专利名称：一种用于植物激素前处理的分散液液微萃取法的制作方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种用于植物激素前处理的分散液液微萃
取方法。
背景技术：
植物激素是指一些在植物体内合成，对生长发育能产生显著作用的微量有机物。 生长素(Auxin)是最早发现的一种植物激素，能调控植物体的伸长生长、顶端优势、果实发 育等多种生理过程。建立植物生长素的灵敏、快速、准确的分析方法，对于阐明生长素在植 物生长过程中的作用和功能是非常重要的。然而，植物体内激素含量低(通常在O. l-50ng/ g鲜重范围内)，并存在许多植物激素类似物和次级代谢物，给植物激素的鉴别和定量带来 困难。因此，寻找有效、快速的前处理方法一直是植物激素检测的瓶颈和研究热点。
植物激素检测的前处理，目前多采用传统的液液萃取(1 iquid-liquid extraction, LLE)法和固相萃取(solid-phase extraction, SPE)法。其中，LLE法操作繁 琐、耗时、使用大量高毒有机溶剂，成本高，回收率较低，且不易实现自动化。SPE技术以高 效、可靠以及溶剂用量少等优势逐渐取代了经典的LLE技术，成为植物激素分析的主流前 处理方法。然而，SPE仍存在商品柱价格昂贵，过柱时间长等不足。2007年，固相微萃取法 (solid-phase microextraction， SPME)首次被用于植物激素的预处理，此方法集采样、萃 取、浓縮于一体，具有简单、快速、环境友好等特点，但SPME存在萃取头昂贵，使用寿命短， 易交叉污染等局限性。因此，发展高效、稳定、低成本且环境友好的样品前处理新技术仍是 亟待解决的问题。 分散液液微萃取(Dispersive Liquid-liquid Microextraction,Dliiffi)于2006 年首次提出，是一种新型的样品预处理技术。DLLME结合了 LLE和SPME的特点，所需有机溶 剂少，操作单快速，集萃取、纯化、浓縮于一体，回收率高，富集效果好。目前，DLLME已能与 多种仪器如气相色谱、气相色谱_质谱、液相色谱、液相色谱_质谱、原子吸收光谱等联用， 成功用于水样、土壤、尿样和水果中不同物质的测定，分析对象涉及农药残留、临床药物、痕 量金属等。将DLLME用于植物激素的前处理，具有富集能力高，操作简单，有机溶剂用量少 和萃取时间短等优点，是一种简单可靠、环境友好的样品预处理技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物激素的前处理新方法，用于净化和富集样品，该方 法富集能力高，操作简单，有机溶剂用量少和萃取时间短。 本发明用于植物激素前处理的分散液液微萃取方法，处理步骤包括 1)首先在10mL带塞的尖底离心管中，加入5. 0mL待测样品溶液和0. 375g NaCl，
所述待测样品溶液的PH为4. 0 ; 2)预先将50. 0 ii L萃取剂三氯甲烷和1. 0mL分散剂丙酮混匀； 3)用2. 0mL注射器吸取步骤(2)的混合液，迅速注射入步骤(1)装有待测样品溶
3液和0. 375g NaCl的尖底离心管中，轻轻振荡，形成乳浊体系； 4)将离心试管以4500r/min离心3min ; 5)用微量液相进样针吸取离心管底部的有机相直接进行HPLC分析。 本发明的显著优点是 本方法能够有效地对植物样品进行净化、浓縮，减少植物基质对检测信号的干扰； 本方法富集效果好，处理后的样品用高效液相色谱_荧光检测法分离测定，待测物质的检测限降低了两个数量级； 此方法未经过柱，减少了样品中待测物的损失； 植物样品中的IAA不稳定，易分解，本方法操作时间短，有利于减少IAA的分解； 此方法消耗有机溶剂少，是一种环境友好的前处理技术； 该方法装置简单，成本低； 该方法可与气相色谱、液相色谱和原子吸收分光光谱等仪器联用，适用范围广； 该方法无交叉污染问题。
图1是结合本发明的DLLME装置的流程图。其中，1、2. 0mL注射器，2、具塞尖形离心试管，3、微量液相进样针；(A)将萃取剂和分散剂混合后注入样品溶液；(B)萃取剂迅速被分散成细小液滴，形成乳浊体系；(C)经离心分离，有机相沉积于具塞尖形离心管底部；(D)用微量进样针吸取离心管底部有机相进行仪器分析。
具体实施例方式
本发明采用的DLLME(分散液液微萃取)装置包括具塞尖形离心试管、2. OmL注
射器和微量液相进样针。
处理步骤包括 1)首先在10mL带塞的尖底离心管中，加入5. OmL待测样品溶液和0. 375g NaCl，所述待测样品溶液的PH为4. 0 ; 2)预先将50. 0 ii L萃取剂三氯甲烷和1. OmL分散剂丙酮混匀； 3)用2. OmL注射器吸取步骤(2)的混合液，迅速注射入步骤(1)装有待测样品溶
液和0. 375g NaCl的尖底离心管中，轻轻振荡，形成乳浊体系；振荡时间为0. l-lmin，平衡
时间极短是该新型前处理方法的显著优点。4)将离心试管以4500r/min离心3min ; 5)用微量液相进样针吸取离心管底部的有机相直接进行HPLC分析。采用微量液相进样针吸取离心管底部的有机相，便于计算吸取有机相的体积。 尖底离心管为具塞尖底离心试管；具塞可避免振荡和离心过程中液体损失，尖底结构便于吸取底部液体。 待测样品溶液制备为所述待测样品溶液制备为准确称取待测植物鲜样0. 5g，用液氮快速研磨成粉末，用3mL含有lmmol/L抗氧化剂2. 6- 二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80%甲醇水溶液在4t:浸提过夜；低温离心，收集上清液，残渣用lmL含有lmmol/L抗氧化剂2. 6- 二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80%再浸提一小时，合并两次上清液，稀释
5倍后，得到待测样品溶液。 实施例 利用本发明测定小球藻中的吲哚乙酸(IAA)含量。 准确称取该待测植物鲜样0. 5g，用液氮快速研磨成粉末，用3mL含有lmmol/L抗氧化剂2. 6- 二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80%甲醇水溶液在4t:浸提过夜；低温离心，收集上清液，残渣用lmL含有lmmol/L抗氧化剂2. 6- 二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80%再浸提一小时，合并两次上清液，稀释5倍后，得到待测样品溶液。
在10mL带塞的尖底离心试管中，加入5. 0mL样品溶液(pH 4. 0)禾P 0. 375g NaCl，将50. 0 ii L氯仿和1. 0mL丙酮混匀，用注射器迅速将混合液注入样品溶液中，轻轻地振荡0. l-lmin，形成乳浊液体系。以4500r/min离心3 min，用微量液相进样针吸取离心管底部有机相直接进样分析。 色谱条件以乙腈/水为流动相(50 : 50， v/v% )，采用(]18色谱柱(5iim，150mmX 4. 6mm， Agilent)为分离通道，设置流速1. OmL/min，柱温35。C ，进样量5 y L，荧光波长Ex/Em 230/360nm。 本发明中DLLME用于植物生长素的预处理，得到了较好的净化和富集。检测限与未萃取富集前相比，降低了两个数量级。该方法操作简单，稳定性好，重现性高，成功用于测定小球藻中的IAA含量。日间精密度的RSDs(n = 7)分别为O. 17-0.94% (保留时间)，2.52-5.42% (峰面积)；日内精密度的RSDs(n二5)均小于0.86% (保留时间)和5.63%(峰面积)。测得小球藻中IAA含量为37. Ong/g FW(鲜重)。进行不同浓度的加标回收率实验，回收率介于94. 7-116.0%， RSD小于1.2X。本方法具有较好的发展前景，可进一步用于其他植物激素的前处理。
权利要求
一种用于植物激素前处理的分散液液微萃取技术，其特征在于处理步骤包括1)首先在10mL带塞的尖底离心管中，加入5.0mL的待测样品溶液和0.375g NaCl，所述待测样品溶液的pH为4.0；2)预先将50.0μL萃取剂三氯甲烷和1.0mL分散剂丙酮混匀；3)用2.0mL注射器吸取步骤(2)的混合液，迅速注射入步骤(1)装有待测样品溶液和0.375g NaCl的尖底离心管中，轻轻振荡，形成乳浊体系；4)将离心试管以4500r/min离心3min；5)用微量液相进样针吸取离心管底部的有机相直接进行HPLC分析。
2. 根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于所述的尖底离心管为具塞尖底离心试管。
3. 根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于所述步骤(2)轻轻振荡时间为振荡时间为0. l-lmin。
4. 根据权利要求l所述的前处理方法，其特征在于所述待测样品溶液制备为准确称取待测植物鲜样0. 5g，用液氮快速研磨成粉末，用3mL含有lmmol/L抗氧化剂2. 6- 二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80%甲醇水溶液在4t:浸提过夜；低温离心，收集上清液，残渣用lmL含有lmmol/L抗氧化剂2. 6-二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80%再浸提一小时，合并两次上清液，稀释5倍后，得到待测样品溶液。
全文摘要
本发明提供一种用于植物激素前处理的分散液液微萃取法，即将DLLME用于植物激素前处理的方法，处理步骤包括加样、混合萃取剂和分散剂、振荡形成乳浊体系、离心分离、吸取有机相直接进行HPLC分析。本发明的方法富集能力高，操作简单，有机溶剂用量少和萃取时间短，集采样、萃取和浓缩于一体的同时，避免了固相微萃取中可能存在的交叉污染的问题，是一种简单、快速、成本低、高效且环境友好的样品前处理新技术，在痕量分析领域具有广泛的应用前景。
文档编号G01N1/40GK101762417SQ20101030041
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月18日 优先权日2010年1月18日
发明者卢巧梅, 张兰, 陈丽惠, 陈国南 申请人:福州大学