其它能与Flue、Rluc藕联的化合物。所述将Flue和Rluc分别与目的蛋白X和预测蛋白Y融合表达的方法为先构建 Fluc-X融合蛋白表达载体和Rluc-Y融合蛋白表达载体，再使融合蛋白共表达或分别表达 再进行体外共同孵育。所述Flue和Rluc与蛋白X和Y的融合方式可以通过N端和C端分别进行。具体来讲，所述融合蛋白Fluc-X表达载体为生物素化融合蛋白表达载体，是将 Flue基因插入真核表达载体pHAVI形成的报告基因表达载体，X蛋白基因与Flue基因融合 后得到。所述融合蛋白Rluc-Y表达载体是Rluc基因插入真核表达载体pCI-Flag形成的 报告基因表达载体，Y蛋白基因与Rluc基因融合后得到。所述生物素化融合蛋白Fluc-X表达载体和融合蛋白Rluc-Y的报告基因表达载体 的表达可在细菌、体外细胞水平表达，或通过转基因的方式在动物体内细胞中表达，也可通 过体外翻译系统进行合成表达。所述融合蛋白Fluc-X或Rluc-Y的纯化，可以通过在融合蛋白上添加标签分子，如 生物素、6xHis、MBP或Flag等其它所有可用的标签分子，通过标签分子与其配基或抗体的 特异性结合进行纯化。或者不添加标签，直接用Flue、Rluc抗体或针对融合蛋白的抗体进 行纯化。本发明的另一个目的是提供一种定量分析蛋白质间相互作用的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，包括生物素化Flue融合表达载体pHAVI、Rluc融合表达 载体pCIRl-Flag和链亲和素磁珠。本发明提供一种将双荧光素酶(萤火虫荧光素酶Firefly Luciferase，Flue和海 肾荧光素酶Rermila Luciferase, Rluc)用于定量分析蛋白质间相互作用的方法。由于纯化得到的Flue和Rluc融合蛋白与蛋白Y与X之间相互作用的强弱和加入样品总量相关，因 此该方法能对蛋白质之间的相互作用进行精确定量测定。本发明建立的方法不仅能对发生 相互作用的任何一种蛋白、两种蛋白总量进行定量，而且能对细胞中表达的待鉴定相互作 用的两种蛋白分别进行定量，可用于对发生相互作用的其中一种蛋白与它在细胞中表达蛋 白总量的比例进行精确定量。这种定量分析方面的优势是现有方法所不具备的，能够避免 由于蛋白表达量的变化造成的假阴性和假阳性的出现。该方法能同时定量测定相互作用蛋 白，即不同荧光素酶融合蛋白(目的蛋白Fluc-X和预测蛋白Rluc-Y)的绝对量，具体的，该 应用是通过用DLR试剂盒定量测定纯化得到的Fluc-X融合蛋白和Rluc-Y融合蛋白的DLR 活性，从而对蛋白Y与X之间相互作用的强弱进行定量评价，可用于确定蛋白质的功能等、 研究与疾病相关的分子致病机制、发现鉴定新的药物作用靶标等。利用本发明提供的定量 分析蛋白质相互作用方法，可快速、灵敏、简便、定量分析蛋白质间的相互作用，具有较高的 实际应用价值，在生物学、医药、化学等领域具有广阔的应用前景。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为本发明定量分析蛋白间相互作用的方法示意2A为DLR定量分析Flue和Rluc之间相互作用结果-细胞裂解液中的Flue和 Rluc活性图2B为DLR定量分析Flue和Rluc之间相互作用结果-链亲和素磁珠结合的Flue 和Rluc活性图3为DLR定量确定Rluc/Fluc活性比系数结果图 4 为 Western blot 鉴定 HAVI-Fluc，HAVI-Fluc-MAVS，Rluc，Rluc_TRAF3 在 293 细胞中表达图5A为DLR定量分析MAVS-TRAF3之间相互作用，表示Rluc_TRAF3能特异地结合 HAVI-Fluc-MAVS图5B为DLR定量分析MAVS-TRAF3之间相互作用，表示链亲和素磁珠结合的 Rluc-TRAF3 与 HAVI-Fluc MAVS 的活性比值图6为Pull down确证MAVS-TRAF3之间存在相互作用
具体实施例方式本发明是基于发明人发现的Flue和Rluc之间不存在相互作用的特性，构建了生 物素化Flue表达载体和Rluc表达载体，将要定量分析的蛋白X和Y分别插入上述载体，得 到生物素化Fluc-X融合蛋白表达载体和Rluc-Y融合蛋白表达载体，两种融合蛋白共表达， 或分别表达再进行体外共同孵育后，通过链亲和素包被的磁珠纯化生物素化Fluc-X，然后 用DLR测定纯化得到的Fluc-X融合蛋白和Rluc-Y融合蛋白的DLR活性。由于纯化的Flue 和Rluc的活性与加入融合蛋白的量和蛋白X、Y之间相互作用的强弱密切相关，因此该方法 可定量确定蛋白Y与X之间相互作用的强弱。下面以具体实施例详细说明本发明的设计。应该理解，以下实施例不构成对本发 明的限制，基于本发明的设计思想，实施中所述报告基因HAVI-Fluc-X和Rluc-Y融合蛋白指示载体的表达可在细菌中表达，也可在体外细胞水平表达，或通过转基因的方式在动 物体内表达。所述报告基因HAVI-Fluc-X和Rluc-Y的融合方式也可为HAVI-X-Fluc和 Y-Rluc。所述Fluc-X或Rluc-Y的纯化，可以通过在融合蛋白上添加标签分子，如生物素、 6xHis、MBP、或Flag等其它所有可用的标签分子，通过标签分子与其配基、或抗体的特异性 结合进行纯化。或者没有标签，直接用F1UC、R1UC抗体或针对融合蛋白的抗体进行纯化。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体操作中，PCR扩增中所 用的酶为Invitrogen公司产品，酶切、连接中所有限制性内切酶均为NEB公司产品，转化感 受态菌为Transgen公司产品，序列分析由奥科进行测定。实施例1、Flue与Rluc之间相互作用的定量分析如图1所示，本发明定量分析蛋白质间相互作用的方法包括以下步骤一、生物素化Flue表达载体和Rluc表达载体的构建pHAVI载体构建将EMCV IRES序列和birA基因通过SacII酶切位点连接，插入 pCIneo (Promega)的Smal和NotI酶切位点之间，然后将6xHis、Avi表位的编码序列插入 含EMCV IRES和birA的载体得到生物素化表达载体pHAVI。以pGL3_Basic(Promega公司)为模板，在引物Flue F和Flue R的引导下PCR扩增 得到Flue基因序列，Flue基因经Sail和Xhol双酶切，插入pHAVI载体的Xhol酶切位点，序 列分析证明获得了插入方向及序列均正确的生物素化Flue表达载体，命名为pHAVI-Fluc。Flue F:TC GTCGAC ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAFlue R :CG CTCGAG AGATCCAGAGCCCACGGCGATCTTTCCGCCCTT将Flag表位编码序列插入pCIneo (Promega)的Sail和NotI酶切位点之间构建 pCI-Flag表达载体。然后以pRL-TK (Promega公司)为模板，在引物Rluc F和RlucR的引 导下PCR扩增得到Rluc基因序列，Rluc基因经Nhel和Xhol双酶切，插入pCI-Flag载体 的Nhel和Xhol酶切位点之间，序列分析证明获得了插入方向及序列均正确的Rluc表达载 体,命名为 pCIRluc-Flag。Rluc F :AG GCTAGC ATGACTTCGAAAGTTTATGATRluc R :AG CTCGAG TTGTTCATTTTTGAGAACTCGCT二、生物素化Flue和Rluc在HEK293细胞中的表达在24 孔板中用真核表达载体 CMV_Fluc(Biotechnol Lett, 2009, 31 1151-1157)和 pCI-Rluc，pHAVI-Fluc 和 pCI-Rluc 分别共转染 HEK293 细胞。培养基 选用含有10%胎牛血清、25U/mL青霉素、25 ii g/mL链霉素的DMEM (GIBC0)。转染使用 LipofectamindOOOanvitrogen)，转染的步骤按照厂家说明书进行。转染24_48h后加入 收集细胞，PBS洗2次后，加入30ul 1XPLB (Promega)裂解细胞，细胞裂解液中DLR用DLR 试剂盒(Promega)在化学发光仪中进行测定。三、Flue与Rluc之间的相互作用确定20ul链亲和素磁珠PBS洗2次后重悬于50ul PBS中，加入2ul共表达Flue和 Rluc，或pHAVI-Fluc和Rluc的细胞裂解液，室温孵育lh后，用含Nonidet P-40的PBS 洗2次，PBS洗1次后，重悬于50ul PBS中用DLR试剂盒(Promega)在化学发光仪中进行测 定。结果Fluc/Rluc活性的比值在500-2000倍之间，说明链亲和素磁珠能与细胞裂解液中 的Flue结合并被定量检测到，但与之共表达的Rluc没有结合(图2A表示细胞裂解液中的Flue和Rluc活性，图2B表示链亲和素磁珠结合的Flue和Rluc活性)，提示Flue和Rluc 之间不存在相互作用。该检测结果说明用DLR assay对发生相互作用的蛋白进行定量，不 但在理论上存在可能性，而且在实践上可行，能操作，为应用DLR定量分析蛋白质相互作用 新方法的建立提供了最关键的实验数据支持，同时优化了定量分析方法的实验步骤。三、Rluc/Fluc的活性比率确定将Flue用Xhol和Smal酶切，插入pCIRluc_Flag的Xhol和EcoRV位点之间得到 pCIRluc-Fluc 载体。将 Rluc 用 Xbal 和 Smal 酶切，插入 pHAVI-Fluc 的 Xhol 和 EcoRV 位点 之间得到pHAVI-Fluc-Rluc载体。在24孔板中用真核表达载体pCIRluc-Fluc和pHAVI-Fluc-Rluc转染HEK293细 胞，转染24-48h后收集细胞并用30ul PLB裂解。2ul细胞裂解液重悬于50ul PBS中，用 DLR试剂盒(Promega)在化学发光仪中进行测定。结果细胞裂解液中Rluc与Flue的活性 比值在13左右(参见图3)。说明用DLR assay不但能对发生相互作用的蛋白进行定量，而 且能精确确定相互作用蛋白的分子数量比例。实施例2、定量分析MAVS-TRAF3之间的相互作用本发明定量分析蛋白质间相互作用的方法包括以下步骤一、生物素化Fluc-MAVS表达载体和Rluc_TRAF3表达载体的构建将MAVS基因序列经Xhol和Mlul双酶切，插入表达载体pHAVI_Fluc的Xhol和 Mlul酶切位点之间，得到生物素化Flue表达载体pHAVI-Fluc-MAVS。TRAF3基因序列经Xhol和Mlul双酶切，插入表达载体pCIRluc-Flag的Xhol和 Mlul酶切位点之间，得到表达载体pCIRluc-TRAF3。二、生物素化Fluc-MAVS和Rluc_TRAF3在HEK293细胞中的表达鉴定用生物素化Fluc-MAVS表达载体和Rluc_TRAF3表达载体在24孔板中共转染 HEK293细胞。转染使用LipofectamindOOOanvitrogen)，转染的步骤按照厂家说明书进 行。转染48-72h后加入收集细胞，PBS洗2次后，加入15ul 1 XPLB (Promega)裂解细胞， 细胞裂解液中进行SDS-PAGE电泳，Western Blot用HRP标记的链亲和素和抗Flag抗体 (Abmart)进行检测。结果表明生物素化Fluc-MAVS和Rluc_TRAF3均正确表达(参见图4)。三、定量分析MAVS-TRAF3之间的相互作用在24 孔板中将 pHAVI-Fluc 和 pCIRluc，pHAVI-Fluc-MAVS 和 pCIRluc，pHAVI-Fluc 和 pCIRluc-TRAF3-Flag，pHAVI-Fluc-MAVS 和 pCIRluc-TRAF3_Flag 表达载体分别共转 染HEK293细胞。转染使用LipofectamindOOOanvitrogen)，转染的步骤按照厂家说明 书进行。转染24-48h后加入收集细胞，PBS洗2次后，加入30ul 1 XPLB (Promega)裂 解细胞，细胞裂解液中DLR用DLR试剂盒(Promega)在化学发光仪中进行测定。然后， 20ul链亲和素磁珠(Promega) PBS洗2次后重悬于50ul PBS中，加入2ul细胞裂解液，室 温孵育lh后，用含Nonidet P_40的PBS洗2次，PBS洗1次后，重悬于50ul PBS中 用DLR试剂盒(Promega)在化学发光仪中进行测定。结果显示Rluc_TRAF3能特异地结 合HAVI-Fluc-MAVS, DLR定量分析结果显示Rluc_TRAF3与结合的HAVI-Fluc_MAVS之间 的比值为228%，与HAVI-Fluc-MAVS结合的Rluc_TRAF3占细胞中全部Rluc_TRAF3蛋白 的 1. 8 % (图 5A 表示 Rluc-TRAF3 能特异地结合 HAVI-Fluc-MAVS,与 HAVI-Fluc-MAVS 结 合的R1UC-TRAF3占细胞中全部Rluc_TRAF3蛋白的1. 8%，图5B表示链亲和素磁珠结合的Rluc-TRAF3 与 HAVI-Fluc_MAVS 的活性比值为 228% )。四、Pull down验证MAVS-TRAF3之间的相互作用在6 孔板上用 pHAVI 和 Flag-MAVS，HAVI-TRAF3 禾P pCI-Flag，HAVI-TRAF3 和 Flag-MAVS 表达载体分别共转染 HEK293 细胞。转染使用 Lipofectamine2000(Invitrogen)， 转染的步骤按照厂家说明书进行。转染48-72h后加入收集细胞，PBS洗2次后，加入60ul lXPLB(Promega)裂解细胞。45ul细胞裂解液与200ul链亲和素磁珠(Promega)在室温孵 育lh后，用含RIPA缓冲液、RIPA高盐缓冲液、RIPA缓冲液(RIPA缓冲液150mM NaCl,50mM Tris,2mM EDTA, 1 % Nonidet P-40,0. 1% SDS,pH 8.0 ；RIPA高盐缓冲液500mM NaCl,50mM Tris,2mM EDTA, 1 % Nonidet P-40,0. 1% SDS,pH 8. 0)洗 3 次后，重悬于 lOul RIPA 中。样 品进行6%或8%的SDS-PAGE电泳，Western Blot用HRP标记的链亲和素和抗Flag抗体 进行检测。结果显示HAVI-TRAF3能特异地结合Flag-MAVS，说明MAVS-TRAF3之间存在相互 作用(图6，PD :SA表示用链亲和素磁珠Pull down, WCL表示细胞裂解液)，从而进一步证 明本发明的方法能用于定量分析蛋白质间的相互作用。实施例3、定量分析蛋白质间相互作用的试剂盒 将生物素化Flue融合表达载体pHAVI、Rluc融合表达载体pCIRl-Flag和链亲和 素磁珠共同包装，得到本发明定量分析蛋白质间相互作用的试剂盒。
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权利要求
一种定量分析蛋白质间相互作用的方法，是将Fluc和Rluc分别与要定量分析相互作用的目的蛋白X和预测蛋白Y融合表达，融合蛋白Fluc X、Rluc Y结合纯化后用DLR对相互作用蛋白的量进行精确定量，并对表达蛋白的总量进行精确定量，还可对相互作用蛋白之间的分子数量比例进行定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述定量分析相互作用的对象目的蛋白X 与预测蛋白Y可以是任何蛋白、多肽或其它能与Flue、Rluc藕联的化合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述将Flue和Rluc分别与目的蛋 白X和预测蛋白Y融合表达的方法为先构建Fluc-X融合蛋白表达载体和Rluc-Y融合蛋 白表达载体，再使融合蛋白共表达或分别表达再进行体外共同孵育。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述Flue和Rluc与蛋白X和Y的融合 方式可以通过N端和C端分别进行。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述融合蛋白Fluc-X表达载体为生物素 化融合蛋白表达载体，是将Flue基因插入真核表达载体pHAVI形成的报告基因表达载体， X蛋白基因与Flue基因融合后得到。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述融合蛋白Rluc-Y表达载体是Rluc基 因插入真核表达载体pCI-Flag形成的报告基因表达载体，Y蛋白基因与Rluc基因融合后 得到。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述生物素化融合蛋白Fluc-X表达载体 和融合蛋白Rluc-Y的报告基因表达载体的表达可在细菌、体外细胞水平表达，或通过转基 因的方式在动物体内细胞中表达，也可通过体外翻译系统进行合成表达。
8.根据权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于所述融合蛋白Fluc-X或Rluc-Y 的纯化，可以通过在融合蛋白上添加标签分子，如生物素、6xHis、MBP或Flag等其它所有可 用的标签分子，通过标签分子与其配基或抗体的特异性结合进行纯化；或者不添加标签，直 接用Flue、Rluc抗体或针对融合蛋白的抗体进行纯化。
9 权利要求1-8任一项所述方法在定量分析蛋白质间相互作用中或在确定蛋白质的 功能、研究与疾病相关的分子致病机制、发现鉴定新的药物作用靶标中的应用。
10.一种定量分析蛋白质间相互作用的试剂盒，包括生物素化Flue融合表达载体 pHAVI、Rluc融合表达载体pCIRl-Flag和链亲和素磁珠。
全文摘要
本发明公开了一种定量分析蛋白质间相互作用的方法及其应用。该方法是将Fluc和Rluc分别与要定量分析相互作用的目的蛋白X和预测蛋白Y融合表达，融合蛋白Fluc-X、Rluc-Y结合纯化后用DLR对相互作用蛋白的量进行精确定量，并对表达蛋白的总量进行精确定量，还可对相互作用蛋白之间的分子数量比例进行定量。利用本发明的定量分析蛋白质相互作用方法可快速、灵敏、简便、定量分析蛋白质间的相互作用，具有较高的实际应用价值，在生物学、医药、化学等领域具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/68GK101982778SQ201010285778
公开日2011年3月2日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者彭剑淳, 詹林盛, 贾帅争 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所