专利名称：壳聚糖-量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法
技术领域：
本发明属于纳米材料用于标记生物及生物体系的分析检测技术领域，更具体涉及 一种壳聚糖-量子点荧光探针用于狗肾细胞标记的方法，通过对细胞组分以及亚细胞结构 的标记，可以用于的细胞的生理活动研究，也可用于细胞内外各类受体的运输途径研究及 外源性污染物与细胞相互作用的研究。
背景技术：
壳聚糖是由甲壳素脱去乙酰基的产物，其大分子链上分布着许多羟基和氨基。壳 聚糖除具有多功能性、生物相容性、生物降解性，和低细胞毒性等优越性之外，还具有独特 的跨细胞膜能力。但是由于壳聚糖只溶于稀酸和某些特定的溶剂，大大限制了它的应用。羧 甲基壳聚糖是壳聚糖经羧甲基化反应后的形成的一类甲壳素衍生物，由于羧甲基壳聚糖上 所含的-C00-降低了 -NH3+的电荷密度，使得羧甲基壳聚糖的细胞毒性降低，具有比壳聚糖 更好的细胞相容性；并且由于羧甲基壳聚糖溶于水，扩展了它的应用范围。量子点(Quantum dots, QDs) 又称半导体纳米微晶体(Semiconductor nanocrystals)，是半径小于或接近于激子玻尔半径的一类半导体纳米粒子。量子点具有一 般纳米微粒的基本性质如表面效应、体积效应和量子尺寸效应，具有宽的激发光谱、窄的发 射光谱、可精确调谐的发射波长、可忽略的光漂白等优越的荧光特性。正是基于量子点独特 的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学以及蛋白质组学等研究 中有着极大的应用前景。但是作为一种纳米材料，由于自身的物理化学性质和环境因素的 影响，量子点在应用的过程中也表现出了一定的生物毒性效应，如何提高量子点荧光探针 的稳定性和生物相容性是目前迫切需要解决的问题。狗肾细胞通常用于流感病毒的分离与鉴定，1958年从正常的雄性考克斯班尼犬的 肾脏建立了该细胞系。该细胞系是一种小犬肾细胞，其特点是细胞汇合后表达分化的上皮 细胞特性，易于培养和传代。
发明内容
本发明的目的在于针对目前各类量子点荧光探针在应用上的缺陷，提供了一种壳 聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，把羧甲基壳聚糖良好的细胞相容性和量子点 优越的荧光性能结合起来，利用它们在水相通过自组装形成荧光探针，然后用于细胞标记。 用荧光显微镜观察狗肾细胞的标记情况，用流式细胞仪检测培养皿中狗肾细胞的平均荧光 强度。本发明操作简便，荧光效率高、生物相容性好、稳定时间长，荧光探针无细胞毒性，可 用于细胞的长时间的观测。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施
本发明的基本构思是根据羧甲基壳聚糖和CdTe量子点自身的特性，在水相通过自组 装形成壳聚糖_量子点荧光探针，将该荧光探针与狗肾细胞在DMEM营养液中、于37°C、5% 体积分数的CO2细胞培养箱(下同)中共同孵育，壳聚糖_量子点荧光探针通过狗肾细胞的
3胞饮、胞吞或吞噬等方式进入细胞内部，与细胞中的蛋白质结合，达到对狗肾细胞进行荧光 标记的目的。—种壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，包括如下步骤
1、配制0.0000025-0. 001mol/L的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液(羧甲基壳聚 糖-CdTe量子点自制，制备的简要过程如下=CdCl2溶液和巯基乙酸溶液混合均勻后用NaOH 溶液调整其PH值为碱性，再向该溶液中加入新制备的KTeH4溶液。将此混合液转入聚四 氟乙烯微波消解罐，放入可控温的微波加热系统进行加热，反应完成后待溶液冷却至室温 20-25°C，即可得到CdTe量子点溶液。根据微波加热的温度不同，CdTe量子点的荧光将 会由绿色逐渐变化为红色。将不同颜色的CdTe量子点与羧甲基壳聚糖溶液混合反应即 可生成相应荧光的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点荧光探针，本领域的普通技术人员不付出任 何创造性劳动均能制备)根据羧甲基壳聚糖-CdTe量子点的浓度，用移液管移取0.广5ml 的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液于灭菌的IOml容量瓶中，加入高纯水(电阻率大于18 ΜΩ 定容，备用；所选用的壳聚糖-量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点 在水相反应形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2、将T25细胞培养瓶中已长满且生长状态良好的狗肾细胞(MDCK)用0.05%体积比的 EDTA-胰蛋白酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取1 X IO4^l X IO7的狗肾细胞接种到到细 胞培养皿中，加入含10%体积比的胎牛血清的DMEM营养液。在37°C、5%体积比的CO2细胞 培养箱中培养，使细胞正常贴壁生长繁育，得到用于实施标记的狗肾细胞。3、待步骤2狗肾细胞贴壁生长12 36小时后，向培养皿中加入壳聚糖-量子点荧 光探针，于37°C、5%体积比的CO2细胞培养箱中与细胞共同孵育6 48小时，即可得到带有 荧光的狗肾细胞。弃去营养液，用磷酸盐缓冲溶液(PH=7. 4)洗涤2次，即可用荧光显微镜 观察标记情况。所述的壳聚糖_量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静 电络合、共价结合、螯合方式自组装形成。所述的标记的细胞为狗肾细胞。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
本发明的壳聚糖-量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法操作简便，细胞对荧光探 针的生物相容性好，荧光探针未显示细胞毒性，标记后细胞的平均荧光强度及颜色可控，稳 定时间长，不影响细胞的正常生长。细胞能够根据需要标记为不同的颜色且细胞的荧光强 度稳定。该方法可用于活细胞的较长时间(48小时)观测及细胞的生理活动研究，也可用于 细胞内外各类受体的运输途径研究及外源性污染物与细胞相互作用的研究。
图IA为绿色壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的荧光显微镜照片示意图。图IB为红色壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的荧光显微镜照片示意图。图2A为未标记时狗肾细胞的生长状况明场照片示意图。图2B为标记12小时后狗肾细胞的生长状况明场照片示意图。图2C为标记24小时后狗肾细胞的生长状况明场照片示意图。图2D为标记48小时后狗肾细胞的生长状况明场照片示意图。
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图2E为壳聚糖_量子点荧光探针进入狗肾细胞的不同阶段(从1到4显示的是荧 光探针刚进入细胞到充满整个细胞的过程)荧光照片示意图。图2F为壳聚糖_量子点荧光探针进入狗肾细胞的不同阶段(从1到4显示的是荧 光探针刚进入细胞到充满整个细胞的过程)明场照片示意图。图3A为流式细胞仪检测未标记时狗肾细胞的平均荧光强度示意图(阴性对照)。图3B为流式细胞仪检测用0. 00005mol/L的荧光探针标记狗肾细胞后细胞的平均 荧光强度示意图。图3C为流式细胞仪检测用0. 0001mol/L的荧光探针标记狗肾细胞后细胞的平均
荧光强度示意图。图3D为流式细胞仪检测用0. 00025mol/L的荧光探针标记狗肾细胞后细胞的平均
荧光强度示意图。图3E为流式细胞仪检测用0. 0005mol/L的荧光探针标记狗肾细胞后细胞的平均
荧光强度示意图。图3F为流式细胞仪检测用0. OOlmol/L的荧光探针标记狗肾细胞后细胞的平均荧
光强度示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明要求保护的范围，以下所述实施实例所用溶剂均为电阻率大于18 ΜΩ · cm的高纯水，所用试剂均为分析纯试剂。实施例1
一种壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，包括如下步骤 1.配制0. 0005mol/L的绿色和红色羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液 分别用移液管移取2. 5mL0. 002mol/L的绿色和红色羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液于 灭菌的IOmL容量瓶中，加入高纯水(电阻率大于18 ΜΩ · cm)定容，备用。所选用的壳聚 糖_量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静电络合、共价结合、螯 合作用等方式自组装形成，具有良好的水溶性和生物相容性；(羧甲基壳聚糖-CdTe量子点 自制，制备的简要过程如下=CdCl2溶液和巯基乙酸溶液混合均勻后用NaOH溶液调整其pH 值为碱性，再向该溶液中加入新制备的KTeH4溶液。将此混合液转入聚四氟乙烯微波消解 罐，放入可控温的微波加热系统进行加热，反应完成后待溶液冷却至室温20-25°C，即可得 到CdTe量子点溶液。根据微波加热的温度不同，CdTe量子点的荧光将会由绿色逐渐变化 为红色。将不同颜色的CdTe量子点与羧甲基壳聚糖溶液混合反应即可生成相应荧光的羧 甲基壳聚糖-CdTe量子点荧光探针，本领域的普通技术人员不付出任何创造性劳动均能制
2.狗肾细胞的培养
将T25细胞培养瓶中已长满且生长状态良好的狗肾细胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取1 X IO6的狗肾细胞分别接种到2个细胞培养皿中， 加入含10%体积比的胎牛血清的DMEM(美国Gbico公司)营养液。在37°C、5%体积比的CO2 细胞培养箱中培养。得到用于实施荧光标记的狗肾细胞。
3.羧甲基壳聚糖-CdTe量子点荧光探针对狗肾细胞的标记
待步骤2所述的狗肾细胞贴壁生长18小时后，向培养皿中分别加入步骤1所述的绿色 和红色壳聚糖_量子点荧光探针，于37°C、5%体积比的CO2细胞培养箱中与细胞共同孵育， 24小时后弃去营养液，磷酸盐缓冲溶液(pH=7. 4)洗涤2次，用荧光显微镜观察标记情况，结 果表明狗肾细胞已成功标记上绿色和红色荧光(见图IA和图1B)。所述的壳聚糖_量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静 电络合、共价结合、螯合方式自组装形成。所述的标记的细胞为狗肾细胞。实施例2:
一种壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，其步骤如下
1.配制0.0001mol/L的的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液
用移液管移取0. 5mL0. 002mol/L的黄绿色羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液于灭菌的 IOmL容量瓶中，加入高纯水(电阻率大于18 M Ω · cm)定容，备用。所选用的壳聚糖-量子 点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静电络合、共价结合、螯合作用等 方式自组装形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2.狗肾细胞的培养
将T25细胞培养瓶中已长满且生长状态良好的狗肾细胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取1 X IO5的狗肾细胞接种到细胞培养皿中，加入含10% 胎牛血清的DMEM营养液。在37°C、5%体积比的CO2细胞培养箱中培养，得到用于实施荧光 标记的狗肾细胞。3.羧甲基壳聚糖-CdTe量子点荧光探针对狗肾细胞标记后形态学观察 待步骤2所述的狗肾细胞贴壁生长28小时后，向培养皿中加入步骤1所述的壳聚
糖_量子点荧光探针，于37°C、5%体积比的CO2细胞培养箱中与细胞共同孵育。于0、12、 24,48小时用显微镜观察细胞生长情况，结果表明标记后的狗肾细胞在(Γ48小时的时间内 均能正常贴壁生长，没有出现溶胀、脱落及凋亡，说明细胞对荧光探针的生物相容性良好， 荧光探针未显示细胞毒性(见图2A、2B、2C、2D、2E、2F)。所述的壳聚糖_量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静 电络合、共价结合、螯合方式自组装形成。所述的标记的细胞为狗肾细胞。其它步骤与实施例1相同。实施例3
一种壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，其步骤如下
1.配制0、0· 00005,0. 0001,0. 00025,0. 0005,0. 001mol/L 的的羧甲基壳聚糖-CdTe 量 子点溶液
用移液管移取0、0. 25,0. 5,1. 25,2. 5、5mL0. 002mol/L的黄绿色羧甲基壳聚糖-CdTe量 子点溶液于灭菌的IOmL容量瓶中，加入高纯水(电阻率大于18 ΜΩ 定容，备用。所选 用的壳聚糖-量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静电络合、共价 结合、螯合作用等方式自组装形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2.狗肾细胞的培养
6将T25细胞培养瓶中已长满且生长状态良好的狗肾细胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取1 X IO7的狗肾细胞分别接种到6个细胞培养皿中， 加入含10%胎牛血清的DMEM营养液。在37°C、5%体积比的CO2细胞培养箱中培养，得到用 于实施荧光标记的狗肾细胞。3.羧甲基壳聚糖-CdTe量子点荧光探针对狗肾细胞标记后细胞显示不同的平均 荧光强度；
待步骤2所述的狗肾细胞贴壁生长24小时后，向培养皿中分别加入步骤1所述的壳 聚糖_量子点荧光探针，于37°C、5%体积比的CO2细胞培养箱中与细胞共同孵育，同时做阴 性对照。24小时后弃去营养液，磷酸盐缓冲溶液(pH=7. 4)洗涤2次，用0. 05%EDTA_胰蛋 白酶将培养皿上的细胞消化为单细胞悬浮液，置于载玻片上用荧光显微镜观察标记情况， 同时用流式细胞仪检测不同培养皿中狗肾细胞的平均荧光强度。结果表明狗肾细胞已成功 标记上荧光，并显示出不同的荧光强度，随荧光探针浓度的增加，细胞平均荧光强度由50 a. u.变化到5000 a. u.(见图3A、3B、3C、3D、3E、3F)，说明可以通过改变荧光探针的浓度来 控制标记后细胞的荧光强度。所述的壳聚糖_量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静 电络合、共价结合、螯合方式自组装形成。所述的标记的细胞为狗肾细胞。其它步骤与实施例1相同。
权利要求
一种壳聚糖 量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，其步骤是A、配制0.0000025 0.001mol/L的羧甲基壳聚糖 CdTe量子点溶液根据羧甲基壳聚糖 CdTe量子点的浓度，用移液管移取0.1~5ml的羧甲基壳聚糖 CdTe量子点溶液于灭菌的10ml容量瓶中，加入高纯水，电阻率大于 18 MΩ·cm，定容，备用；B、将T25细胞培养瓶中已长满的狗肾细胞用0.05%体积比的EDTA 胰蛋白酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取1×104~1×107的狗肾细胞接种到到细胞培养皿中，加入含10%体积比的胎牛血清的DMEM营养液，在37℃、5%体积比的CO2细胞培养箱中培养，使细胞正常贴壁生长繁育，得到用于实施标记的狗肾细胞；C、待步骤(B)狗肾细胞贴壁生长12~36小时后，向培养皿中加入壳聚糖 量子点荧光探针，于37℃、5%体积比的CO2细胞培养箱中与细胞共同孵育6~48小时，得到带有荧光的狗肾细胞，弃去营养液，用pH=7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，用荧光显微镜观察标记情况。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，其特征 在于所述的壳聚糖-量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相通过静电络 合、共价结合、螯合方式自组装形成。
3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，其特征 在于所述的标记的细胞为狗肾细胞。
4.根据权利要求1所述的一种壳聚糖_量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，其特征 在于所述的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点制备过程如下，CdCl2溶液和巯基乙酸溶液混合 均勻后用NaOH溶液调整其pH值为碱性，再向该溶液中加入新制备的KTeH4溶液，将此混 合液转入聚四氟乙烯微波消解罐，放入可控温的微波加热系统进行加热，反应完成后待溶 液冷却至室温，得到CdTe量子点溶液，将其与羧甲基壳聚糖溶液混合反应生成羧甲基壳聚 糖-CdTe量子点。
全文摘要
本发明公开了一种壳聚糖-量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，其步骤是A、配制羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液根据羧甲基壳聚糖-CdTe量子点的浓度，用移液管移取羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液于灭菌的容量瓶中，加入高纯水定容；B、将T25细胞培养瓶中已长满的狗肾细胞用EDTA-胰蛋白酶消化为单细胞悬浮液，细胞计数后取狗肾细胞接种到到细胞培养皿中，加入营养液，培养；C、待狗肾细胞贴壁生长后，向培养皿中加入壳聚糖-量子点荧光探针，与狗肾细胞共同孵育，得到已标记上荧光的狗肾细胞。本发明操作简便，荧光效率高、生物相容性好、稳定时间长，荧光探针无细胞毒性，可用于细胞的长时间的观测。
文档编号G01N21/64GK101980005SQ201010512868
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月20日 优先权日2010年10月20日
发明者何振宇, 周培疆, 朱洪浩 申请人:武汉市疾病预防控制中心;武汉大学