专利名称：一种采用微板和枯草芽孢杆菌检测抗生素残留的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于动物源食品，特别是鲜奶中抗生素残留检测的方法。
背景技术：
20世纪50年代人们发现将青霉素发酵残渣加入饲料中喂养动物能大幅度提高畜禽的生长速度以来，抗生素对于动物的促生长作用和它带来的经济效益得到了充分的证实，如今抗菌药物已成为畜牧业的必需品。欧美等发达国家都在使用抗生素添加剂，许多发达国家80%的畜产品都是用含抗生素添加剂的饲料生产出来的。由于抗生素添加剂具有节约营养、保持健康、提高生产性能等作用，因此，抗生素添加剂在推动近代畜牧，尤其是集约化畜牧业的发展起了十分重要的作用，对亚洲等发展中国家或地区更是如此。可以这样说，如果没有抗生素及合成抗菌药物，大多数亚洲国家的畜牧业就不会获得今天这么大的成就。但抗生素的使用同时也带来了一系列的问题，人们越来越关注农产品中抗生素对人体健康的不良影响，国际农产品贸易中常因抗生素残留问题引起国际贸易摩擦。随着我国全面建设小康社会步伐的不断推进，人民的生活水平的不断提高，人们对农产品安全问题也越来越得到重视。农产品中抗生素、激素残留污染问题已受到社会的广泛重视，农产品安全已成为当今影响广泛而深远的社会问题。抗生素残留对人体具有一定的，有时甚至是严重的毒副作用，如对链霉素过敏的机体，即使摄取了含极少量的链霉素的食物，都会导致过敏反应的发生，如果经常食用含低剂量链霉素的产品会使原来对链霉素不起过敏反应的个体致敏。发生过敏的机体会出现肌肉震颤、站立不稳、心跳加速、呼吸减弱等症状。严重者可引起休克、短时间内出现血压下降、皮疹、喉水肿、呼吸困难等严重症状，甚至危及生命。据统计，我国每年就有20万人死于药品不良反应，其中有40%也就是说有8万人死于抗生素的滥用。目前，我国畜产品总量已经达到了相当大的规模，全国肉类产量已占世界肉类总产量的1/4以上，但是我国肉类产品的出口量却很少，仅占左右，成了典型的生产的“巨人”，出口的“矮子”。我国畜产品出口不畅的原因主要是我国畜产品存在药物残留严重，品质不优，达不到进口国家的要求。这是我国畜产品在欧美市场屡屡爱阻的主要原因。细菌物在反复接触某一抗生素后，植物体内的敏感菌株可能会受到选择性抑制， 而使耐药菌株大量繁殖。人在经常食用含抗生素残留的农产品后，植物体内的耐药菌株可通过农产品传播给人体。日本、美国、德国、法国和比利时学者研究证明，在乳、肉和动物脏器中都存在耐药菌株，当这些食品被人食用后，耐药菌株就可能进入到人的消化道内，当人体发生疾病时，再用同种抗生素治疗很难奏效，给临床上的治疗带来一定的困难。近年来随着动物疫病、农作物病害的不断增加和抗性不断增强，抗生素的使用亦日趋泛滥，使其在动物性食品、农产品中过量残留已成为危害人类身体健康的公共卫生问题，并严重影响到贸易出口，从而受到国内外的普遍关注。因此，如何对动物性食品、农产品中残留的抗生素进行特异、灵敏、快速的检测已成为一个研究热点。澳大利亚、加拿大、丹麦、德国、波兰、瑞士、英国、美国、菲律宾、日本等国家和我国港、台地区均开展了抗生素药物残留检测研究工作，并制定了相应的检测方法及残留限量。我国政府也高度重视这方面的工作，并相继立项对残留在食品中的多中抗生素进行分检测研究。抗生素检测总体上可以分为三大类理化分析法(波谱法、色谱及联用技术)、免疫法(放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法)以及生物测定法(微生物测定法、放射受体测定法)。理化分析法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量， 该方法对抗生素进行定性、定量测量，灵敏度高，但是一般需要昂贵的仪器设备、大量复杂的前处理、熟练的技术人员及较长的分析周期，而且只能用于单个样本的检测，因而不常用。免疫分析法是近年来发展起来的检测动物源食品中抗生素残留的方法，这种方法具有操作简单、前处理简化、分析成本低、灵敏度高、特异性强、检测快速、不需要昂贵的仪器等优点。而且还可以同时测定几个样品，但此方法不可避免地也存在着一些缺陷，对试剂的选择性高。很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。微生物检测法根据抗生素对微生物的抑制作用来定性或者定量确定样品中抗生素的残留。这类方法可靠性高、操作简单、费用低，反应灵敏，只需要几个小时的培养就能观察到结果，还有特异性的特点，如蜡状芽孢杆菌对四环素类敏感，枯草芽孢杆菌对氨基糖苷类敏感。此外，一些微生物有特定的用处，如嗜热脂肪芽孢杆菌对多种抗生素敏感、生长速度快、培养温度高，对其他菌污染少等特点。微生物法为目前抗生素检测最常用的方法，目前该方法比较成熟的有牛津杯，但是牛津杯法工作量较大，反应时间较长，要左右，一个培养皿只能检测一个样品等缺点，目前比较新颖的微生物检测方法为微板法，该方法方便快捷，工作量小，反应快速，只需要培养池左右就有颜色变化，此外一个板可以检测多个样品，对多个样品检测时优势较大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是建立一种简单、快速、灵敏度高、能够普遍推广应用的抗生素残留微生物检测方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是⑴菌种活化准备牛肉膏蛋白胨培养基备用，在无菌条件下，挑取一环枯草芽孢杆菌用划线法接种至牛肉膏蛋白胨斜面，放入的恒温培养箱中培养Mh。本次试验复苏后的菌种在 1-2天后使用。(2)摇菌及转接根据测试摇床中枯草芽孢杆菌悬液的OD值来确定最佳摇菌时间，以便在最佳时刻进行转接培养及检测。当OD值为0. 2时，菌的生长最旺盛，适合转接培养检测。在无菌操作台上将枯草芽孢杆菌接到盛有75mL普通液体培养基的锥形瓶中，封口，即刻放入摇床，在，150r/min的条件下摇勻，适时测试其OD值，当OD值为0. 2左右时(该实验大致为8小时)，将菌悬液从摇床中取出，等待转接。(3)制备混合菌液摇菌时间满后，取出菌液瓶，在无菌操作台上，用移液枪取扩增好(待转接)的菌液5mL(取前要充分摇勻)加入至IOOOmL培养基中混勻，该培养基含有葡萄糖1%，酵母粉 0. 2 %，牛肉膏0. 5 %，溴甲酚紫指示剂0. 00005 %。(4)微板的制作用移液枪取以上混合菌液270μ L，加入微板孔中，同时以未加菌液的培养基做无菌空白对照，在检测样品微板孔内再加入加30 μ L牛奶样品或其它动物源食品的提取液。(5)检测将所制得的检测微板放入恒温培养箱中培养4h后观察结果。微板孔内培养基颜色变黄说明样品中不含有抗生素或是抗生素的含量低于方法的检出限。微板孔内培养基的颜色如果仍为紫色，说明样品中有抗生素残留。方法的检测限(ppb)新霉素500链霉素3000庆大霉素300二双氢链霉素3000卡那霉素5000氯霉素5000青霉素G5阿莫西林5应用实例一在超净工作台中挑取前一天培养的枯草芽孢杆菌单菌落，放入液体培养基中，放入摇床，55°C下震荡培养7h，测0D600的范围为0. 2-0. 4间。在微板第1列只加入270 μ L培养基，在2 12例之间加入的是270 μ L检测培养基和菌悬液的混合溶液(其中检测培养基87. 5 %，菌悬液12. 5 % )，然后在第1，3 6列上继续加入30 μ L牛奶样品，在第2列上加入无菌水，在7 12加入牛奶和抗生素的混合物， 其中A D加入的是青霉素和牛奶的混合物，7 12例浓度依次为10 10_5μ g/mL，E H加入的是氯霉素和牛奶的混合物，7 12浓度依次为1 10_5μ g/mL。在恒温培养箱中培养池观察，加入青霉素样品中变色的最低浓度为0. 001 μ g/mL，加入氯霉素样品变色的最低浓度为1 μ g/mL，这刚好符合国家对这两种抗生素的安全标准。所有未添加抗生素的牛奶样品的培养基均变成黄色，说明现在市售牛奶都是无抗奶。应用实例二在超净工作台中挑取前一天培养的枯草芽孢杆菌单菌落，放入液体培养基中，放入摇床，28°C下震荡培养讣，测0D600的范围为0. 2-0. 4间。在微板第1列只加入270 μ L培养基，在2 12之间加入的是270 μ L检测培养基和菌悬液的混合溶液(其中检测培养基87. 5%，菌悬液12. 5% )，然后在第1列的A D继续加入30 μ L饲料鸡蛋稀释20倍的蛋清，第1列的E H加入土鸡蛋稀释20倍的蛋清，在第2列上加入无菌水，在3 12例A D加入饲料鸡蛋稀释20倍的蛋清，在E H加入土鸡蛋释20倍的蛋清，在恒温培养箱中培养池后观察结果。土鸡蛋的11个样品中，有 1个样品未变色，而饲料鸡蛋11个样品中有5个未变色，说明这些样品有可能有抗生素的残留，但需要采用色谱法进行进一步确认。
权利要求
1.一种用于用于动物源食品，特别是鲜奶中抗生素残留检测的微生物方法，其特征在于检测实验在96孔微板上进行。
2.权利要求1中的微生物，其特征在于采用采用嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)为供试菌。
3.权利要求1中的检测方法其特征在于以溴甲酚紫为变色指示剂。
全文摘要
本发明公开了一种在微板上采用微生物方法检测抗生素残留的方法。这种方法采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为供试菌，在96孔微板上对动物源食品中的抗生素残留进行检测，以溴甲酚紫为指示剂，通过指示剂的变色确定是否有抗生素的残留。这种方法可以用在实验室内对动物源食品中的抗生素残留进行粗筛。通过实验表明，这种方法比传统的平板微生物方法检测效率高，节约成分，并成灵敏度高。该方法的主要步骤是采用牛肉膏、葡萄糖、酵母粉和溴甲酚紫指示剂加蒸馏水配制成检测培养基并将pH调至7.5，加入含有以上菌种的菌悬液，加入待测样品，在培养箱中培养4小时，观察培养基颜色变化以判定样品中是否含有抗生素。
文档编号G01N21/78GK102410999SQ20101029056
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者刘兴泉 申请人:浙江农林大学