专利名称：棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病原菌的酶联免疫检测领域。具体涉及一种棉花黄萎菌酶联免疫 检测试剂盒，以及利用此检测试剂盒在检测棉花黄萎菌上的用途。
背景技术：
棉花黄萎病造成棉花蕾、铃脱落和叶片枯死，严重影响棉花的产量和质量，是一种 危害严重的棉花病害。棉花黄萎病主要由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起，传播 途径广泛，棉籽、茎、叶、根和土壤、肥料、流水以及农田管理工具等均能传播棉花黄萎菌。控 制棉花黄萎病，减少其带来的经济损失，需要方便快捷、准确有效的检测方法。检测棉花黄萎病的方法包括传统的形态学方法、分子生物学技术如PCR、RFLP、 RAPD和免疫鉴定技术(马存.中国农学通报，1994，10 (3) :33_35)。传统的借助于病原微 生物形态学及病害症状进行检测的方法，存在时间长、难以准确判断的弊端。分子生物学检 测方法存在化学试剂和仪器设备昂贵，同时操作技术必需专业等问题。与之相比，酶联免疫 法在检测和诊断植物病害方面具有特异性强、灵敏度高、应用范围广、仪器简单、自动化程 度高、成本低、方便、快速、准确等优点(孙伟等.化学研究与应用，2002，14(5) 510-514 ； 王重庆.分子免疫学基础.北京大学出版社，1997 216-240)。目前，已有棉花黄萎病菌酶联免疫检测方法的相关报道，如利用间接ELISA方 法检测棉花黄萎病菌毒素(徐冬青等.南京农业大学学报，2000，23(1) 105-108)；利用 间接ELISA方法对于棉子携带黄萎病菌的快速检测(林玲等.棉花学报，2006，28 (6) 327-331)；利用A蛋白双抗体夹心ELISA方法特异性检测棉花黄萎病菌毒素(刘凤权等.棉 花学报，2003，15(1) :47-50)。但是上述方法都是用棉花黄萎菌毒素蛋白作为抗原免疫动物 得到抗血清，存在难度大，周期长等问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒。该检测试剂盒可为棉 花黄萎菌的检测及早期诊断提供简便、快速、准确的技术手段。本发明另一目的在于提供利用上述酶联免疫检测试剂盒在检测棉花黄萎菌上的 应用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下本发明棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒，包括棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体和 生物素标记抗体；所述的生物素标记抗体为N-羟基琥珀酰亚胺生物素标记的棉花黄萎菌 菌丝蛋白多克隆抗体。所述的检测试剂盒，还包括酶标板、阳性对照、阴性对照、缓冲液、封闭液、洗涤液、 亲和素、显色剂和终止液。所述的棉花黄萎菌主要是指大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，如V97、T9等， 均可公开获得。
所述的阳性对照为棉花黄萎菌菌丝蛋白溶液。所述的阴性对照为不含棉花黄萎菌的棉花组织蛋白提取液或蒸馏水等。所述的缓冲液为含有体积百分含量为0. 05%的TWeen-20(吐温-20)和质量百分 含量为0. 2%的PVP-40T(聚乙烯吡咯烷酮)的磷酸盐缓冲液(PBS)。所述的封闭液为含有质量百分含量为0. 2%的牛血清白蛋白的碳酸盐缓冲液。所 述的碳酸盐缓冲液的组成成分及其质量百分含量为Na2C03 0. 159%, NaHC030 . 29 3%，其余 为蒸馏水，PH9.6。所述的洗涤液为洗涤液A和洗涤液B。所述的洗涤液A (简写为PBS_T)为含有体积百分含量为0. 05%的Tween-20 (吐 温-20)的磷酸盐缓冲液。所述的洗涤液B(简写为Tris-HCl-T)为含有体积百分含量为0. 05 %的 Tween-20(吐温-20)的 1M Tris-HCl, pH9. 0。所述的亲和素为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。所述的显色剂，按照如下方法配制预先将四甲基联苯二胺(TMB)溶于二甲基亚 砜，配制成lmg/mL的TMB溶液。使用前，将TMB溶液加入底物缓冲液(其组成成分及其质 量百分含量为:Na2H3P04 1. 46%, C6H807 H20 0. 94%，其余为蒸馏水，pH4. 75)，使得TMB的 最终浓度为0. lmg/mL ；然后加入体积百分含量为0. 3%的H202。所述的终止液为2M的硫酸溶液。所述的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体，按照如下方法进行制备(a)将棉花黄萎菌接种于查彼克(Czapek)培养基(其组成成分及其质量百分含 量为NaN030. 2%, K2HP04 0.1%, KC1 0. 05%, MgS04 0 . 05%, FeS04 0 . 001%，蔗糖 3. 0%， 其余为蒸馏水)中，在25°C、110rpm条件下培养7d，在室温、5000rpm下离心lOmin，收集沉 淀，得病原菌菌丝；然后加入蛋白提取缓冲液(其组成为含有体积百分含量为0. 05%的 Tween-20和质量百分含量为0. 2%的PVP-40T的磷酸盐缓冲液)，超声波破碎菌丝体，镜检， 直到菌丝完全破碎；4°C、8000rpm条件下离心20min，弃沉淀；将上清液在4°C、12000rpm条 件下离心60min，弃沉淀，将上清液冷冻、干燥、浓缩，得到粉状的棉花黄萎菌菌丝蛋白，用作 免疫抗原和阳性对照。(b)将上述棉花黄萎菌菌丝蛋白与完全弗氏左剂(FCA)混合配制成菌丝蛋白lmg/ mL的溶液，对健康家兔进行背部皮下和腿部肌肉多点注射，并设一只不注射免疫抗原(棉 花黄萎菌菌丝蛋白)的家兔做对照；每隔15d进行一次免疫，注射的抗原溶液为将上述棉 花黄萎菌菌丝蛋白与不完全弗氏左剂(FICA)配制成的lmg/mL溶液，对首次免疫的家兔进 行背部皮下和腿部肌肉多点注射；每次免疫前进行皮下取血，检测抗体的产生程度；免疫5 次后耳静脉采血，分别得到棉花黄萎菌抗血清和阴性血清对照。(c)将采集的棉花黄萎菌抗血清和阴性血清对照，25°C静置4h，然后4°C静置过 夜，让血清充分析出；在4°C、5000rpm条件下离心30min，弃沉淀；将所得上层血清在4°C、 15000rpm条件下再离心lOmin，弃沉淀，获得更纯的抗血清；将所得抗血清_20°C保存。(d)将上述所得的lmL抗血清溶于9mL超纯水中，加入10mL饱和硫酸铵溶液 (3. 9M)，冰浴1 2h ；在lOOOOrpm条件下离心lOmin，弃上清液；将所得沉淀溶解于磷酸盐 缓冲液(PBS)中，4°C透析过夜；将透析过的溶液通过protien-A柱，在280nm获得两个吸收峰，第一个吸收峰为未被protien-A特异吸附的杂蛋白，第二个吸收峰所对应的蛋白为 protien-A特异吸附的多克隆抗体蛋白；收集第二个吸收峰，即为纯化的棉花黄萎菌菌丝 蛋白多克隆抗体。所述的生物素标记抗体，按照如下方法进行制备将N-羟基琥珀酰亚胺脂生物素lmg溶于lmL 二甲基亚砜(DMS0)中；lmL纯化后 的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体(浓度为lmg/mL)在碳酸盐缓冲液(其组成成分及其质 量百分含量为Na2C030. 159%,NaHC03,0 . 29 3%，其余为蒸馏水，pH9. 6)中4°C透析过夜；透 析后的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体lmL加N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液100 y L，室温反 应30min ；加入浓度为1M的Tris_HCl (pH7. 4) 100 u L终止反应；在质量百分含量为0. 85% 的NaCl溶液中4°C透析过夜，得到生物素标记抗体；然后将生物素标记抗体与甘油按照体 积比为1 1的比例混合，-20°C保存。利用上述棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒检测棉花黄萎菌的方法，包括如下步 骤(1)样品前处理。将待测棉花组织(如根、茎或叶等)加入液氮研磨粉碎，并加入 5倍体积的蛋白提取液(其组成成分及其比例为含有体积百分含量为0. 05%的Tween-20 和质量百分含量为0.2%的PVP-40T的磷酸盐缓冲液(PBS))，4°C浸提12h，然后在4°C、 8000rpm条件下离心20min，收集上清液；再在4°C、12000rpm条件下离心lh，收集上清液， 即为待测样品；(2)包被在96孔酶标板每孔中加入包被液100 u L，4°C过夜；弃包被液，洗涤液A 洗板3次，每次静置3min，甩干；所述的包被液为以碳酸盐缓冲液为溶剂的棉花黄萎菌菌丝 蛋白多克隆抗体溶液；(3)封闭每孔加入封闭液200 u L，37°C孵育lh ；弃封闭液，洗涤液A洗板3次，每 次静置3min，甩干；(4)加样将步骤(1)所得上清液和阳性对照、阴性对照各100 u L分别加入酶标 板的不同点样孔中；37°C孵育lh ；洗涤液A洗板3次，每次静置3min，甩干；(5)加生物素标记抗体和酶标抗体每孔加生物素标记抗体100 u L，37°C下孵育 lh，洗涤液A(PBS-T)洗板3次，每次静置3min，甩干；然后每孔加入辣根过氧化物酶标记链 霉亲和素(SA-HRP) 100 u L，37°C下孵育30min，用洗涤液B (Tris-HCl-T)洗板3次，每次静 置3min,甩干；(6)每孔加显色液100iiL，37°C下孵育10 15min ；然后向各孔中加入终止液 100 u L终止反应，于酶标仪上在450nm波长下测定吸光度(0D45Q)值，以P/N彡2. 1作为阳 性判断标准(其中P代表待测样品在450nm波长下测定吸光度(0D45CI)值；N代表阴性对照 在450nm波长下测定吸光度(0D45CI)值)，即含有棉花黄萎菌。同时，根据黄萎菌菌丝蛋白含 量和吸光度值的标准曲线换算出待测样品中的黄萎菌菌丝蛋白含量。与现有技术相比，本发明双抗体夹心法棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒，具有如 下优点(1)灵敏度高，可以检测到样品中ng级水平的棉花黄萎菌；(2)操作简便，普通工 作人员经过简单培训就可以完成；(3)重复性好，检测结果稳定可靠；(4)对仪器要求低，仅 需普通恒温水浴箱，酶标仪等。如只需定性检测，则可通过目测，不需酶标仪；(5)本发明 使用棉花黄萎菌菌丝蛋白作为免疫原制备抗血清，方便简洁，成本低，适于进行大规模的检测；(6)本发明为棉花黄萎病的早期诊断和防治以及棉花杂交育种后代的早期选择提供了 有效的技术手段。
图1应用本发明酶联免疫检测试剂盒检测不同棉株根、茎、叶内棉花黄萎菌含量 柱形图。图2感病品种鄂荆1号叶、根、茎的棉花黄萎菌含量检测柱形图。图3耐病品种中棉所12号叶、根、茎的棉花黄萎菌含量检测柱形图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但是不构成对本发明的保护范围构成 任何限制。实施例1棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体的制备(1)抗原的制备将棉花黄萎病菌(大丽轮枝菌(VerticiIlium dahliae)V97)接种 于Czapek(查彼克)培养基(其组成成分及其质量百分含量为NaN030.2%，K2HP04 0. 1%, KC1 0. 05%,MgS04 0 . 05%,FeS04 0 . 001 %，蔗糖 3. 0%，其余为蒸馏水)中，在 25°C、llOrpm 条件下培养7d，在室温、5000rpm条件下离心lOmin，收集沉淀，获得棉花黄萎菌菌丝；然 后加入蛋白提取液(蛋白提取液的组成成分及其比例为含有体积百分含量为0. 05%的 Tween-20和质量百分含量为0. 2%的PVP-40T的磷酸盐缓冲液)，超声波破碎菌丝体，镜 检，直到菌丝完全破碎；在4°C、8000rpm条件下离心20min，弃沉淀；将所得上清液在4°C、 12000rpm条件下离心60min，弃沉淀，将上清液冷冻、干燥、浓缩，得到粉状的棉花黄萎菌菌 丝蛋白，用作免疫抗原和阳性对照。(2)免疫将步骤(1)所得的棉花黄萎病菌丝蛋白与完全弗氏左剂(FCA)混合配制 成浓度为lmg/mL的抗原溶液，对健康家兔进行背部皮下和腿部肌肉多点注射；并设一只不 注射免疫抗原(棉花黄萎菌菌丝蛋白)的家兔做对照；然后每隔15d进行免疫1次，免疫抗 原溶液为步骤(1)所得的棉花黄萎病菌丝蛋白与不完全弗氏左剂(FICA)混合配制的浓度 为lmg/mL的抗原溶液，对首次免疫的家兔进行背部皮下和腿部肌肉多点注射；每次免疫前 进行皮下取血，检测抗体的产生程度。(3)抗血清的分离免疫5次后耳静脉采血，得到含有抗血清蛋白的新鲜血液；将采 集的新鲜血液25°C静置4h，然后4°C静置过夜，让血清充分析出；在4°C、5000rpm条件下离 心30min，弃沉淀；将所得上层血清在4°C、15000rpm条件下再离心lOmin，弃沉淀，获得更纯 的抗血清；将所得抗血清-20°C保存。(4)棉花黄萎菌多克隆抗体的分离将上述所得的抗血清lmL溶于9mL超纯水中， 然后加入10mL饱和硫酸铵溶液(3. 9M)，冰浴1 2h，再在lOOOOrpm条件下离心lOmin， 弃上清液；将所得沉淀溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，4°C透析过夜；将透析过的溶液通过 protien-A柱，在280nm获得两个吸收峰，第一个吸收峰为未被protien-A特异吸附的杂蛋 白，第二个吸收峰所对应的蛋白为protien-A特异吸附的多克隆抗体蛋白；收集第二个吸 收峰，即为纯化的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体。实施例2棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒的制备
按照如下方法进行(1)生物素标记抗体的制备将N-羟基琥珀酰亚胺酯生物素lmg溶于lmL 二甲基 亚砜(DMS0)中；将实施例1中所得棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体lmL(浓度为lmg/mL)在 碳酸盐缓冲液(其组成成分及其重量百分含量为Na2C030. 159%, NaHC03,0 . 29 3%，其余为 蒸馏水，pH9. 6)中4°C透析过夜；透析后的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体lmL加上N-羟 基琥珀酰亚胺酯溶液100 u L，室温反应30min ；加入浓度为1M的Tris-HCl (pH7. 4) 100 u L 终止反应；在质量百分含量为0. 85%的NaCl溶液中4°C透析过夜，得到生物素标记抗体； 然后将生物素标记抗体与甘油按照体积比为1 1的比例混合，-20°C保存。(2)棉花黄萎病菌菌丝蛋白多克隆抗体预包被条的制备A.包被用碳酸盐缓冲液(组成成分同上)将实施例1所得棉花黄萎菌菌丝蛋白 多克隆抗体稀释500倍，100 u L/孔包被于酶标板上，4°C过夜。B.封闭每孔加入200 PL封闭液(含质量百分含量为0.2%的牛血清白蛋白的碳 酸盐缓冲液)，37°C孵育lh。C.干燥37°C下尽量干燥。(3)底物缓冲液的配制Na2H3P040. 73g, C6H807. H20 0. 47g,定容至 50mL, pH4. 75。(4)其他试剂的配制洗涤液A 含体积百分含量为0. 05 %的吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS-T) (pH7. 4)，其组成成分为称取 KH2P040. 2g，Na2HP04. 12H20 2. 9g，NaCl 8. Og, KC1 0. 2g，吐 温-20500 u L，超纯水lOOOmL，混合均勻。洗涤液B 含有体积百分含量为0. 05 %的吐温-20的1M的Tri s_HCl缓冲液 (pH9. 0)(Tris-HCl-T)。蛋白提取液含体积百分含量为0.05%的吐温-20和质量百分含量为0.2%的 PVP-40T (聚乙烯吡咯烷酮)的磷酸盐缓冲液。生物素标记抗体稀释液含体积百分含量为0. 05%的吐温-20和质量百分含量为 0. 2 %的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。HRP稀释液含有质量百分含量为0. 牛血清白蛋白的0. 5M的Tris_HCl。显色液预先将四甲基联苯二胺(TMB)溶于二甲基亚砜，配制成lmg/mL的TMB 溶液。使用前，将TMB溶液加入底物缓冲液(其组成成分及其质量百分含量为Na2H3P04 1.46%, C6H807 H20 0. 94%,其余为蒸馏水，pH4. 75)，使得TMB的最终浓度为0. lmg/mL ；然 后加入体积百分含量为0. 3%的H202。 终止液2M的H2S04溶液。阴性对照不含棉花黄萎病菌的棉花组织蛋白提取液或蒸馏水等。阳性对照棉花黄萎病菌菌丝蛋白提取液。利用上述棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒检测棉花黄萎菌的方法(a)样品处理将0. 2g棉花新鲜叶片组织，加入液氮研磨粉碎，至离心管中，加入5 倍体积的蛋白提取液，在4°C、8000rpm条件下离心20min，收集上清液；再将所得上清液在 4°CU2000rpm条件下离心lh，收集上清液。(b)包被在96孔酶标板每孔中加入包被液(用碳酸盐缓冲液溶解的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体)100 u L，4°C过夜；弃包被液，洗涤液A洗板3次，每次静置3min，甩 干；(c)封闭每孔加入200 PL封闭液(含质量百分含量为0.2%的牛血清白蛋白的 碳酸盐缓冲液)，37°C孵育lh。弃封闭液，洗涤液A洗板3次，每次静置3min，甩干；(d)加样将(a)所得样品的上清液和阳性对照、阴性对照各lOOiiL分别加入酶 标板上的不同点样孔中；37°C温浴lh ；洗涤液A(PBS-T)洗板3次，每次静置3min，甩干。(e)加生物素标记抗体各孔加生物素标记抗体100 u L，37°C下孵育lh，洗涤液A 洗酶标板板3次。(f)加酶标亲和素所有孔均加入HRP液稀释的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 (SA-HRP) 100 u L，37°C下孵育30min，用洗涤液B洗板3次。(g)显色每孔加入显色液lOOii L，37°C下避光孵育10 15min。(h)终止每孔分别加入终止液100 u L终止反应。(i)检测在450nm波长下测定吸光度(0D45Q)值。结果判断根据测定所得吸光度值，以P/N ^ 2. 1作为阳性判断标准(其中P代表 待测样品在450nm波长下测定吸光度(0D45CI)值；N代表阴性对照在450nm波长下测定吸光 度(0D45CI)值)，即含有棉花黄萎菌。同时，根据黄萎菌菌丝蛋白含量和吸光度值的标准曲线 换算出待测样品中的黄萎菌菌丝蛋白含量。实施例3棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒的检测试验按照如下方法进行在河北省高阳县北于八村实验田选取棉花耐黄萎病品种冀棉151的黄萎病病株 和健株，分别称取根、茎、叶各lg，进行液氮研磨并加入5倍的棉花黄萎菌菌丝蛋白提取液 (含体积百分含量为0. 05 %的Tween-20和质量百分含量为0. 2 %的聚乙烯吡咯烷酮的磷酸 盐缓冲溶液(PBS))，4°C浸提12h，在4°C、8000rpm条件下离心20min，弃沉淀；将所得上清 液在4°C、12000rpm条件下离心lh，弃沉淀；将所得上清液以100 u L/孔加入酶标板的点样 孔中，同时取实施例1中所配制的阳性对照液和阴性对照液各100 y L，分别加入另外的点 样孔中；37°C孵育lh ；用洗涤液A洗板3次，每次静置3min，甩干。向各孔中加100 u L生物 素标记抗体稀释液(含有质量百分含量为0. 2%牛血清白蛋白的PBS-T)稀释后的生物素标 记抗体，37°C下孵育lh，用洗涤液A洗板3次，每次静置3min，甩干；向各孔中加入HRP稀释 液稀释后的辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(SA-HRP) lOOii L，37°C下孵育30min，用洗涤 液B洗板3次每次静置3min，甩干。每孔加显色液100 y L，37°C下避光孵育10 15min。 加终止液100 U L终止反应，于酶标仪上在450nm波长下测定吸光度(0D45C1)值。结果(见 图1)在三株病株和健康株体内都检测到棉花黄萎菌，根、茎、叶三个部位相比，叶部含菌量 最高。表明本发明棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒可以在具有棉花黄萎病典型症状的成株 根、茎、叶检测出病原菌存在，在不显症的植株上也能够检测出大丽轮枝菌。说明本发明检 测试剂盒可以为田间早期防治棉花黄萎病或者棉花育种后代的选择提供依据。实施例4本发明棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒的检测试验按照如下方法进行选择棉花感黄萎病品种鄂荆1号和耐黄萎病品种中棉所12号，采用切根蘸孢子法 人工接种棉花黄萎菌V97，然后在接种后第3、7、14、21、28d时分别取两个品种的根、茎、叶各lg，采用和实施例3同样的方法进行检测，设不接种棉苗为对照。结果(见图2和图3) 不论是鄂荆1号还是中棉所12号，接种的早期阶段只能够在棉花的根部检测出病原菌，后 期阶段能够检测到根、茎、叶中均含有病原菌。两个品种中根部棉花黄萎菌的含量都要高于 茎和叶部，随时间的推移黄萎菌含量不断增高。接种初期(第3和第7d)中棉所12号的黄 萎菌含量较高，接种后期(从14d起)鄂荆1号的所有部位中黄萎菌含量急剧增加；而中棉 所12号即使根部黄萎菌含量较高，但是叶和茎的黄萎菌含量却远比根部低得多(第21和 第28d)，表明耐病品种中棉12号阻断了棉花黄萎菌在植株体内向上的传播。表明本发明棉 花黄萎病菌酶联免疫检测试剂盒可用于对棉花品种的抗棉花黄萎菌的早期检测，为棉花黄 萎病的早期诊断和防治，以及对棉花育种的杂交后代选择提供依据，从而节约大量人力、物 力。
权利要求
棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包括棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体和生物素标记抗体，所述的生物素标记抗体为N 羟基琥珀酰亚胺酯生物素标记的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体。
2.按照权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于还包括酶标板、阳性对照、阴性对 照、缓冲液、封闭液、洗涤液、亲和素、显色剂和终止液。
3.按照权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照为棉花黄萎菌 菌丝蛋白溶液；所述的阴性对照为不含棉花黄萎菌的棉花组织蛋白提取液或蒸馏水。
4.按照权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于所述的缓冲液为含有体积百分含量 为0. 05%的Tween-20和质量百分含量为0. 2%的PVP-40T的磷酸盐缓冲液；所述的封闭液 为含有质量百分含量为0. 2%的牛血清白蛋白的碳酸盐缓冲液；其中所述的碳酸盐缓冲液 的组成成分及其质量百分含量为Na2C030. 159%,NaHC030 . 29 3%，其余为蒸馏水。
5.按照权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为洗涤液A和洗涤液 B ；所述的洗涤液A为含有体积百分含量为0. 05%的Tween-20的磷酸盐缓冲液；所述的洗 涤液B为含有体积百分含量为0. 05%的Tween-20的lMTris_HCl。
6.按照权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于所述的亲和素为辣根过氧化物酶标 记的链霉亲和素；所述的终止液为2M的硫酸溶液。
7.按照权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于所述的显色剂，按照如下方法配制 将TMB溶于二甲基亚砜，配制成lmg/mL的TMB溶液；使用前，将TMB溶液加入底物缓冲液， 使得TMB的最终浓度为0. lmg/mL ；然后加入体积百分含量为0. 3%的过氧化氢；其中所述 的底物缓冲液的组成成分及其质量百分含量为Na2H3P04l. 46%, C6H807 H20 0. 94%，其余 为蒸馏水。
8.利用权利要求1 7任一所述的检测试剂盒检测棉花黄萎菌的方法，包括如下步骤(1)将待测棉花组织加入液氮研磨粉碎，并加入5倍体积的蛋白提取液，4°C浸提12h， 然后在4°C、8000rpm条件下离心20min，收集上清液；再在4°C、12000rpm条件下离心lh，收 集上清液，即为待测样品；其中所述的蛋白提取液的组成成分及其比例为含有体积百分 含量为0. 05%的Tween-20和质量百分含量为0. 2%的PVP-40T的磷酸盐缓冲液；(2)在96孔酶标板每孔中加入包被液100u L，4°C过夜；弃包被液，洗涤液A洗板3次， 每次静置3min，甩干；所述的包被液为以碳酸盐缓冲液为溶剂的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克 隆抗体溶液；(3)每孔加入封闭液200u L，37°C孵育lh ；弃封闭液，洗涤液A洗板3次，每次静置 3min,甩干；(4)将步骤(1)所得上清液和阳性对照、阴性对照各100yL分别加入酶标板的不同点 样孔中；37°C孵育lh ；洗涤液A洗板3次，每次静置3min，甩干；其中所述的阳性对照为棉 花黄萎菌菌丝蛋白溶液；所述的阴性对照为不含棉花黄萎菌的棉花组织蛋白提取液或蒸馏 水；(5)每孔加生物素标记抗体100i!L，37°C下孵育lh，洗涤液A(PBS-T)洗板3次，每次 静置3min，甩干；然后所有孔均加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素100y L，37°C下孵育 30min,用洗涤液B洗板3次，每次静置3min，甩干；(6)每孔加显色液100yL，37°C下孵育10 15min ；然后向各孔中加入终止液100 u L 终止反应，于酶标仪上在450nm波长下测定吸光度OD450值，以P/N彡`2. 1作为阳性判断标 准；其中P代表待测样品在450nm波长下测定吸光度OD450值；N代表阴性对照在450nm波 长下测定吸光度0D45(I值，即含有棉花黄萎菌；同时，根据黄萎菌菌丝蛋白含量和吸光度值 的标准曲线换算出待测样品中的黄萎菌菌丝蛋白含量。
9.按照权利要求8所述的检测棉花黄萎菌的方法，其特征在于所述的棉花黄萎菌菌丝 蛋白多克隆抗体，按照如下方法进行制备(a)将棉花黄萎菌接种于查彼克培养基中，在25°C、110rpm条件下培养7d，在室温、 5000rpm下离心lOmin，收集沉淀，得病原菌菌丝；然后加入菌丝蛋白提取液(其组成为 含有体积百分含量为0. 05%的Tween-20和质量百分含量为0. 2%的PVP-40T的磷酸盐缓 冲液)，超声波破碎菌丝体，镜检，直到菌丝完全破碎；4°C、8000rpm条件下离心20min，弃 去沉淀；将上清液在4°C、12000rpm条件下离心60min，弃沉淀，将上清液冷冻、干燥、浓缩， 得到粉状的棉花黄萎菌菌丝蛋白，用作免疫抗原和阳性对照；其中所述的查彼克培养基的 组成成分及其质量百分含量为NaN03 0. 2%, K2HP04 0. 1%, KC1 0.05%, MgS04 0 . 05%, FeS040 . 001%，蔗糖3.0%，其余为蒸馏水；所述的蛋白提取液的组成成分及其比例为含有 体积百分含量为0. 05%的Tween-20和质量百分含量为0. 2%的PVP-40T的磷酸盐缓冲液；(b)将步骤(a)所得的棉花黄萎菌菌丝蛋白与完全弗氏左剂混合配制成菌丝蛋白浓度 为lmg/mL的溶液，对健康家兔进行背部皮下和腿部肌肉多点注射，并设一只不注射免疫抗 原的家兔做对照；每隔15d进行一次免疫，注射的抗原溶液为将上述棉花黄萎菌菌丝蛋白 与不完全弗氏左剂配制成的浓度为lmg/mL的抗原溶液，对首次免疫的家兔进行背部皮下 和腿部肌肉多点注射；每次免疫前进行皮下取血，检测抗体的产生程度；免疫5次后耳静脉 采血，分别得到棉花黄萎菌抗血清和阴性血清对照；(c)将采集的棉花黄萎菌抗血清和阴性血清对照，25°C静置4h，然后4°C静置过夜， 让血清充分析出；在4°C、5000rpm条件下离心30min，弃沉淀；将所得上层血清在4°C、 15000rpm条件下再离心lOmin，弃沉淀，获得更纯的抗血清；(d)将步骤(c)所得的抗血清lmL溶于9mL超纯水中，加入饱和硫酸铵溶液10mL，冰浴 1 2h ；在lOOOOrpm条件下离心lOmin，弃上清液；将所得沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，4°C 透析过夜；将透析过的溶液通过protien-A柱，在280nm获得两个吸收峰，第一个吸收峰为 未被protien-A特异吸附的杂蛋白，第二个吸收峰所对应的蛋白为protien-A特异吸附的 多克隆抗体蛋白；收集第二个吸收峰，即为纯化的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体。
10.按照权利要求8所述的检测方法，其特征在于所述的生物素标记抗体，按照如下方 法进行制备将N-羟基琥珀酰亚胺酯生物素lmg溶于lmL 二甲基亚砜(DMS0)中；将浓度 为lmg/mL的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体lmL在碳酸盐缓冲液中4°C透析过夜；透析 后的棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体lmL加N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液lOOyL，室温反应 30min ；再加入浓度为1M的Tris_HC1100 u L终止反应；在质量百分含量为0. 85%的NaCl 溶液中4°C透析过夜，得到生物素标记抗体。
全文摘要
本发明公开了一种棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒，包括棉花黄萎菌菌丝蛋白多克隆抗体和生物素标记抗体，以及酶标板、阳性对照、阴性对照、缓冲液、封闭液、洗涤液、亲和素、显色剂和终止液等。本发明还公开了利用所述棉花黄萎菌酶联免疫检测试剂盒检测棉花黄萎菌的方法。本发明具有灵敏度高、操作简便、重复性好、检测结果稳定可靠、对仪器要求低等优点，尤其本发明使用棉花黄萎菌菌丝蛋白作为免疫原制备抗血清，方便简洁，成本低，适于进行大规模的检测，本发明为棉花黄萎病的早期诊断和防治以及棉花杂交育种后代的早期选择提供了有效的技术手段。
文档编号G01N33/569GK101975858SQ20101050826
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者李宝庆, 李社增, 郭庆港, 马平, 鹿秀云 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所