专利名称：一种高效液相色谱-荧光法同时测定色氨酸和5-羟色胺的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，涉及检测色氨酸和5-羟色胺的方法，特别涉及用高效液相色谱荧光法同时测定色氨酸和其代谢产物5-羟色胺浓度的方法。
背景技术：
色氨酸(tryptophan，Trp)是人体必需的氨基酸之一，主要用于蛋白质合成。在人体内部分Trp经色氨酸羟化酶作用形成5-羟色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)，5-HTP脱羧形成5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)。高效液相色谱法(HPLC)是一种集分离和测定于一体的分析技术，样本预处理比较简单，灵敏度高，精密性好，特异性佳，样品预处理简单，在分析Trp和5-HT时应用最为普遍。根据联用的检测器不同分为高效液相色谱紫外法(HPLC-UV)、高效液相色谱荧光法(HPLC-FD)和高效液相色谱电化学法(HPLC-EC)。高效液相色谱紫外法灵敏度较低，对于某些标本(如脑脊液)难以达到检测限要求。而高效液相色谱电化学法虽然灵敏度高，但存在仪器昂贵，技术要求较高，操作不便等诸方面的不足。国内有使用HPLC-FD单独测定Trp或5-HT的方法，但同时检测的方法未见报道。
技术内容 本发明目的是针对以上现有技术的不足，提供一种操作简单，灵敏度高，分离快速，流动相配制简单，能同时测定色氨酸和5-羟色胺的高效液相色谱荧光法。
本发明目的可以通过以下技术方案实现 一种使用高效液相色谱荧光法同时分析Trp和5-HT的方法包括以下步骤 a.色谱柱选用Hypersil C18柱(250mm×4.6mm i.d.，7μm)作为色谱固定相； b.用0.1mol/L磷酸二氢钾和甲醇的体积比为85∶15溶液作为色谱流动相； c.流速为1.0mL/min，进样量为20μL，室温下测定； d、荧光检测器扫描确定检测两种物质的最佳检测波长；测定过程中波长设定为在0-6min激发波长和发射波长分别为278nm和338nm，6-10min激发波长和发射波长分别变换为280nm和340nm； e、分别配制色氨酸和5-羟色胺的标准溶液和混合标准液； f、混合标准液和血清样本的检测； g、制作标准曲线、定性定量方法、精密度的评价、回收率的考察和干扰试验。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下 1、本发明首次使用可变波长的高效液相色谱荧光法测定色氨酸和5-羟色胺，能满足同时测定上述两种物质的需求。
2、结果表明，在一定浓度范围内，两种物质的标准曲线的线性关系良好(r2≥0.999)，线性范围宽，灵敏度高；精密度好，日内和日间相对标准偏差均小于5％；回收率高，两者的回收率均在90％左右；苯丙氨酸、酪氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸都不会对5-HT与Trp的分离分析产生干扰。
3、本发明经过大量的试验，摸索出一套最佳的能同时测定待测样品中色氨酸和5-羟色胺的条件，包括流动相成分，配比、流速、检测波长等等。
4、本发明方法操作简便，测定准确，分离快速，灵敏度高。
图1为本发明混合标准品的色谱图； 图2为本发明血清样本的色谱图。
具体实施例方式 主要仪器 Waters高效液相色谱仪，包括M510色谱泵、M2475荧光检测器；Rheodyne 7725手动进样器(带20μL进样环)；HS2000色谱数据工作站。0.45μm滤膜及其抽滤器，Milli-Q纯水器，TGL-16台式高速冷冻离心机，AA-250电子天平，SB2200型超声去气仪。
主要试剂 色氨酸(Trp)、5-羟色胺(5-HT)、犬尿氨酸(Kyn)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)均购自Sigma公司；甲醇为色谱纯，购自美国Tedia公司；磷酸二氢钾为国产分析纯；高氯酸为国产优级纯。配制试剂用水为Milli-Q纯水器处理的超纯水。
色谱条件 色谱柱HypersilC18柱(250mm×4.6mmi.d.，7μm)；流动相0.1mol/L磷酸二氢钾和甲醇体积比为85∶15溶液；流速1.0mL/min；荧光检测激发波长和发射波长在0-6min分别为278nm和338nm，6-10min变换为280nm和340nm；进样量20μL；室温下测定。
下面以具体实施例进一步解释本发明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。
实施例1色谱条件的建立 1、标准溶液的配制 准确称取5-HT10.0mg和Trp10.0mg，分别用体积分数为2.5％的高氯酸溶液溶解并稀释至10.0mL，混匀，制成5-HT(4702μmol/L)标准储备液和Trp(4900μmol/L)标准储备液，分装后置于20℃冰箱中备用。用前取标准储备液加超纯水配成含5-HT0.2351μmol/L和Trp 24.5μmol/L混合标准工作液。
2、检测波长的选择 取一定浓度的5-HT与Trp标准溶液，采用手工停流技术，以流动相空白调零，在M2475荧光检测器上，作5-HT与Trp的激发光谱(范围200-350nm)和发射光谱(范围300-450nm)扫描，得到5-HT的最大激发光波长和最大发射光波长分别为278nm和338nm；Trp的最大激发光波长和最大发射光波长分别为280nm和340nm。采用上述波长分别检测5-HT和Trp。
3、流动相中甲醇体积分数的选择 配制含有不同体积分数(5％，10％，15％，20％)甲醇的流动相，以混合标准工作液和血清作为样品进行分析，在甲醇体积分数为5％时分离度较好，但峰面积相对较小，分析时间较长，需要将近20分钟才能完成检测；而当甲醇体积分数为20％时，5-HT检测图形中出现重叠峰干扰，分离度不佳，影响其检测结果；甲醇体积分数为15％时，二者在10min内可以较好地分离，分离度好，故采用含体积分数为15％甲醇的流动相。
4、流速的选择 分别以流速0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL/min进行实验，结果表明，随着流速的加快，5HT和Trp的保留时间逐渐缩短，但峰面积也相应地减小，色谱系统的压力增大；流速为0.6mL/min时，5-HT和Trp保留时间分别约为10min和17min；流速为1.4mL/min时，5-HT和Trp保留时间缩短，但分离度欠佳，并且色谱系统的后压加大，为了得到合适的分析时间和响应值，选用的流速为1.0mL/min。
实施例2样品的检测 1、混合标准液的检测 取已配置的混合标准工作液直接进样分析，高效液相色谱条件色谱柱Hypersil C18柱(250mm×4.6mmi.d.，7μm)；流动相0.1mol/L磷酸二氢钾/甲醇(85∶15，V/V)溶液；流速1.0ml/min；荧光检测激发波长和发射波长在0-6min分别为278nm和338nm，6-10min变换为280nm和340nm；进样量20μL；室温下测定。色谱分离效果见图1。
2、血清样品的检测 取100μL置于Enpendorf管内，加入等体积的5％高氯酸溶液，在室温下放10min后，12000r/min、4℃离心10min，取上清液20μL进样分析。高效液相色谱条件色谱柱HypersilC18柱(250mm×4.6mmi.d.，7μm)；流动相0.1mol/L磷酸二氢钾/甲醇(85∶15，V/V)溶液；流速1.0ml/min；荧光检测激发波长和发射波长在0-6min分别为278nm和338nm，6-10min变换为280nm和340nm；进样量20μL；室温下测定。色谱分离效果见图2。
3、定性定量分析 Trp和5-HT峰采用峰保留值和峰叠加法定性分析；用外标法测定峰面积进行定量；数据处理均由HS2000色谱数据工作站完成。血清5-HT或Trp
Au为血清中5-HT或Trp峰面积，As为混合标准液中5-HT或Trp峰面积，Cs为混合标准液中5-HT或Trp浓度。
4、标准曲线和检测限的确定 取5-HT与Trp标准储备液，用超纯水配制一系列浓度的标准工作液(5-HT浓度为0.001～4.702μmol/L，Trp浓度为0.012～98μmol/L)，每个浓度样品进样3次，取其平均值用最小二乘法进行相关与回归分析，其中，Y为峰面积(μV·s)，X为被分析物的进样浓度(μmol/L)。以流动相为空白，按信噪比为3确定检测限。结果5-HT的回归方程为Y＝4223461X 35303.9，线性范围为0.003～4.702μmol/L，相关系数为0.999，检测限为0.001μmol/L；Trp的回归方程为Y＝421314X+38292.9，线性范围为0.0245～98.0，相关系数为0.999，检测限为0.007μmol/L；结果表明线性范围宽，灵敏度高。
5、精密度试验 取混合血清样品和标准品进行日内和日间精密度试验。5-HT标准液浓度分别取0.2351、0.4702、2.351μmol/L，Trp标准液浓度分别取12.25、49、245μmol/L低、中、高3个浓度水平，日内进行5组平行实验，计算日内精密度，每份样品连续测定5天，计算日间精密度，结果见表1。
表15-HT和Trp的精密度
6、回收率测定 取混合血清样品1.6mL平均分为4组，每组3份。第1组每份加入2.5％的高氯酸溶液0.1mL作为基础样品；后3组每份分别加入高、中、低浓度的混合标准工作液0.1mL；每个样品重复测定三次取其平均值计算回收率，结果见表2，3。
表25-HT回收率
表3Trp回收率
7、干扰试验 先将混合血清去蛋白后取上清液进样分析，然后用体积分数为2.5％的高氯酸溶液分别配制605.4μmol/L苯丙氨酸(Phe)、55.19μmol/L酪氨酸(Tyr)、19.60μmol/L犬尿氨酸(Kyn)和1.05μmol/L犬尿喹啉酸(Kyna)的标准液，先单独进样分析，再分别与混合血清混合，去蛋白后取上清液进样分析，结果表明以上物质都不会对5HT与Trp的分离分析产生干扰(见表4)。
表4干扰试验结果
权利要求
1.一种高效液相色-谱荧光法同时测定色氨酸和5-羟色胺的方法，其特征在于，包括以下步骤
a.色谱柱选用Hypersil C18柱250mm×4.6mm i.d.，7μm作为色谱固定相；
b.用0.1mol/L磷酸二氢钾和甲醇的体积比为85∶15溶液作为色谱流动相；
c.流速为1.0mL/min，进样量为20μL，室温下测定；
d、荧光检测过程中波长设定在06min时激发波长和发射波长分别为278nm和338nm，6-10min激发波长和发射波长分别变换为280nm和340nm。
全文摘要
本发明公开了一种高效液相色谱-荧光法同时测定色氨酸和5-羟色胺的方法，包括以下步骤a.色谱柱选用Hypersilc18柱250mm×4.6mmi.d.，7μm作为色谱固定相；b.用0.1mol/L磷酸二氢钾和甲醇的体积比为8515溶液作为色谱流动相；c.流速为1.0mL/min，进样量为20μL，室温下测定；d.荧光检测过程中波长设定在0-6min时激发波长和发射波长分别为278nm和338nm，6-10min激发波长和发射波长分别变换为280nm和340nm。该方法操作简单，灵敏度高，分离快速，流动相配制简单；能满足同时测定色氨酸和5-羟色胺的需求。
文档编号G01N30/00GK101762662SQ20101030055
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者唐爱国, 周前选, 项忠元, 任亚萍 申请人:中南大学湘雅二医院