专利名称：一种精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及体外检测试剂盒和检测方法，特别是涉及一种定量检测人精液标本中 白细胞浓度的试剂盒，还涉及利用该试剂盒来检测人精液标本中白细胞浓度的方法，主要 用来筛查男性生殖道感染，还涉及利用该试剂盒检测试剂是否有效的方法。
背景技术：
人附属性腺感染、自身免疫性睾丸炎、精索静脉曲张，吸烟、酗酒、接触刺激性有毒 物质、经常热水浴等，均可导致人精液白细胞精子症，影响精液质量，降低受孕率。目前相 关的人精液标本中白细胞浓度的实验室检测方法主要有精液直接镜检法、吉姆萨染色法、 瑞氏染色法、免疫细胞染色法等。精液直接镜检法是直接将精液涂片计数精液内的圆细 胞，不能区分白细胞、上皮细胞、精原细胞；吉姆萨染色法和瑞氏染色法能准确判断白细胞， 操作步骤较多且陈旧性白细胞不易识别；免疫细胞染色法系通过白细胞膜表面共同抗原 (CD45)进行免疫组化染色，检测结果最为准确，但成本较昂贵、操作步骤繁琐。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种性能稳定、操作简单、易于临床推广应用、能 开展质量控制工作的精液白细胞过氧化物酶染色试剂盒，同时，本发明还提供一种利用该 试剂盒进行检测的方法学特异、操作简单、易于临床推广应用的精液白细胞过氧化物酶染 色检测方法，同时，本发明还提供一种利用该试剂盒测试剂是否有效的方法。为解决上述技术问题，本发明提供一种精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒，其特 征在于，包括A液、B液和HRP质控液；所述的A液是以弱酸性缓冲液与氯化铵、乙二胺四乙 酸二钠、正甲苯胺配制成的PH4 7的溶液，浓度为每升A液中含有氯化铵2 100克、乙 二胺四乙酸二钠0. 5 50克、正甲苯胺0. 05 50ml ；所述B液是在水或弱酸性缓冲液中 加入过氧化氢配制成的PH4 7的溶液，浓度为每升B液中含有过氧化氢10 500ml ；所 述HRP质控液是在弱酸性缓冲液中加入过氧化物酶的溶液，浓度为每升HRP质控液中含有 过氧化物酶0. 001 1克。每升所述A液中含有氯化铵22. 727克、乙二胺四乙酸二钠4. 545克、正甲苯胺 0. 205ml ；每升所述B液中含有过氧化氢30ml。每升所述HRP质控液也中含有过氧化物酶0. 1克。所述弱酸性缓冲液为pH4 7、0· 01 lmol/L的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液或 醋酸缓冲液或磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液或至少其中两种的混合物。所述A液、B液和HRP质控液中分别加入适量的防腐剂；所述A液为分装于密封容 器的多瓶。同时本发明还提供，利用权利要求1所述精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒检测 精液标本的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一.取A液，并向A液内加入B液，混勻，A液与B液的体积比为1 0. 005 1 0. 1 ；步骤二 .再加入完全液化的新鲜的待检精液标本，振荡混勻，精液标本在反应体 系内所占体积为2% 20% ；步骤三.在10°C 40°C温度下放置10分钟 120分钟进行反应；步骤四.振荡混勻后将反应液充入计数池，置于显微镜高倍视野下观察结果并计 数，显微镜下观察到的棕色细胞即为过氧化物酶阳性的白细胞。所述步骤一中A液与B液的体积比为1 0. 028 ；所述步骤二中精液标本在反应 体系内所占体积为10. 8% ；所述步骤三中在室温下放置20 30分钟进行反应。所述步骤二之前还包括如下步骤等待新鲜精液在体外自然液化；或者精液在体 外60分钟后仍然不能完全液化时，加入培养液或洗涤液并以吸管反复吹打促进完全液化； 液化后的精液标本直接用于步骤二。所述步骤四之后还有步骤五，将计数结果乘以精液标本稀释倍数，计算计数池内 棕色细胞的浓度。同时本发明还提供，利用所述精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒检测试剂是否有 效的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一.取A液，并向A液内加入B液，混勻，A液与B液的体积比为1 0. 005 1 0. 1 ；步骤二 .再加入HRP质控液，振荡混勻，HRP质控液在反应体系内所占体积为 2% 20% ；步骤三.在10°C 40°C温度下放置10分钟 120分钟进行反应；步骤四.将反应液在分光光度计上比色，用纯化水调零，波长520nm，比色光径为 Icm ；OD520nmacm ^ 1.0表明试剂有效，OD520nmacm <1.0表明试剂无效。本发明过氧化物酶染色法的检验原理是多形核粒细胞特有的过氧化物酶分解 过氧化氢，产生新生态氧，后者氧化正甲苯胺生成正甲苯胺蓝、形成棕色物使细胞着色，过 氧化物酶阳性细胞染棕色，而过氧化物酶阴性细胞不着色，在显微镜下计数精液标本内染 棕色细胞的数量，可计算精液标本内白细胞浓度，精液中白细胞数量> lX106/ml，即为 白细胞精子症，提示男性主殖道附属性腺感染，并可能因此影响精液质量。但白细胞数量 < 1X IOfVml也不能排除附性腺感染的可能性，需要用其它方法进一步确认。确认的方法包 括精液标本微生物培养，或采用灵敏度和特异性较好的检测指标(如精浆弹性蛋白酶)。本发明的精液白细胞过氧化物酶染色试剂盒中有A液、B液、HRP质控液。A液中 的氯化铵的水溶液呈弱酸性，能够为过氧化物酶催化反应提供离子环境与弱酸性环境，在 溶液中浓度为2g/L 100g/L，在反应体系内浓度为1. 756g/L 87. 805g/L ；乙二胺四乙 酸二钠具有广泛的配位性能，几乎能与所有的金属离子形成稳定的螯合物，能消除反应体 系内干扰氧化反应的金属离子影响，在溶液中浓度为0. 5g/L 50g/L，在反应体系内浓度 为0. 439g/L 43. 9g/L;正甲苯胺被过氧化物酶氧化后形成正甲苯胺蓝，呈棕色，指示细胞 内过氧化物酶的存在，在溶液中浓度为0. 05ml/L 50ml/L，在反应体系内浓度为0. 044ml/ L 43. 9ml/L。B液是含过氧化氢的水溶液或弱酸性缓冲液；过氧化氢可作为过氧化物酶 的底物，被催化形成新生态氧，进而氧化正甲苯胺形成正甲苯胺蓝，在溶液中浓度为IOml/ L 500ml/L，在反应体系内浓度为0. 244ml/L 12. 195ml/L。
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采用该试剂盒可以非常简单方便地检测精液标本中过氧化物酶阳性的白细胞数 量和浓度，本发明的过氧化物酶染色法在不影响检测效能的前提下，简化了操作步骤，特异性高。由于本发明的试剂盒还含有辣根过氧化物酶(HRP)质控液，它是含过氧化物酶的 弱酸性缓冲液，在溶液中浓度为0. 001g/L lg/L，在反应体系内浓度为0. 000097g/L 0. 097g/L, HRP质控液可替代精液标本，用于检测A液和B液的反应效能，监测试剂是否失 效，便于临床常规开展与质量控制。
具体实施例方式实施例1一、制备本实施例1的精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒1.配制pH4 7、0. 01mol/L磷酸盐缓冲液称取12水磷酸氢二钠1. 7728克，磷酸二氢钾0. 694克，加入适量纯化水搅拌溶解 后，在PH计监测下，用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整pH值至4 7。2.配制 A 液(1)称取氯化铵22. 727克、乙二胺四乙酸二钠4. 545克，加入适量pH4 7、 0. 01mol/L磷酸盐缓冲液，搅拌溶解；(2)量取正甲苯胺0. 205ml，加入上述步骤(1)的溶液内，搅拌溶解，用pH4 7、 0. 01mol/L磷酸盐缓冲液定容至1L，搅拌混勻；(3)分装为0. 9ml/瓶至玻璃或塑料制密封容器内，密封避光保存，临用前置于室 温。临床使用时仅需取出一瓶A液，滴入B液和加入待检标本即可，方便了操作。3.配制 B 液量取30ml过氧化氢，用纯化水定容至1L，搅拌混勻。4.配制HRP质控液称取过氧化物酶0. 1克，加入适量pH4 7、0. 01mol/L磷酸盐缓冲液，搅拌溶解 后，用pH4 7、0. 01mol/L磷酸盐缓冲液定容至1L，搅拌混勻。二、利用本实施例1的试剂盒检测精液标本，步骤如下1.受试者禁欲2-7天后，通过手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液标本；2.等待新鲜精液在体外自然液化，精液必须新鲜，不可低温保存，以免冻融后造成 白细胞内过氧化物酶裂解释放至胞外，造成棕染白细胞数量减少或碎片增多；3.取A液1瓶(0. 9ml)，并向A液内加入B液1滴(约0. 025ml)，混勻，A液与B 液的体积比为1 0.028;4.再加入完全液化后的新鲜的待检精液标本0. 1ml，振荡1 2分钟混勻，精液标 本在反应体系内所占体积为10.8% ；5.室温下放置30分钟进行反应；6.振荡混勻后将反应液充入现有技术中常用的IOOum深度一次性计数池，置于显 微镜物镜40倍视野下观察，所用显微镜目镜的孔径为20mm，显微镜下观察到的棕色细胞即 为过氧化物酶阳性的白细胞，棕色细胞个数是平均8个/HP (高倍视野)。结果观察时，即使 在细胞内仅见少量棕色颗粒，也应将此细胞计数为过氧化物酶阳性细胞；
7.计算结果，精液标本白细胞的浓度=每高倍视野棕色细胞个数X换算系数X 标本稀释倍数=8X50000X 10. 25 = 4. 1 X 106/ml ； (0. Iml 精液加入 0. 9mlA 液、0. 025ml B 液内，稀释了 10. 25倍。)结论是该精液标本表明被测者有白细胞精子症。三、利用本实施例1的试剂盒检测试剂是否有效，步骤如下1.取A液1瓶(0. 9ml)，并向A液内加入B液1滴(约0. 025ml)，混勻，A液与B 液的体积比为1 0.028;2.再加入HRP质控液0. 1ml，振荡1 2分钟混勻；3.室温下放置30分钟进行反应；4.将反应液在分光光度计上比色，用纯化水调零，波长520nm，比色光径为Icm ； OD520nmacffl 为 1. 461，OD520nmacffl 彡 1. 0 表明试剂有效。实施例2一、制备本实施例2的精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒1.配制pH4 7、0. 5mol/L的柠檬酸缓冲液(1)称取1水柠檬酸105. 07克，加入适量纯化水搅拌溶解；(2)用浓氢氧化钠溶液调整溶液pH值至4 7 ；(3)用纯化水定容至1L，搅拌混勻。2.配制 A 液(1)称取氯化铵2克、乙二胺四乙酸二钠0. 5克，加入适量pH4 7、0. 5mol/L柠檬 酸缓冲液，搅拌溶解；(2)量取正甲苯胺0.05ml，加入上述步骤(1)的溶液内，搅拌溶解，用pH4 7、 0. 5mol/L柠檬酸缓冲液定容至1L，搅拌混勻；(3)分装为0. 9ml/瓶至玻璃或塑料制密封容器内，密封避光保存，临用前置于室
ilm ο3.配制 B 液量取IOml过氧化氢，用上述pH4 7、0. 05mol/L柠檬酸缓冲液定容至1L，搅拌混勻。4.配制HRP质控液称取过氧化物酶0. 5克，加入适量pH4 7、0. 05mol/L柠檬酸缓冲液，搅拌溶解 后，用pH4 7、0. 05mol/L柠檬酸缓冲液定容至1L，搅拌混勻。二、利用本实施例2的试剂盒检测精液标本，步骤如下1.受试者禁欲2-7天后，通过手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液标本；2.新鲜精液在体外60分钟后仍然未完全液化，这时加入与精液体积相同的培养 液或洗涤液并以吸管反复吹打促进完全液化(最终的计算结果需乘以稀释倍数2)；3.取A液1瓶(0. 9ml)，并向A液内加入B液2滴(约0. 05ml)，混勻，A液与B液 的体积比为1 0.056;4.再加入完全液化后的新鲜的待检精液标本0. 05ml，振荡1 2分钟混勻，精液 标本在反应体系内所占体积为5. 26% ；5. 10°C放置120分钟进行反应；
6.振荡混勻后将反应液充入现有技术中常用的IOOum深度一次性计数池，置于显 微镜物镜40倍视野下观察，所用显微镜目镜的孔径为20mm，显微镜下观察到的棕色细胞即 为过氧化物酶阳性的白细胞，棕色细胞个数是平均3个/HP。结果观察时，即使在细胞内仅 见少量棕色颗粒，也应将此细胞计数为过氧化物酶阳性细胞；7.计算结果，精液标本白细胞的浓度=每高倍视野棕色细胞个数X换算系数X 标本稀释倍数=3X50000X20X2 = 6X 106/ml ；结论是该精液标本表明被测者有白细胞精子症。三、利用本实施例2的试剂盒检测试剂是否有效，步骤如下1.取A液1瓶(0. 9ml)，并向A液内加入B液2滴(约0. 05ml)，混勻，A液与B液 的体积比为1 0.056;2.再加入HRP质控液0. 05ml，振荡1 2分钟混勻；3. 10°C放置120分钟进行反应；4.将反应液在分光光度计上比色，用纯化水调零，波长520nm，比色光径为Icm ；
彡1.0表明试剂有效。实施例3一、制备本实施例1的精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒1.配制pH4 7、lmol/L的醋酸缓冲液(1)量取冰醋酸57. 2ml，加入适量纯化水搅拌溶解；(2)用浓氢氧化钠溶液调整溶液pH值至4 7 ；(3)用纯化水定容至1L，搅拌混勻。2.配制 A 液(1)称取氯化铵100克、乙二胺四乙酸二钠50克，加入适量pH4 7、lmol/L醋酸 缓冲液，搅拌溶解；(2)量取正甲苯胺50ml，加入上述步骤⑴的溶液内，搅拌溶解，用pH4 7、lmol/ L醋酸缓冲液定容至1L，搅拌混勻；(3)加入0. 5克的硫柳汞防腐剂，以抑制微生物生长，延长试剂的使用期限；(4)分装为0. 9ml/瓶至玻璃或塑料制密封容器内，密封避光保存，临用前置于室3.配制 B 液:量取500ml过氧化氢，用纯化水定容至1L，搅拌混勻，加入0. 5克量的苯甲酸防腐 剂。4.配制HRP质控液称取过氧化物酶1克，加入适量醋酸缓冲液，搅拌溶解后，用醋酸缓冲液定容至 1L，并加入Iml的ProClin系列防腐剂，搅拌混勻。二、利用本实施例1的试剂盒检测精液标本，步骤如下1.受试者禁欲2-7天后，通过手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液标本；2.等待新鲜精液在体外自然液化；3.取A液1瓶(0. 9ml)，并向A液内加入B液0. 09ml，混勻，A液与B液的体积比 为 1 0.1 ；
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4.再加入完全液化后的新鲜的待检精液标本0. 2ml，振荡1 2分钟混勻，精液标 本在反应体系内所占体积为20. 2% ；5. 37°C放置10分钟进行反应；6.振荡混勻后将反应液充入现有技术中常用的IOOum深度一次性计数池，置于显 微镜物镜40倍视野下观察，所用显微镜目镜的孔径为20mm，显微镜下观察到的棕色细胞即 为过氧化物酶阳性的白细胞，棕色细胞个数是平均2个/HP。结果观察时，即使在细胞内仅 见少量棕色颗粒，也应将此细胞计数为过氧化物酶阳性细胞；7.计算结果精液标本内细胞的浓度=每高倍视野棕色细胞个数X换算系数X 标本稀释倍数=2X50000X5. 95 = 0. 595 X IO6 ；结论是该精液标本表明被测者无白细胞精子症。三、利用本实施例1的试剂盒检测试剂是否有效，步骤如下1.取A液1瓶(0. 9ml)，并向A液内加入B液0. 09ml，混勻，A液与B液的体积比 为 1 0. 1 ；2.再加入HRP质控液0. 2ml，振荡1 2分钟混勻；3. 37°C放置10分钟进行反应；4.将反应液在分光光度计上比色，用纯化水调零，波长520nm，比色光径为Icm ；
OD520nmacffl 为 1. 438，OD520nmacffl 彡 1. 0 表明试剂有效。
权利要求
一种精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，包括A液、B液和HRP质控液；所述的A液是以弱酸性缓冲液与氯化铵、乙二胺四乙酸二钠、正甲苯胺配制成的pH4～7的溶液，浓度为每升A液中含有氯化铵2～100克、乙二胺四乙酸二钠0.5～50克、正甲苯胺0.05～50ml；所述B液是在水或弱酸性缓冲液中加入过氧化氢配制成的pH4～7的溶液，浓度为每升B液中含有过氧化氢10～500ml；所述HRP质控液是在弱酸性缓冲液中加入过氧化物酶的溶液，浓度为每升HRP质控液中含有过氧化物酶0.001～1克。
2.根据权利要求1所述的精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，每升所述A 液中含有氯化铵22. 727克、乙二胺四乙酸二钠4. 545克、正甲苯胺0. 205ml ；每升所述B液 中含有过氧化氢30ml。
3.根据权利要求1或2所述的精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，每升所 述HRP质控液也中含有过氧化物酶0. 1克。
4.根据权利要求1或2所述的精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，所述弱 酸性缓冲液为PH4 7、0. 01 lmol/L的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液或磷 酸氢二钠_柠檬酸缓冲液或至少其中两种的混合物。
5.根据权利要求1或2所述的精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒，其特征在于，所述A 液、B液和HRP质控液中分别加入适量的防腐剂；所述A液为分装于密封容器的多瓶。
6.利用权利要求1所述精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒检测精液标本的方法，其特 征在于，包括如下步骤步骤一.取A液，并向A液内加入B液，混勻，A液与B液的体积比为1 0.005 1 0. 1 ；步骤二 .再加入完全液化的新鲜的待检精液标本，振荡混勻，精液标本在反应体系内 所占体积为2% 20% ；步骤三.在10°C 40°C温度下放置10分钟 120分钟进行反应；步骤四.振荡混勻后将反应液充入计数池，置于显微镜高倍视野下观察结果并计数， 显微镜下观察到的棕色细胞即为过氧化物酶阳性的白细胞。
7.根据权利要求6所述的检测精液标本的方法，其特征在于，所述步骤一中A液与B液 的体积比为1 0.028;所述步骤二中精液标本在反应体系内所占体积为10. 8%;所述步骤 三中在室温下放置20 30分钟进行反应。
8.根据权利要求6所述的检测精液标本的方法，其特征在于，所述步骤二之前还包括 如下步骤等待新鲜精液在体外自然液化；或者精液在体外60分钟后仍然不能完全液化 时，加入培养液或洗涤液并以吸管反复吹打促进完全液化；液化后的精液标本直接用于步 马聚.~- ο
9.根据权利要求8所述的检测精液标本的方法，其特征在于，所述步骤四之后还有步 骤五，将计数结果乘以精液标本稀释倍数，计算计数池内棕色细胞的浓度。
10.利用权利要求1所述精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒检测试剂是否有效的方 法，其特征在于，包括如下步骤步骤一.取A液，并向A液内加入B液，混勻，A液与B液的体积比为1 0.005 1 0. 1 ；步骤二 .再加入HRP质控液，振荡混勻，HRP质控液在反应体系内所占体积为2% 20% ；步骤三.在10°C 40°C温度下放置10分钟 120分钟进行反应；步骤四.将反应液在分光光度计上比色，用纯化水调零，波长520nm，比色光径为Icm ；OD520nmacffl彡1. 0表明试剂有效，OD520nmacffl < 1. 0表明试剂无效。
全文摘要
一种精液白细胞过氧化物酶检测试剂盒，包括A液、B液和HRP质控液；A液是以弱酸性缓冲液与氯化铵、乙二胺四乙酸二钠、正甲苯胺配制成的pH4～7的溶液；B液是在水或弱酸性缓冲液中加入过氧化氢配制成的pH4～7的溶液；HRP质控液是在弱酸性缓冲液中加入过氧化物酶的溶液。检测时取A液，加入B液，混匀；再加入完全液化的新鲜待检精液标本或HRP质控液，振荡混匀，在10℃～40℃温度下放置10分钟～120分钟进行反应；然后对精液反应液于显微镜高倍视野下观察结果并计数和计算白细胞浓度，或将HRP质控液反应液在分光光度计上比色。本发明的精液白细胞过氧化物酶染色检测试剂盒及其检测方法性能稳定、操作简单、易于临床推广应用、能开展质量控制工作。
文档编号G01N21/31GK101974611SQ20101052897
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者庄学敏, 李巍, 杨红芳, 王希上, 王铮铮, 程锦军, 邓少君, 钟彩颜 申请人:深圳市博锐德生物科技有限公司