专利名称：He4单抗、多抗制备及相关诊断试剂盒研制的制作方法
技术领域：
本发明涉及HE4的抗体(包括单抗和多抗)的制备、HE4的重组表达及利用HE4的 抗体来早期诊断卵巢癌以及卵巢癌复发监测的技术领域。发明背景卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，包含了数种不同的组织病理分型，治疗方法取决 于具体的肿瘤类型。其中上皮性卵巢癌占了恶性肿瘤的大部分，还包括其它如生殖细胞肿 瘤、癌肉瘤(卵巢恶性苗勒氏混合瘤)和卵巢间质肿瘤。上皮性卵巢癌的患者能获得治愈 的不到40%，大部分患者初诊时已是晚期。据WHO近期世界范围统计资料，卵巢癌发病率和死亡率在女性生殖道恶性肿瘤中 均仅低于宫颈癌占第二位。在西方国家，卵巢癌死亡率占第一位，甚至比宫颈癌和子宫内膜 癌死亡人数的总和还多。由于尚无成熟的早期诊断方法，卵巢癌发现时70% -80%均为晚 期，治疗极其困难。常规的手术、化疗难以治愈，即使暂时缓解亦常在2-3年后复发，而对这 一部分病人反复手术、化疗严重影响患者生存质量。NCCN指南反映了分期、分级在判断预后以及在指导治疗上的重要性。卵巢癌主要 分为I、II、III、IV期。病理分级仍然是影响预后和治疗的一个很重要因素，这对于早期卵巢 癌更为重要，分级有Gl、G2、G3。由于卵巢在体内所处的位置，卵巢癌患者早期无典型的临 床表现，卵巢癌的早期诊断比较困难，大部分患者确诊时已在晚期，仅有25%的患者在I期 发现，而III、IV期卵巢癌患者5年生存率则由I期时的95%降至20% 25%，且卵巢癌术后 复发率高。肿瘤标志物检测简便且无创，因此其在肿瘤的筛查、诊断、指导治疗、估计预后等 方面有着非常广泛的运用前景。就卵巢癌而言，目前只有癌抗原125(CA125)检测被广泛应用于临床卵巢癌的诊 断。CA125是一种高分子糖蛋白，由人类卵巢浆液性囊腺癌细胞给家鼠作免疫接种，通过淋 巴细胞杂交而获得，并由单克隆抗体0C125识别而命名。它是目前临床常用的用于卵巢癌 诊断的肿瘤标记物，它已成为术后监测卵巢癌治疗效果及有无复发的重要指标。但由于子 宫内膜异位症、盆腔炎症等也会导致CA125升高，所以应用CA125诊断卵巢癌并不准确。由 于CA125其特异性不强，在早期卵巢癌诊断中敏感性不高，因此，迫切需要一种灵敏性和特 异性较强的标志物来提高卵巢癌的诊断水平。一些学者已经进行了 CA125与其它血清肿 瘤标志物以及超声技术联合应用的研究，多数联合应用的肿瘤标志物包括高分子量糖蛋白 类，如CA153、CA724、CA199、脂质结合唾液酸(LAsA)、V0X1等。上述联合应用的方法虽然有 可能提高检测的灵敏度，但却是以降低特异性为代价的，所以此方法对于卵巢癌的早期诊 断无太大意义。人们仍然致力于寻找新的肿瘤标志物。人附睾蛋白4(HE4)是一种新的肿瘤标志物，属于乳清酸性4- 二硫化中心(WFDC) 蛋白家族，此家族中的其它蛋白还包括SLPI，Elafin和PS20 (WFDCl)，具有疑似胰蛋白酶 抑制剂的特性。HE4基因的cDNA最早由Kirchhoff等从人的附睾中克隆到，该基因编码的 蛋白质与细胞外蛋白酶抑制剂有很高的同源性。该基因位于染色体20ql2 13. 1，全长为 12kb左右，由5个外显子和4个内含子组成。该基因存在多种剪切方式，编码分泌小分子蛋白Es7。HE4基因编码一段长度为13kD的蛋白，在其成熟的糖基化形式时，此蛋白大概为 20kD 25kD，并且包括一条含有两个WFDC结构域的单链。HE4首先在附睾远端的上皮中被发现，并且最初认为它是一种与精子成熟相关的 蛋白酶抑制剂。一直以来有报道认为HE4在多个正常组织(包括呼吸道和生殖道组织，以 及卵巢癌组织)的上皮内均有所表达。不仅在细胞水平上有所表达，分泌型HE4已经在卵 巢癌患者的血清中检测到有高水平表达。Hellstrom等比较了卵巢癌患者及正常人血清中 的HE4蛋白量，发现大多数卵巢癌患者血清中的HE4蛋白含量有明显提高。在一项关于卵 巢癌患者与良性状态下的健康者的病例/对照对比性研究中，Hellstrom等发现HE4检测 卵巢癌在特异性水平为96%时具有67%的敏感性。在随后一项对卵巢癌相关的大量生物 标志物的评价研究中，HE4检测卵巢癌时具有最高的灵敏度，尤其是在疾病的早期阶段。HE4 还可与其它检测项目如CA125联合使用，以提高对恶性肿瘤预测的准确性。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种利用HE4及抗HE4的单抗和多抗作为卵巢癌早期诊断、 复发监测简便易得的诊断试剂盒，来测定人血清中HE4的浓度，提高卵巢癌早期诊断的敏 感性和特异性，还可用于卵巢癌的复发监测。技术方案一种用于卵巢癌早期诊断、复发监测等用途的诊断试剂盒的制备方法，包括标准 HE4蛋白、能与HE4特异结合的单克隆抗体和多克隆抗体、封闭液、酶标抗体、酶底物溶液、 终止液和酶标板。该发明包括卵巢癌肿瘤标志物HE4在真核细胞的重组表达，能与HE4特异结合的 单克隆抗体和多克隆抗体，能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及该试剂盒的制备。利用基 因工程的方法得到的真核细胞重组表达的HE4具有与天然HE4的糖基化程度相同，空间构 象更接近天然抗原，以此制备的单抗或多抗作为包被抗体，以另一单抗作为酶标抗体制备 的试剂盒，敏感性及特异性更高。发明中HE4标准蛋白采用基因工程方法制成从卵巢癌组织中利用RT-PCR的方法 克隆HE4基因，将其插入pPICZaA载体上，经测序确证基因正确后转入到酵母或哺乳动物细 胞中，表达的HE4蛋白利用^-Agarose亲和层析柱分离纯化，得到的表达产物具有糖基化， 其空间构象接近于天然状态。发明中抗HE4单抗用纯化的HE4免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融 合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系P3-X63-Ag8. 653 ；利用HAT选择培养基选择杂交瘤 细胞，并利用ELISA方法鉴定产生抗HE4抗体的细胞；保存所筛选到的产生与HE4高特异 性结合的单抗的细胞株；利用细胞发酵装置培养所保存的细胞株，收集细胞培养上清，先用 (NH4)2SO4沉淀法从培养上清中初步纯化抗HE4单抗，再利用Protein A-Sepharose亲和层 析柱从细胞培养上清中进一步纯化抗HE4的单抗，SDS-PAGE及western blotting鉴定分 离纯化的单抗。发明中抗HE4多抗是用纯化的HE4免疫兔，得到含有抗HE4抗体的兔血清；先用 (NH4)2SO4沉淀法从兔的血清中初步纯化免疫球蛋白IgG，再用Protein A-Sepharose亲和层析柱进一步纯化抗HE4的IgG，SDS-PAGE及western blotting鉴定分离纯化的多抗。试剂盒的封闭液为明胶溶液；酶标抗体为酶标记的种属抗体，酶标抗体既保 有酶的催化活性，也保持了抗体的免疫活性，其中酶可为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)和亲和素等；酶底物 溶液中的底物可为邻苯二胺(O-phenylenediamine，0PD)、四甲基联苯胺(3，3 ‘，5， 5' -tetramethylbenzidine, TMB)、 肖基苯憐酸酉旨(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)禾口 生物素等；终止液为2mol/L H2SO4溶液。本发明利用抗HE4的单抗和多抗，其中利用多抗作为第一抗体，即包被抗体，HE4 单抗作为酶标抗体，即第二抗体；也可一种单抗作为包被抗体，另一种单抗作为酶标抗体； 同时，利用基因工程方法得到重组人HE4糖蛋白抗原，这取代了人卵巢癌组织中提取的方 法，材料简单易得，由于是真核细胞表达，糖基化程度与天然产物相同，较合成的HE4多肽 片段或大肠杆菌表达的产物空间构象更接近天然HE4，提高了卵巢癌早期诊断的敏感性和 特异性，其敏感性可达89%，特异性为95%。
具体实施例方式实施例1HE4的重组表达、纯化及鉴定从卵巢癌组织中利用RT-PCR的方法克隆HE4基因，将其插入载体pPICZaA上，挑 取阳性克隆，提取重组质粒DNA，以XhoI、XbaI、BamHI和HindIII进行酶切分析，结果显示得 到了与预期大小相符的酶切片段；经测序确证基因正确后转化入到毕赤酵母GS115和KM71 中，筛选酵母工程菌，重组酵母分泌表达产物经SDS-PAGE分析，发现在20-25kD左右有特异 表达带，western blotting分析证明表达产物可与HE4单抗特异性结合。实施例2制备、纯化及鉴定抗HE4抗体1)抗HE4的单抗的制备、纯化及鉴定用纯化的HE4利用腹腔注射方法免疫BALB/c小鼠，每隔三周免疫一次，共免疫四 次；然后取出免疫小鼠的脾脏细胞，利用PEG-4000融合该脾脏细胞和小鼠的骨骼瘤细胞 系P3-X63-Ag8. 653，利用HAT选择培养基在96孔细胞培养板上选择杂交瘤细胞，并利用 ELISA方法鉴定产生抗HE4抗体的细胞；保存所筛选到的产生与HE4特异结合的单克隆抗 体的细胞株；利用细胞发酵装置培养所保存的细胞株，收集细胞培养上清，再利用Protein A-S印harose亲和层析柱从细胞培养上清中进一步纯化抗HE4的单抗，SDS-PAGE及western blotting鉴定分离纯化的单抗。2)抗HE4的多抗的制备、纯化及鉴定用纯化的HE4免疫兔，免疫两次，间隔一个月；取兔的全血，先用(NH4)2SO4沉淀法 从兔的血清中初步纯化免疫球蛋白IgG，再用Protein A-S印harose亲和层析柱进一步纯 化抗HE4的IgG，SDS-PAGE及western blotting鉴定分离纯化的多抗。实施例3ELISA诊断试剂盒的研制DELISA板选择选择吸附性能好、空白值低、孔底透明度高、各板之间和同一板各孔之间性能相近的聚苯乙烯板；2)包被以pH 9. 6的碳酸盐缓冲液作为包被稀释液，在ELISA板孔中加入包被液 后，在4-8°C冰箱中放置过夜，37°C中保温2小时被认为具有同等的包被效果。一般蛋白质 的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml ；3)封闭以1 %明胶溶液为封闭液；4)酶底物溶液为 60ug/ml TMB, 0. 045% H2O2 于 0. lmol/L ρΗ6· 0 磷酸盐缓冲液 中；5)终止液2mol/L H2SO4 溶液；6)洗涤液0. Olmol/LpH 7. 4磷酸盐-NaCl缓冲液，该缓冲液内含0. 05 % Tween_20o7)操作步骤制定标准曲线将纯化的抗HE4多抗溶液用包被液稀释到1 μ g/ml，加入到96孔 酶标板中，每孔100 μ 1，37°C包被2小时或4°C过夜；洗涤液洗板3次，甩干，加入1 %白明胶 封闭，每孔200μ 1，室温保温2小时；洗涤液洗板3次，甩干，加入不同浓度的ΗΕ4标准抗原， 每孔100 μ 1，室温保温2小时，洗涤液洗板3次，甩干，加入抗ΗΕ4单抗溶液，每孔100 μ 1，室 温保存2小时，洗涤液洗板3次，甩干，加入二抗溶液，每孔100 μ 1，室温保温2小时，洗涤液 洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，暗处显色5分钟，加入终止液，每孔50 μ 1， 利用酶标仪在450nm测定光吸收值(A450nm)；以浓度为横坐标，A450nm为纵坐标，绘制标准 曲线。测定血清中的HE4浓度将纯化的抗HE4多抗溶液用包被液稀释到1 μ g/ml，加入 到96孔酶标板中，每孔100μ 1，37°C包被2小时或4°C过夜；洗涤液洗板3次，甩干，加入 1 %白明胶封闭，每孔200ul，室温保温2小时；洗涤液洗板3次，甩干，加入不同倍数稀释 的血清，每孔100 μ 1，室温保温2小时，洗涤液洗板3次，甩干，加入抗ΗΕ4单抗溶液，每孔 100 μ 1，室温保存2小时，洗涤液洗板3次，甩干，加入二抗溶液，每孔100 μ 1，室温保温2小 时，洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，暗处显色5分钟，加入终止液，每 孔50μ 1，利用酶标仪在450nm测定光吸收值(A450nm)；根据标准曲线，由所测得的A450求 得血清中HE4的浓度值。结果判定根据HE4作为卵巢癌的早期诊断及复发监测的指标，其cut-off值为 50pm/Lo实施例4试剂盒评价检测150例妇女血清HE4水平，其中50例体检健康妇女作为正常对照组(η = 46)，100例盆腔肿物住院患者按术后病理结果分为良性病变组(η = 56)和恶性病变组(η =44)。结果正常对照组血清ΗΕ4范围是22 48. 0pmol/L，均值为34. 5士5. 6pmol/L ；良 性病变组血清HE4范围是31 60pmol/L，均值为39士8pmol/L ；恶性病变组血清HE4范围 是32 1530pmol/L，均值为350士430pmol/L。恶性病变组HE4水平明显高于其他两组，差 异有统计学意义(P < 0. 001)。HE4在52pmol/L时诊断指数最大，灵敏性和特异性分别为 89% 禾口 95%。
权利要求
一种用于卵巢癌早期诊断、复发监测等用途的诊断试剂盒(双抗体夹心法酶联免疫法)的制备方法，所述试剂盒包括HE4标准蛋白、能与HE4特异结合的单克隆抗体和多克隆抗体、封闭液、酶标抗体、酶底物溶液、终止液和酶标板；
2.—种诊断试剂盒，包括能与HE4糖蛋白特异结合的单克隆抗体，以及与HE4特异性结 合的多克隆抗体，其中HE4多克隆抗体包被于酶标板，HE4单克隆抗体作为检测抗体；
3.—种诊断试剂盒，包括针对不同HE4糖蛋白抗原表位的两个单克隆抗体，其中一种 单克隆抗体包被于酶标板，另一种单克隆抗体作为检测抗体；
4.权利要求1所述，包括能产生权利要求2、3所述与HE4特异结合的单克隆抗体的杂 交瘤细胞；
5.权利要求1所述，包括诱导产生HE4多克隆抗体的方法1)HE4基因或蛋白免疫动物；2)收集免疫动物血清，纯化针对HE4的多克隆抗体；
6.权利要求1所述，HE4标准蛋白采用基因工程方法制成，为真核细胞表达的糖蛋白；
7.权利要求6中所述真核细胞为酵母细胞或哺乳动物细胞；
8.权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于所述封闭液为明胶溶液；
9.权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于所述酶标抗体为酶标记的种属抗 体，其既保有酶的催化活性，也保持了抗体的免疫活性，其中酶可为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)、喊性憐酸醇(alkaline phosohatase, AP)禾口亲禾口素等；
10.权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于所述酶底物溶液中的底物可为邻苯二 胺(0-phenylenediamine, 0PD)、四甲基联苯胺(3,3' ,5,5' -tetramethylbenzidine, TMB)、硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)和生物素等；
11.权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于所述终止液为2mol/LH2SO4溶液。
全文摘要
本发明涉及一种用于卵巢癌早期诊断、复发监测等用途的诊断试剂盒的制备方法。该发明包括标记物HE4在真核细胞的重组表达，及用真核细胞重组表达的HE4制备的单抗和多抗，以及用制备的单抗和多抗研制的诊断试剂盒(双抗体夹心法酶联免疫法)。利用基因工程的方法得到的真核细胞重组表达的HE4具有与天然HE4相同的糖基化程度，空间构象更接近天然抗原，以此制备的单抗或多抗作为包被抗体，以另一单抗作为酶标抗体研制的试剂盒，敏感性及特异性更高。
文档编号G01N33/577GK101949935SQ201010504789
公开日2011年1月19日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者周贞德, 郝振明 申请人:天津冠勤生物科技有限公司