专利名称：禽流感病毒h9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法，属于兽 用生物制品领域。
背景技术：
英国药典(BP)的化学对照物质是从1963年才开始提出，由于WHO在英国建立了 国际生物标准物质中心，所以英国一直沿用国际标准物质，而其本国标准物质建立较晚，至 1970年后，欧洲药典问世，英国除引用国际标准物质外，也用欧洲药典标准物质，少量使用 本国的标准物质。即使如此，BP1968年版及其增补本再加英国药典(1968年)收载的数量 已超过260个，1980年版已超过300个，BP1993版收载了 371个。美国药典委员会可提供 约1805多种药品标准物质；欧洲药典委员会有2098种，其中生物制品标准物质有319种。目前，我国已研制出国家一级标准物质1262种，二级标准物质1739种，涉及钢铁、 地质、石油、核材料、环境、食品以及临床检验等领域。兽用生物制品的标准物质研究较滞 后，目前只有192种，而兽用生物制品检验用标准物质几乎为零。兽用生物制品标准物质是控制和确定兽用生物制品产品质量、校准验证检验仪器 和方法是否准确的物质标准，是正确诊断传染病、准确监测免疫情况的物质基础。禽流感(Al)是我国重点防控的重大动物疫病，禽流感病毒(AIV)H9亚型流行很广 泛。目前禽流感诊断、免疫监测及其疫苗免疫效果评价中应用最广泛的方法是HI试验，这 是2006年我国农业部批准通过的方法，但是目前我国尚无禽流感病毒H9亚型血凝抑制试 验用标准物质及其相关研究的报道，国外国际动物卫生组织(OIE)等参考实验室也没有， 严重影响了前后不同时期检测数据的一致性和不同实验室数据的可比性。近年各级实验室 对禽流感标准物质的需求越来越多，特别是H9亚型和H5亚型相关的诊断试剂标准物质，因 此研制禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质尤为迫切，该标准物质是禽流感H9亚型 准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水 平。目前我国标准物质的研制主要参考和遵循1987年7月10日国家计量局发布实施 的《标准物质管理办法》以及一级标准物质技术规范(JJG 1006-94)，但是这个技术规范是 适用于化学成分、物理化学特性及工程技术特性一级标准物质的研制，对于生物制品标准 物质，特别是兽用生物制品标准物质研制目前尚无技术规范可循。因此兽用生物制品标准 物质研制是一项无基础的研究，填补了该项研究领域的空白。
发明内容
本发明为制备一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质，该抗原标准物质 含有灭活的禽流感病毒H9亚型CKSHOl株病毒；血凝抑制试验抗原对鸡红细胞凝集价应 ^ 71og2 ；该抗原只能被禽流感病毒H9亚型阳性血清所抑制，而对禽流感病毒H5亚型、H7 亚型阳性血清，鸡新城疫阳性血清和减蛋综合征病毒阳性血清均呈阴性反应。
本发明的主要制备方法为(1)制备禽流感病毒H9亚型血凝抑制 试验抗原标准物质候选物，包括H9亚型禽 流感病毒毒种的制备与检验；病毒液的制备与检验；病毒液灭活、浓缩、半成品检验；冻干、 成品检验、均一性检验及稳定性检验；(2)标准物质的标定、定值。本发明技术方案的详细阐述包括禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质、其制备方法和程序、其制备 规程和协作标定操作规范等内容。本发明人在国家现行的禽流感病毒H9亚型(株)血凝抑制方法基础上，制定了禽 流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质的质量标准和制备规程，研制出了禽流感病毒H9 亚型血凝抑制抗原标准物质，并与中国兽药监察所、中国农业大学等8家单位对其效价进 行了协作标定。一、禽流感病毒H9亚型(株)血凝抑制抗原标准物质的制备1病毒毒种(1)病毒毒种的来源本发明用于制造禽流感病毒H9亚型(株)血凝抑制抗原标准物质的病毒毒株为 A型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)株(简称CKSHOl株)，由中国国家禽流 感参考实验室(中国哈尔滨市中国农业科学院哈尔滨兽医研究所内)鉴定、保管和供应。(2)病毒毒种的特性1)红细胞凝集价按附录1进行鸡红细胞凝集价测定，毒种对鸡红细胞凝集价 应彡81og2。2)病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10_83个稀释 度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0. lml。置37°C继续孵育，24h前死亡的鸡 胚弃去不计，24 72h内死亡的鸡胚随时取出并于2 8°C冷藏保存。至72h，测定所有鸡胚 液的红细胞凝集价，凝集价>41og2者判为感染，计算EID5tl(中国兽药典委员会.中华人民 共和国兽药典二〇〇五年版三部.中国农业出版社，2006，本发明以下称《中国兽药典》)， 每ml病毒含量应彡IO7-5EID5003)特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释至103EID5Q/0. Iml与等量禽流感病毒H9亚 型特异阳性血清混合，置室温中和Ih后，接种10日龄SPF鸡胚10个，观察120h。在接种后 24 120h内不应引起特异死亡，至少有8/10接种鸡胚健活，鸡胚液作红细胞凝集试验，应 为阴性。4)对鸡的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，滴鼻接种4 5周龄SPF鸡 10只，每只0. Iml0另取条件相同的SPF鸡5只，不接种作为对照，在同条件下分别饲养，观 察14日，感染鸡和对照鸡均不应出现任何异常反应。5)纯净性按《中国兽药典》规定的方法应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。6)基础种子代数5代以内。7)毒种保存在-70°C以下，保存期为60个月。2实验动物所使用的SPF鸡及SPF鸡胚均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。3禽流感病毒H9亚型(株)血凝抑制抗原标准物质候选物的制备
(1)抗原的制备按照常规方法(《中国兽药典》)，将毒种接种SPF鸡胚，收获鸡胚液制备禽流感 病毒H9亚型(株)血凝抑制抗原半成品，经灭活、浓缩，进行无菌检验、效价测定后，按每 瓶Iml分装冻干。保护剂采用本课题研制的配方和配制方法(用注射用水配制蔗糖浓度为 100%的冻干保护剂，过滤除菌后，保护剂与鸡胚液按1 9比例配制)，批号为200901。(2)抗原检验1)物理性状白色或灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。2)无菌检验抽样检验，应无细菌或霉菌生长。3)效价测定按冻干时不同部位随机抽取3个样品进行HA测定，每个样品重复测 2次，凝集价应均不低于71og2。4)特异性检验采用血凝抑制试验的方法(详见附录1)，用该抗原分别对禽流感 病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征病毒阳性血清进 行血凝抑制试验，该抗原只能被禽流感病毒H9亚型阳性血清所抑制，而对其它阳性血清均 呈阴性反应。5)剩余水分测定按《中国兽药典》剩余水分测定法进行，应低于3%。6)真空度测定按《中国兽药典》进行，用高频电子火花仪进行检测，应符合规定。4标准物质的定值(1)定值方法红细胞凝集试验96孔微量板法进行测定。(2)定值单位由6 8家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验 室，采用同一方法进行协作标定。(3)定值要求1)应对每个被测标准样品分别做六到八次独立的测定，分两个单元，每个单元做 三次独立测定；两个单元之间相隔不少于3天。所获得的6个数据应按统计学方法检验异 常值，如发现有异常值，应予标明，并补做一次测定。然后报出全部结果。2)所有用于定值测量的计量器具/测量仪器需经检定或校准合格，并在有效期 内。(4)数据处理1)汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。2)在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的平 均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据。剔除可疑值。计算出总平均值和标准偏差。3)当全部数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量数 据。剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。5均一性检验(1)抽样数量冻干数量在500支以上时取样25支；冻干数量在500只以下时取样 15支。(2)测量分别称量每支内容物的净重量，用统计学方法分析其均一性。6稳定性检验抗原在_20°C、4°C、37°C条件下保存，并定期进行HA价测定，每一时 间均要进行2次重复测量，用统计学方法从统计上剔除可疑值，再计算每次的平均值，该值与定值的偏差应不大于标准偏差。 二、禽流感H9亚型血凝抑制抗原标准物质的使用抗原系用A型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01 (H9N2)株接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚液，用甲醛溶液灭活，经浓缩后，加适宜稳定剂冻干制成。主要用于(一)HA试验中，校定H9亚型抗原HA效价1标准抗原的稀释取禽流感H9亚型抗原冻干安瓿1支，启封后加Iml生理盐水恢 复原量；先进行10倍、20倍、80倍稀释，然后依次进行1/320、1/400、1/480、1/560、1/640、 1/720、1/800 倍稀释。2工作抗原的稀释取禽流感H9亚型工作抗原1支，启封后加生理盐水恢复原量； 先进行10倍、20倍、80倍稀释，然后依次进行320、400、480、560、640、720、800…依次递增 80倍进行稀释。3红细胞凝集试验(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25 μ L加入到孔中，加入生理盐水 25 μ L，再加入1 %鸡红细胞悬液25 μ Lo(2)对照50 μ L生理盐水+25 μ L 1 %鸡红细胞悬液。(3)在微量振荡器振荡Imin 2min。(4)室温(24 26°C )放置30min，判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10秒左 右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞对 照孔一样者为完全不凝集孔(_)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠状 流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50%凝集孔 (++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反应孔底部无 红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。(5)结论当标准抗原完全凝集孔对应的最高稀释度为460士80倍，且对照孔呈 (“)时，工作抗原完全凝集孔对应的最高稀释度即为该抗原的红细胞凝集价。(二)HI试验中，校定禽流感病毒H9亚型抗体的HI效价1抗原的稀释取禽流感H9亚型抗原冻干安瓿1支，启封后加Iml生理盐水恢复 原量；先做10倍、20倍、80倍稀释。然后依次进行320、400、480、560、640倍稀释。2红细胞凝集试验(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25 μ L加入到孔中，加入生理盐水 25 μ L，再加入1 %鸡红细胞悬液25 μ Lo(2)对照50 μ L生理盐水+25 μ L 1 %鸡红细胞悬液。(3)在微量振荡器振荡1 2min。(4)室温(24 26°C )放置30分钟，判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10秒 左右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞 对照孔一样者为完全不凝集孔(_)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠 状流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50%凝集 孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反应孔底部 无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。(5)结论完全凝集孔对应的最高稀释度应为460士80倍。
3微量血凝抑制试验(1)4HAU抗原的配制与验证1)抗原稀释方法将含有400个血凝单位的抗原先进行10倍稀释，再进行100倍稀释，即100倍稀 释液为4HAU血凝素。将配制的4HAU血凝素用生理盐水进行1 2、1 3、1 4、1 5、 1 6禾口 1 7稀释。2)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25 μ L加入到孔中，加入生理盐水 25 μ L，再加入1 %鸡红细胞悬液25 μ Lo3)对照50 μ L生理盐水+25 μ L 1 %鸡红细胞悬液。4)以上试验做2个平行重复。5)在微量振荡器振荡1 2min。6)室温(24 26°C )放置30min，判定结果。7)判定标准如果配制的抗原液为4HAU，贝Ij 1 4稀释度将给出100%凝集点，即 反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集；如果4HAU高于4个单位，可能1 5或1 6 为100%凝集点；如果较低，则可能1 2或1 3为100%凝集点。应根据测定结果适当 调整，使抗原工作液确为4HAU。(2)血清的稀释1)标准阳性血清的的稀释血清恢复原量后，依次进行10倍、20倍和120倍稀 释；然后进行720、840、960、1080和1200倍稀释。将稀释好的阳性血清每一稀释倍数取 0. 025ml，分别加入到V型微量反应板对应孔中。2)阴性血清的稀释在V型微量反应板中，每孔加0. 025ml生理盐水；第1孔加 入恢复原量后的阴性血清0. 025ml,反复抽打3 5次混勻；从第1孔吸取0. 025ml血清 加入第2孔，混勻后吸取0. 025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第6孔，从第6孔吸取 0. 025ml 弃去。3)被检血清的稀释在V型微量反应板中，每孔加0. 025ml生理盐水；第1孔加 0. 025ml被检血清，反复抽打3 5次混勻；从第1孔吸取0. 025ml血清加入第2孔，混勻 后吸取0. 025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0. 025ml弃去。3. 3V型微量反应板上所有血清孔加入4HAU的抗原液25 μ L。最后1排设50 μ L 生理盐水和25 μ L生理盐水+25 μ L 4HAU抗原(各4个孔)做对照。(4)充分振荡后，室温(24 26°C )下静置30分钟。每孔再加入1 %鸡红细胞悬 液25 μ L，充分振荡。(5)室温(24 26°C )放置30分钟后判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10秒 左右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞 对照孔一样者为完全不凝集孔(_)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠 状流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50%凝集 孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反应孔底部 无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。(6)结论阳性血清840倍稀释孔为(-)，960、1080和1200倍稀释孔为(+)、(++)、(+++)或(#) ；50 μ L生理盐水对照孔为㈠，25 μ L生理盐水+25 μ L 4HAU抗原孔为(#)，此时试验方可判为成立。被检血清的完全不凝集孔对应的最高稀释度即为该血清的红细胞凝集抑制价。本发明的优点本发明涉及禽流感病毒Η9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法。本标准物质 是由禽流感病毒Η9亚型CKSHOl株病毒经过病毒液的制备与检验；病毒液灭活、浓缩、半成 品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工 艺过程而制成。该标准物质是禽流感Η9亚型准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行 正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。实施例1抗原制造及半成品检验1生产用毒种制备(1)毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-4稀释度，尿囊腔内 接种11日龄SPF鸡胚，每胚0. lml，密封针孔，置37°C继续孵育，不必翻蛋。接种24h后，每 8h照蛋1次，至72h，死亡的鸡胚随时取出，气室部向上直立，在2 8°C中冷却，接种后24h 前死亡者弃去不用。将冷却8 24h的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剔 除气室部的卵壳，揭去卵黄壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸出鸡胚液(尿 囊液和羊水)。尿囊液收集于一灭菌容器内。制备的病毒毒种经检验应符合该病毒毒种的 标准(见附录2《禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原毒种标准》)。(2)病毒液的制备1)接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10_4稀释，尿囊腔内接种11日龄SPF鸡 胚，每胚0. 1ml，密封针孔，置37°C继续孵育，不必翻蛋。2)孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋2次，将24h前死亡的鸡胚弃去，24h后死亡 的鸡胚随时取出，至72h，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2 8°C冷却8h以 上。3)收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部位 卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，用灭菌小镊子亚压住鸡胚，用IOml无菌 注射器吸取胚液。在吸取胚液前应对每个鸡胚仔细检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污 染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭 菌中性瓶中，每更换一中性瓶时同时更换注射器，每吸取完一枚胚应将聂子在火焰上烧一 下再用来接触下一枚胚。收获的鸡胚液放在2 8°C条件下保存。(3)病毒液的检验1)无菌检验每瓶鸡胚液分别取样，按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应无细 菌或霉菌或支原体生长也无外源病毒。2)HA价测定每瓶鸡胚液分别取样，样品对鸡红细胞凝集价均≥ 71og2。3)灭活将上述检验合格的胚液以灭菌多层纱布滤过，混合于一个大容器内，按最 终浓度为0. 的量加入甲醛溶液；加甲醛溶液后最好倾倒于另一瓶中，以避免瓶颈附近 粘附的病毒未能接触灭活剂。然后置于37°c灭活24h(以瓶内温度达到37°C开始计时，期 间振摇1次)。灭活后将胚液置于2 8°C条件下保存。
4)灭活检验取10 11日龄SPF鸡胚5个，各尿囊腔内接种灭活胚液0. Iml, 37°C 孵育72h，收获鸡胚液，测定血凝性为阴性，并盲传1代，测定血凝性，也无血凝现象，判为灭
活完全。 5)浓缩与保存将灭活彻底的鸡胚液分装到灭菌的透析袋中，袋外铺加聚乙二醇， 在室温下透析浓缩5倍左右。浓缩后的鸡胚液分别收集于灭菌容器内，置于4 8°C条件下存放，不得超过3个月。6)半成品检验透析后鸡胚液分别取样，进行无菌检验，无细菌或霉菌生长。透析 后鸡胚液分别取样，样品对鸡红细胞凝集价> 91og2。7)抗原配制、分装及冻干保护剂的配制用注射用水配制蔗糖浓度为100%的冻干保护剂，过滤除菌后备用。抗原制备将检验合格的鸡胚液，混入同一容器内，保护剂与鸡胚液按1 9比例 配制。分装与冻干将配好的抗原液用安瓶进行分装，每瓶lrnl，精确度在士5%以内，分 装后迅速进行冷冻真空干燥。密封后放置-20°C保存。实施例2成品检验1物理性状白色或灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。2无菌检验抽样检验，应无细菌或霉菌生长。检验结果见表1，所有冻干制品全部 呈阴性。表1无菌检验统计表
权利要求
1.种禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质，其特征在于该抗原标准物质 含有灭活的禽流感病毒H9亚型CKSHOl株病毒；血凝抑制试验抗原对鸡红细胞凝集价均 ^ 71og2 ；该抗原只能被禽流感病毒H9亚型阳性血清所抑制，而对禽流感病毒H5亚型、H7 亚型阳性血清，鸡新城疫阳性血清和减蛋综合征病毒阳性血清均呈阴性反应。
2.一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质的制备方法，其特征在于是通 过利用由我国分离的禽流感病毒H9亚型CKSHOl株病毒经过以下步骤(1)制备禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质候选物H9亚型禽流感病毒毒种的制备与检验；病毒液的制备与检验；病毒液灭活、浓缩、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验；(2)标准物质的标定、定值。
3.如权利要求2所述的一种禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原标准物质的制备方 法，其特征在于制备过程中使用的冻干保护剂为用注射用水配制蔗糖浓度为100%的冻 干保护剂，过滤除菌后，保护剂与鸡胚液按1 9比例配制。
全文摘要
本发明涉及禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准物质及制备方法。本标准物质是由禽流感病毒H9亚型CKSH01株病毒经过病毒液的制备与检验；病毒液灭活、浓缩、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是禽流感H9亚型准确诊断、免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。
文档编号G01N33/531GK102004151SQ20101053237
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者刘景利, 孙建宏, 张从禄, 杨帆, 王在时, 田国彬, 胡井雷, 韩正博 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所