专利名称：中药注射剂微量蛋白质检测方法
技术领域：
本发明涉及中药注射剂杂质检测领域，用于检测中药注射剂蛋白质类杂质，以控 制中药注射剂的质量。
背景技术：
中药注射剂最早产生在上世纪四十年代，由钱信忠等学者开创。在中国，中药注射 剂已经广泛应用于临床。2010年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收 录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵及双黄连等单方和复方注射剂。中药注射剂在推进中药剂型 发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。安全、有效、质量可控 依然是中药注射剂的基本质量要求。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的 有效性问题(尽管作用机制尚不完全清楚)，对于安全性依然是业界难题。然而，随着中药注射剂的广泛应用于临床，其不良反应日益暴露，特别是致死性不 良反应也屡有报道。根据目前公开的不良反应资料，中药注射剂的不良反应可以累及各个 系统和脏器，甚至导致死亡。很多中药注射剂的不良反应与原有的药理作用无关，根据多方 面分析，这些不良反应主要属于超敏反应，即病理性免疫反应，包括I、II、III和IV型病理 性免疫反应。病理性免疫反应仍是免疫反应，必须有抗原的参与，其抗原可以是半抗原或完 全抗原。半抗原多属于小分子成分，完全抗原多为大分子成分，以蛋白质最为多见。因此减 少中药注射剂中的抗原性成分是提高中药注射剂安全性的关键策略之一。中药注射剂大多为植物提取物。作为生物提取物，在原料提取过程中会带来多种 植物大分子杂质，如蛋白质、核酸等。尽管植物中的蛋白质含量较低，通过有机溶剂提取的 量较少，但微量的蛋白仍足以诱发过敏反应。与人相比，植物蛋白与人的同源性差异大，因 此常常具有很强的抗原性。现行《中国药典》(2010年版)控制中药注射剂蛋白含量的方法 仍沿用了以前的磺基水杨酸比浊法，控制的蛋白质限量约为37 110μ g/ml左右，低于此 限量的蛋白药典方法很难检出。因此，蛋白含量低于37 μ g/ml的中药注射剂将被视为“合 格”。而且中药注射剂中的酸性成分会干扰磺基水杨酸法检测蛋白的结果，这导致磺基水杨 酸法应用范围受限。而其他未被药典采用的蛋白质检测方法如，凯氏(Kjeldahl)定氮法、 双缩脲法、Folin-酚试剂法、直接考马斯亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法以及BCA法等， 却因为中药注射剂其他成分或本身颜色带来严重干扰，要么特异性较差，要么灵敏度较差， 不适合用于中药注射剂的蛋白质限量检测。蛋白质类杂质属于一类杂质，包含了不同性质 或分子量的蛋白质，因此也很难用HPLC和/或质谱等仪器分析方法进行检测。中药注射剂中存在的微量蛋白成分带来了安全性问题，从严控制中药注射剂中的 蛋白质杂质，有利于提高中药注射剂的安全性。因此建立特异性高并且灵敏的中药注射剂 蛋白质检测方法很有必要。由于中药注射剂都有较深的颜色，成分多样，而且蛋白质是一类物质，因此很难用 目前单一方法同时提高检测的灵敏性和特异性。因此本发明是针对中药注射剂的特点而建 立的，对蛋白质检测具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点。
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在我们申请的前一项专利(201010199693.3)中，我们发明了一种检测中药注射 剂的微量蛋白方法，检测的灵敏度约为12μ g/ml，比2010年版《中国药典》方法高3倍左 右。在本专利中，我们参照专利(201010199693.3)的原理将方法进行了改进，检测的灵敏
度将得到进一步的提高。
发明内容
本发明利用某些膜能和蛋白质特异性高强度吸附的特点以及考马斯亮蓝对蛋白 质特异性显色的特点建立本方法，以提高中药注射剂微量蛋白检测的灵敏性和特异性。本 方法包括以下三个步骤1、先将蛋白质特异性吸附膜浸泡在拟检测的中药注射剂溶液中；2、用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质吸附膜，以消减中药注射剂本身的颜色干 扰；3、将蛋白质吸附膜进行考马斯亮蓝显色。在以上步骤1中，吸附蛋白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜 (Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜)；浸泡于中药注射剂溶液中蛋白质吸附膜的 面积大小为Imm2-O. Im2 ；浸泡蛋白质吸附膜的中药注射剂溶液的体积0. Iml-IOOOml ；中药 注射剂溶液包括但不限于中药注射液、中药注射用冻干粉针剂及其稀释或浓缩液。在以上步骤2中，采用的有机溶液浓度为0-100 %，有机溶剂包括但不限于甲醇、 乙醇、乙腈、丙酮、氯仿。采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限，以去除或减弱中药注射 剂本色为度。如果被中药注射剂溶液浸泡后的蛋白质吸附膜几乎无色，本步骤可以跳过直 接进入步骤3。在步骤3进行考马斯亮蓝显色时，考马斯亮蓝的浓度不限。可以对膜片直接染色； 也可以染色后进行脱色处理，以降低膜的背景。含有一定蛋白质浓度的中药注射剂会显示 出稳定的蓝色。本方法各步骤较佳参考条件是步骤1)选用蛋白质吸附膜为PVDF膜，膜的面积控制在IOmm2内，采用中药注射原 液，浸泡的体积为10ml。步骤2)洗涤用的有机溶媒采用纯甲醇或乙腈。步骤3)采用0.25%考马斯亮蓝染液先染色，随后用脱色液(甲醇-水-冰醋酸= 4.5 4.5 1)脱色，脱色操作以空白对照膜片基本无色为度。本方法实施的效果是，检测的特异性高，抗干扰能力强，但灵敏性更高。
图1为PVDF膜吸附染色检测微量蛋白质获得的初步染色结果图从A3至A9， BSA(牛血清白蛋白)浓度依次均为 0. 33mg/ml、0. lmg/ml、37 μ g/ml、12 μ g/ml、4 μ g/ml、 1. 3 μ g/ml、0. 45 μ g/ml, A13为阴性对照，蛋白质浓度为0 ；浸泡吸附体系1ml。图2为本发明的灵敏度优化实验结果图最上1行采用IOml浸泡吸附体系，中间 为5ml浸泡吸附体系，最下一行为2ml浸泡吸附体系；从A7至A12，BSA浓度依次均为4 μ g/ mlU. 3 μ g/ml,0. 45 μ g/ml,0. 15 μ g/ml,0. 05 μ g/ml,0. 016 μ g/ml, A13 为阴性对照，蛋白
4质浓度为0。图3为本发明吸附时间优化的结果图第1 5行的浸泡吸附时间分别为1小时、2 小时、5小时、10小时和15小时；A8 AlO的BSA浓度为1. 3μ g/ml,0. 45μ g/ml,0. 15 μ g/ ml, A13为阴性对照，蛋白质浓度为0 ；浸泡吸附体积为10ml。图4为本发明用于检测4种中药注射液的结果图步骤1为浸泡吸附15小时后直 接风干的PVDF膜颜色，步骤2为膜片经步骤1后再经甲醇洗涤后的结果，步骤3为PVDF膜 分别在4种中药注射液中浸泡15小时后经甲醇洗涤并经考马斯亮蓝染色的结果；1为丹参 注射液、2为双黄连注射液、3为清开灵注射液、4为灯盏细辛注射液、A13为阴性对照(即不 含蛋白质的PBS溶液)。
具体实施例方式实施示例1改变检测方法，发现检测灵敏度得到提高取13 支 1. 5ml 试管，管编号 A0-A12，用 PBS(KC1，0. 2g ；KH2PO4,0. 2g ；NaCl，8. Og ； Na2HPO4 · 12Η20，2· 08g ；加三蒸水到1000ml, pH 7. 2)和BSA(牛血清白蛋白)配制出浓度 为9mg/ml的BSA溶液15ml于0号管中，在A1-A12号管中各加入1. Oml PBS,从0号管中取 0. 5ml溶液至1号管中混勻，再从1号管中取0. 5ml溶液至2号管中混勻，依此类推至A12 号管，即得到浓度梯度为3倍的一组标准蛋白质溶液，每管溶液1. Oml0 A13号管为1. Oml 的PBS空白对照。将PVDF膜裁成9mm2大小的膜片，用甲醇浸透(约10秒钟)，投入到A3-A9和阴 性对照管A13中，盖紧试管盖，放置在转移脱色摇床上振摇(30rpm，20-25°C )过夜(15小 时)。随后弃去溶液，将PVDF膜片保留在1.5ml的试管中，用0.5ml 0. 25%考马斯亮蓝染 色液(用脱色液配制)染色5min。弃去考马斯亮蓝染液，加入Iml脱色液(甲醇-水-冰 醋酸=4. 5 4.5 1)在转移脱色摇床上脱色3-5次，每次lOmin，脱去背景色，以阴性对 照膜片(A13)基本无色为度。脱色完毕后将膜片取出风干拍照，观察斑点颜色强弱。结果 如图1所示。从图1可见，在Iml浸泡吸附体积内，A3-A8均显示出明显的染色阳性结果，A9膜 片染色弱阳性。以々8阳性结果看，本法的对微量蛋白质的检测限量低于1. 4μ g/ml，和我们 的前一研究相比(专利201010199693. 3，其灵敏度约为12 μ g/ml)，本方法的检测灵敏度约 是其10倍。实施示例2灵敏度优化参照实施示例1的方法，取13支15ml离心管编号A0-A12，用PBS和BSA配制出 浓度为9mg/ml的BSA溶液15ml于O号管中，在A1-A12号管中各加入IOml PBS，0号管中 取5ml溶液至1号管中混勻，再从1号管中取5ml溶液至2号管中混勻，依此类推至A12号 管，即得到浓度梯度为3倍的一组标准溶液，每管溶液10ml。A13号管为IOml PBS空白对 照。如法配制5ml和2ml体系的A0-A13液各一组。将PVDF膜裁成9mm2大小的膜片，用甲醇浸透(约10秒钟)，投入到各组A7-A13管 中，盖紧离心管盖，放置在转移脱色摇床上振摇(30rpm，20-25°C)过夜(15小时)。随后将
5PVDF膜片取出，分别放在1.5ml的试管中，用Iml 0. 25%考马斯亮蓝染色液(用脱色液配 制)染色5min。弃去考马斯亮蓝染液，加入Iml脱色液(甲醇-水-冰醋酸=4.5 4.5 1) 在转移脱色摇床上脱色3-5次，每次lOmin，脱去背景色，以阴性对照膜片(A13)基本无色为 度。脱色完毕后将膜片取出风干拍照，观察斑点颜色强弱。结果如图2所示。从图2可见，在IOml吸附体积内，A7-A9均显示出明显的染色阳性结果，AlO以后 的膜片染色阴性。但在5ml和2ml体系，A9的阳性较弱。因此，经过条件优化，以A9阳性 结果看，本法的对微量蛋白质的检测限量低于0. 5 μ g/ml，这和我们的前一研究相比(专利 201010199693. 3，其灵敏度约为12 μ g/ml)，本方法的检测灵敏度是其的30倍，比《中国药 典》方法的灵敏度更高(约为其的90倍)。实施示例3浸泡吸附时间优化实施示例2发现在IOml浸泡吸附体系下，本法检测微量蛋白质的限量低于 0. 5 μ g/ml。本实施示例探索吸附时间对检测灵敏度的影响。参照实施示例1的方法，取13支15ml离心管编号A0-A12，用PBS和BSA配制出 浓度为9mg/ml的BSA溶液15ml于O号管中，在A1-A12号管中各加入IOml PBS，0号管中 取5ml溶液至1号管中混勻，再从1号管中取5ml溶液至2号管中混勻，依此类推至A12号 管，即得到浓度梯度为3倍的一组标准溶液，每管溶液10ml。A13号管为IOml PBS空白对 照。一共配制5套IOml的蛋白质梯度溶液。将PVDF膜裁成9mm2大小的膜片，用甲醇浸透(约10秒钟)，投入到各组A8-A10 和A13管中，盖紧离心管盖，放置在转移脱色摇床上分别振摇(30rpm，20-25°C ) 1小时、2小 时、5小时、10小时和15小时。到达预期振摇时间后将PVDF膜片取出，分别放于1. 5ml的 试管中，用Iml的0.25%考马斯亮蓝染色液(用脱色液配制)染色5min。随后弃去考马斯 亮蓝染液，加入Iml脱色液(甲醇-水-冰醋酸=4. 5 4.5 1)在转移脱色摇床上脱色 3-5次，每次lOmin，脱去背景色，以阴性对照膜片(A13)基本无色为度。脱色完毕后将膜片 取出风干拍照，观察斑点颜色强弱。结果如图3所示。从图3可见，在IOml浸泡吸附体积，在一定的吸附时间内，蛋白质染色的深度随时 间延长而加深。A9在吸附5小时内的染色为阴性，但吸附10小时以上，A9便染色阳性。因 此，本法检测时，为了保证检测限量低于0. 5μ g/ml，浸泡吸附时间应在10小时以上。实施示例4四种中药注射剂成品微量蛋白质检查从市场上购得丹参注射液(批号20080405)、双黄连注射液(批号090113311)、 清开灵注射液(批号090214)和灯盏细辛注射液(批号20080914)用本法进行检测。取这四种中药注射液IOml置于15ml离心管中，分别编号1、2、3、4，另设一管A13 作为阴性对照(不含蛋白质)。由于这四种中药注射液均有较明显的颜色，为了排除药液本 身颜色的干扰，因此一共设置三组药液分别考察本法步骤1、2、3的膜片染色情况。将PVDF膜裁成9mm2大小的膜片，用甲醇浸透(约10秒钟)，投入到各组编号为1、 2、3、4的管中和A13管中，盖紧离心管盖，放置于转移脱色摇床上分别振摇(30rpm，2(TC)15 小时。第1组到达预期振摇时间后将PVDF膜片取出风干，用于考察PVDF膜对药液有色物质 的吸附情况(即步骤1)。另2组到达预期振摇时间后将PVDF膜片取出，放置在1. 5ml的试
6管中，先用Iml甲醇洗涤3次，每次15分钟，将其中1组(第2组)PVDF膜取出风干用于考 察本法对有色物质的抗干扰作用(步骤2)。另1组(第3组)PVDF膜片用Iml的0. 25%考 马斯亮蓝染色液(用脱色液配制)染色5min (步骤3)。随后弃去考马斯亮蓝染液，加入Iml 脱色液(甲醇-水-冰醋酸=4. 5 4.5 1)在转移脱色摇床上脱色3-5次，每次lOmin， 脱去背景色，以阴性对照膜片(A13)基本无色为度。脱色完毕后将各组膜片取出风干拍照， 观察斑点颜色强弱。结果如图4所示。 从图4可见，在进行到步骤1时，PVDF膜片能够吸附中药注射液(丹参和双黄 连)中的色素物质并显示一定颜色。但经过步骤2的处理，各膜片基本无色，表明本法具 有较强的抗干扰能力。经过步骤3，清开灵注射液显色强阳性，双黄连注射液显色阳性， 而丹参注射液显色较弱，灯盏细辛注射液显色阴性。对比我们以前的专利方法(申请号 201010199693. 3)检测这四种中药注射液的浓缩液染色结果，本法能够直接检测出清开灵 注射液和双黄连注射液中的微量蛋白质，本法原理和专利方法(申请号=201010199693. 3) 相同，对这四种中药注射剂的检测结果也与专利方法一致。
权利要求
一种检测中药注射剂微量蛋白质的方法，其特征在于按以下步骤进行1)先将蛋白特异性吸附膜浸泡在中药注射剂溶液中；2)用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白特异性吸附膜，以消减中药注射剂本身颜色的干扰；3)将蛋白特异性吸附膜进行考马斯亮蓝染色。
2.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征在于用于吸附蛋 白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)。
3.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征在于浸泡于中药 注射剂溶液中蛋白质吸附膜的面积大小为Imm2-O. lm2。
4.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征在于浸泡蛋白质 吸附膜的中药注射剂溶液的体积0. Iml-IOOOml。
5.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征是中药注射剂 溶液包括但不限于中药注射液、中药注射用冻干粉针剂及其稀释或浓缩溶液。
6.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征是洗涤消除中 药注射剂溶液本身颜色干扰所用的有机溶液浓度为0-100%，有机溶剂包括但不限于甲醇、 乙醇、乙腈、丙酮、氯仿，以及它们两种或两种以上任意比例的混合；采用有机溶液洗涤的量 和洗涤的次数不限，以减弱或消除中药注射剂点样斑点的本色为度。
7.根据权利要求1所描述的中药注射剂微量蛋白质检测方法，其特征是染色所用的 考马斯亮蓝浓度不限，在染色过程中既可以对经过步骤2处理后的膜片直接染色，也可以 染色后再进行脱色处理。
全文摘要
一种能够检测中药注射剂微量蛋白的检测方法，用于检测中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中药注射剂的质量。其特征在于按以下步骤进行1)先将蛋白质特异性吸附膜浸泡在拟检测的中药注射剂溶液中；2)用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质吸附膜，以消减中药注射剂本身的颜色干扰；3)将蛋白质吸附膜进行考马斯亮蓝显色。如果中药注射剂所含的蛋白质不低于0.5μg/ml，就会在膜上显示稳定可辨的蓝色。本发明的检测灵敏度高，同时具有较强的抗干扰能力，适用于所有中药注射剂微量蛋白质的检测。
文档编号G01N21/78GK101975861SQ20101050457
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者吕小满, 李奇峰, 柯瑾, 段为钢 申请人:云南中医学院