专利名称：人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体是关于人3型腺病毒的可修饰位点及其应用。
背景技术：
人腺病毒(Adenovirus)是1953年从急性呼吸道疾病病人身上分离、鉴定出来的， 是一类主要感染人呼吸道和消化道的病原体。截目前为止，人类已经发现了 6个种属52种 不同血清型的腺病毒，腺病毒流行范围广，传播速度快，近年来在多个国家和地区爆发和流 行，给人们的公共卫生安全带来了极大的威胁。流行病学调查表明，在我国，引起严重呼吸 道感染的腺病毒亚型主要是3型、4型、7型，较为少见的是11型。腺病毒的DNA为双股线状，全长30-381Λ。可以在编码早期蛋白的El、E3区插入 外源基因进行表达，以腺病毒为载体进行基因治疗的重组疫苗的研究已经广泛进行。以人 5型腺病毒为载体的研究进行较为深入。六邻体(Hexon)蛋白是形成腺病毒二十面体颗粒的几种蛋白质中最大也是结 构最丰富的蛋白，其分子量约为12X104Da。不同型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序 列有很高的同源性(78-95% )，其变化主要集中在暴露于病毒衣壳表面的9个高变区 (Hypervariable Regions, HVRs) 0在不影响病毒的复制、感染性及稳定性的前提下，可以 将外源短肽直接替换或插入到六邻体的某些高变区中，使外源短肽“展示”于腺病毒颗粒表 面，产生具有新的抗原特异性的嵌合型病毒粒子。在腺病毒衣壳上，共有240个六邻体颗粒 以每面12个的形式均勻分布于其上，同时，每个六邻体颗粒又由三个六邻体多肽链相互作 用形成同源三聚体，这就意味着嵌合型腺病毒衣壳表面将具有720个外源短肽拷贝；同时， 六邻体蛋白本身分子量大，具有极强的免疫原性，此特性能大大提高嵌合于其中的外源短 肽的免疫原性。另一方面，对不同HVR区同时进行改造，能够形成一个HVRs区修饰的、表达 外源多肽的高效、多价的重组腺病毒“展示”平台。此技术的建立将极大的促进基因工程疫 苗的发展。腺病毒作为疫苗和基因药物载体应用的研究较多，但针对腺病毒本身和将明确 的外源抗原表位展示于腺病毒表面后的重组病毒作为疫苗的研究尚不多见。Janet C.等 的研究结果表明，在LoopI (包含HVR1-6)和LoopII (包含HVR7-9)中替换8个氨基酸是 可 白勺(Janet C.，et al.，Expression of a foreign epitope on thesurface of the adenovirus hexon. J Gen Vriol，1994. 75 :p. 133-139.外源表位在腺病毒六邻体表面的 表达，普通病毒学杂志。)。Hongju W.等利用His6对人5型腺病毒的HVR2，3，5，6和7进 行了替换石if究(Hongju W. , et al. , Identification of sitesin adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. J Virol, 2005. 79(6) :p. 3382-3390.腺病毒六邻体上可 整合外源多肽位点的鉴定，病毒学杂志。)，但此研究的主要目的是腺病毒的HVR区是否可 以被修饰，而不是如何修饰，因而此研究未对HVR中某些氨基酸的可替换与否进行研究，并 且，人5型腺病毒在基因分型中属于C组(HAdV-C)，而人3型腺病毒则属于B组(HAdV-B)， 两者的HVR区序列及长度均差异较大。而且由于人群中普遍存在针对人5型腺病毒的中和抗体等原因，使以其为载体进行表达式重组疫苗和治疗药物等的应用受到很大的限制。
发明内容
本发明的目的是通过对人3型腺病毒六邻体高变区氨基酸位点的研究，提供人3 型腺病毒六邻体高变区中可修饰的氨基酸位点，以及该可修饰氨基酸位点在外源蛋白展 示、免疫原制备、药物制备、检测试剂制备中的应用。本发明的具体方案如下本发明首先提供了人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，该可修饰位点位于六邻体 的高变区，具有SEQ ID NO :1-4所示序列中的至少一个氨基酸位点。这些氨基酸位点是分别位于人3型腺病毒六邻体的高变区1、2、5、7上，具体来说， SEQ ID NO 1所示序列位于高变区1上，SEQ ID NO 2所示序列位于高变区2上，SEQ ID NO :3所示序列位于高变区5上，SEQ ID NO :4所示序列位于高变区7上。SEQ ID NO 1-4 所示序列中的任一个或多个氨基酸位点可以对其进行缺失或替换，而不影响腺病毒包装活 性。本发明还提供了上述人3型腺病毒六邻体的可修饰位点在外源蛋白展示、免疫原 制备、药物制备和检测试剂制备中的应用。优选的，上述应用可以采用如下方式进行六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、 不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体在外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备、检测试 剂制备中的应用，上述六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及 腺病毒载体均含有至少一种经修饰过的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，即上述六邻体 蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体中的六邻体高变 区上如SEQ ID NO :1-4所示序列的中至少一个氨基酸位点被修饰，可以利用这样的六邻体 蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体来进行外源蛋白 展示、制备免疫原、制备药物和制备检测试剂。其次，本发明还提供了一种腺病毒六邻体蛋白，该腺病毒六邻体蛋白含有至少一 种经修饰过的上述人3型腺病毒六邻体的可修饰位点。即，在该腺病毒六邻体蛋白的高变 区中，本发明所公开的SEQ ID NO :1-4所示序列中至少有一个氨基酸缺失，或被替换为其他 片段或插入其他片段。本发明还提供了一种不合遗传物质的腺病毒壳体，所述腺病毒壳体含有上述腺病 毒六邻体蛋白。本发明还提供了一种腺病毒载体，所述腺病毒载体含有上述腺病毒六邻体蛋白。本发明还提供了 一种重组腺病毒，所述重组腺病毒含有上述腺病毒六邻体蛋白。本发明还提供了 一种疫苗株，该疫苗株含有上述腺病毒载体。本发明提供了人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，并提供了利用该位点可以用来 进行外源蛋白展示、制备免疫原、药物、检测试剂等方面。为利用人3型腺病毒六邻体高变 区修饰外源多肽的技术平台作为疫苗或抗原研究开发的病毒展示技术平台奠定了基础。
图1为实施例1中构建的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图 2 为实施例 1 中 L-HVR-R (EcoR I/Sal I)与 PBRADV3 Δ E3EGFP-MH5 (Avrll/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒的电泳图；图3为实施例1中的细胞病变的照片；图4为实施例2中构建的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图；图 5 为实施例 2 中 L-HVR-R(EcoR I/Sal I)与 PBRADV3 Δ E3EGFP-MH5 (Avrll/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒的电泳图；图6为转染重组腺病毒基因组后的照片；图7为实施例3中构建的穿梭质粒PBR322L/R-HVR的电泳图；图 8 为实施例 3 中 L-HVR-R(EcoRI/&il I)与 PBRADV3 Δ E3EGFP-MH5 (Avrll/Pac I)重组后得到的正确克隆质粒的电泳图；图9为实施例3中的细胞病变的照片。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。本发明的“修饰”是指可将其他外源片段与SEQ ID NO :1_4所示序列中的任一个 或多个氨基酸位点进行替换，或在SEQ ID NO :1-4所示序列中的任一个或多个氨基酸位点 处插入其他外源片段，或将SEQ ID NO :1-4所示序列中的任一个或多个氨基酸位点进行缺失。本发明的“位点，，泛指一个或多个氨基酸位点，即除了指代某一个氨基酸位点外， 还可以指代某一段氨基酸序列。本发明中实验用到的PBRADV3AE3EGFP的制备方法详见武汉大学博士学位论文 《人3型腺病毒感染性全基因组克隆及表达载体的构建》，张其威，2007年3月，编号10486。为了寻找人3型腺病毒六邻体高变区中可修饰的氨基酸位点，该发明针对 PBRADV3 AE3EGFP六邻体高变区进行了三次突变实验。实施例1 :PBRADV3 Δ E3EGFP六邻体高变区第一次突变实验将野生型HADV7的六邻体高变区HVR1、HVR2、HVR5、HVR7分别替换到病毒载体 PBRADV3 Δ E3EGFP上六邻体高变区的相应位置(氨基酸序列中下划线所示)，突变氨基酸序 列如表1中下划线部分所示。表 权利要求
1.人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，其特征在于，所述可修饰位点位于六邻体的高 变区，具有SEQ ID NO :1-4所示序列中的至少一个氨基酸位点。
2.根据权利要求1所述的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点，其特征在于，所述高变区 为人3型腺病毒六邻体的高变区1、2、5、7中的至少一种。
3.权利要求1或2所述的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点在外源蛋白展示、免疫原 制备、药物制备和检测试剂制备中的应用。
4.六邻体蛋白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体在 外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备、检测试剂制备中的应用，其特征在于，所述六邻体蛋 白单体、六邻体蛋白三聚体、不含遗传物质的腺病毒壳体及腺病毒载体均含有至少一种经 修饰过的权利要求1或2所述的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点。
5.一种腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，含有至少一种经修饰过的权利要求1或2所述 的人3型腺病毒六邻体的可修饰位点。
6.一种不含遗传物质的腺病毒壳体，其特征在于，所述腺病毒壳体含有如权利要求5 所述的六邻体蛋白。
7.一种腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体含有如权利要求5所述的六邻体蛋白。
8.一种疫苗株，包含权利要求7所述的腺病毒载体。
9.一种重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒含有如权利要求5所述的六邻体蛋白。
全文摘要
本发明提供了人3型腺病毒六邻体高变区中可修饰的氨基酸位点，该可修饰位点位于六邻体的高变区，具有SEQ ID NO1-4所示序列中的至少一个氨基酸位点。这些氨基酸位点是分别位于人3型腺病毒六邻体的高变区1、2、5、7上。本发明还提供了该可修饰氨基酸位点在外源蛋白展示、免疫原制备、药物制备、检测试剂制备中的应用。本发明为利用人3型腺病毒六邻体高变区修饰外源多肽的技术平台作为疫苗或抗原研究开发的病毒展示技术平台奠定了基础。
文档编号G01N33/68GK102060915SQ201010526638
公开日2011年5月18日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者周荣, 李海涛, 李潇, 田新贵, 钟南山, 高文娟 申请人:广州呼吸疾病研究所