专利名称：一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测核糖核酸的方法，尤其是一种检测微小核糖核酸的方法，属 于生物技术领域。
背景技术：
微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链 小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发 育、组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着 紧密的联系。最早对于microRNA表达的研究是1993年由Harvord大学Ambros课题 组报道的，他们在线虫(Caenorhabditis elegans )体内发现了源于lin_4基因的一系列 microRNA分子。随后，人们采用多种实验方法和生物信息学手段寻找microRNA分子，至今 已经在各种物种中已发现一万多种miRNA，人类已发现七百多种miRNA，随着研究的深入将 会有新的miRNA被发现，并对其中一些分子的功能进行了深入研究。然而，这些研究依赖的 一个技术关键是如何分离、检测microRNA分子。特别是各种细胞或组织microRNA表达图 谱还不清楚的时候，开发和改善检测microRNA的技术就显得尤为重要。目前常用的方法 是先将microRNA分子扩增放大，然后再通过不同的方法来检测。因为microRNA的长度 太短，与常用的PCR引物长度相当，因此用传统的扩增技术进行放大非常困难。一种比较 常用的方法是先分离小片段RNA分子，然后在每一个分子的两端各加一个连接(核酸)分 子(Adaptor)，再根据连接分子来设计引物，最后进行RT-PCR扩增为下一步检测做好准 备。检测microRNA的绝对定量或相对定量方法包括real time-PCR, Northern Blot、微 阵列芯片(Microarray)、微球等不同的技术。real time_PCR是一种基于荧光染料或MGB 探针检测microRNA的方法，该方法简单快速，但均是专利技术，使用价格昂贵；Northern Blot是一种在硝酸纤维素膜上利用同位素探针杂交检测microRNA的方法，该方法程序复 杂、耗时费力，虽然其稳定性和可靠性都比较高，但是这两种方法均不能高通量的检测多种 microRNA;而microarray技术是利用微量点样等方法，将大量基因的寡核苷酸序列有序 地固化于支持物表面，然后与待测生物样品中标记的靶分子杂交，再通过特定仪器对杂交 信号的强度进行检测、分析，从而判断样品中靶分子数量的一种技术，但该技术灵敏度不如 前两种方法，对样品起始量要求较大，一般需要1-10 μ g的RNA量，而且由于microRNA碱 基数过少，探针碱基序列的选择余地受限，不同microRNA有不同的最适宜杂交温度，即使 在相同的杂交条件下，也会引起很大程度的错配杂交，从而限制了对于相似序列microRNA 的高效识别。另外，目前microRNA的相对定量检测时常用表达水平较高的内源性microRNA 作为参考，如has-mir-16等，但研究发现这些表达水平较高的microRNA,如has-mir_16 在各生物组织中及细胞中表达差异也较大，使得microRNA的相对定量检测存在一定困难。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上现有技术存在的缺陷，提出一种新的
4microarray技术，在微球上嫁接相应microRNA的核酸分子探针，利用流式细胞分离技 术，可以改善传统microarray的错配杂交问题，并可以同时检测近百种microRNA，达到高 通量检测的目的。本发明的技术原理是利用不对称PCR扩增结合液相芯片技术，先在生物样品 中加入定量的外源性mi croRNA，将mi croRNA进行扩增得到扩增产物，并将修饰后的含 有microRNA特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，扩增产物与液相 芯片杂交后通过液相芯片检测仪检测，通过比较待检测microRNA的荧光信号与外源性 microRNA的荧光信号的相对水平达到相对定量检测microRNA的目的。本发明的技术方案通过以下步骤实现
步骤一、制备液相芯片，从Sanger MiRBase数据库中选取成熟的microRNA序列作为探 针序列，在所述探针序列的5’端加上C12分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编 码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片；
步骤二、设计引物和探针，在所述成熟的microRNA序列后8位反向互补序列的5’端 加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物，剩余序列的5 ’端加上 ACACTCCAGCTGGG组成正向引物，并设计通用正、反向引物，在通用反向引物的5 ’端第1位及 第5位T碱基以生物素标记，在通用正向引物的第3位和第5位碱基进行锁核酸(LNA)修 饰；
步骤三、在待检测的RNA中加入外源性人工合成的2种microRNA，加入量为每50 ng 待测RNA各加5 fmol ；
步骤四、对待测样品RNA进行反转录反应，得到合成的cDNA ； 步骤五、对所述cDNA进行预扩增反应，得到预扩增产物；
步骤六、对所述预扩增产物进行不对称PCR扩增反应，得到待测样品的PCR扩增产物； 步骤七、将所述待测样品的PCR扩增产物与特异性检测微球杂交，得到杂交反应产物； 步骤八、将所述杂交反应产物离心弃上清后，与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白反应， 得到反应产物；
步骤九、用液相芯片检测仪对步骤八中的反应产物进行检测，得到检测结果。本发明的技术方案通过以下步骤进一步实现
步骤一中偶联的体积为25 μ 1，每IX IO6个荧光微球对应的特异性检测探针加入量为 0. 04 0. 1 nmol。步骤二中所述通用反向引物序列为TGGTGTCGTGGAGTCG，所述通用正向引物序列为 ACACTCCAGCTGGG。步骤三中所述外源性人工合成mi croRNA的序列为CA⑶CA⑶CA⑶CA⑶CA⑶CAG， GACCUCCAUGUAAACGUACAA。步骤四中反转录反应体系为 10X Reverse Transcription Buffer 2 μ 1， 25XdNTPs 0. 8 μ 1， 50 U/μ L 白勺 MultiScribe Reverse Transcriptase 1 μ 1, RNAase 抑制剂1 U，所述反转录引物5 nM, RNA 50 ng，补水至20 μ ，反应条件为16°C 30 min, 60 个循环的20°C 30 s, 42°C 30 s,50°C 1 s，最后85°C，5 min灭活反转录酶，得到合成的 cDNA。步骤五中反应体系为Multiplex PCR master mix 12.5 μ 1，正向引物各50 nM,
5通用反向引物0.2 μΜ,步骤四中合成的CDNA2 μ ，补充水至25 μ ，反应条件为95°C 15min，18 个循环的 94°C 15s，60°C 5s, 55°C 15s，72°C 15s，最后 72°C 2min。步骤六中反应体系为Multiplex PCR master mix 10 μ 1，通用正向引物各0. 1 μ Μ，通用反向引物1 μΜ，以水1 :400稀释步骤五中的预扩增产物2 μ 1，补充水至20 μ ，反应条件为 95°C 15 min，40 个循环的 94°C 15 s，60°C 1 min，最后 72°C 2 min，94°C 3 min。步骤七中杂交反应体系是33 μ 的1.5XTMAC、液相芯片2. 5 5 μ 1、待测样 品的PCR扩增产物1 10 μ 1，空白孔以等量TE取代PCR产物，以TE补足反应体积至50 μ 1，52°C杂交 10 min。步骤八中加入1 XTMAC稀释后浓度为4 μ g/ml的链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋 的白反应，52°C杂交10 min。本发明所提供的相对定量检测微小核糖核酸(microRNA)的液相芯片检测方法可 以用于microRNA的相对定量检测，其优点在于1.克服了普通PCR和荧光定量PCR在多 重检测方面的局限性；2.克服了固相芯片检测结果的可重复性差及敏感性不高的缺陷，本 发明中较为关键的预扩增步骤可显著增加样品中低峰度的microRNA检测；3.具有检测种 类多，一次反应可同时检测近百个microRNA，对于检测超过100种的microRNA，可将这些 microRNA分成几组，分几次检测完成全部所需microRNA的检测；4.反应时间短、整个反应 可在4小时内完成；5.本发明只需提取样品中总RNA，无需分离microRNA，简化了样品制 备过程，另外，在总RNA中加入定量的外源性人工合成的microRNA作为参考，通过比较其它 microRNA与外源性人工合成的microRNA的相对水平，解决了 microRNA相对定量检测问题； 6.由于杂交反应在液相环境中进行，可以改善传统microarray方法的错配杂交问题，本发 明的液相芯片特异性强且检测准确。为microRNA的定量检测提供新的途径。
具体实施例方式
实施例本实施例检测microRNA的液相芯片，是由分别包被有特异性检测探针的荧光微 球构成，其中，检测探针序列与miRBase数据库中的成熟的microRNA序列(包括2种人工 合成的microRNA序列，其序列与现有Sanger MiRBase数据库中microRNA序列均不同)相 同，(实际应用时具有至少一种即可)，在5’端加上C12分子臂和氨基修饰得到特异性检测 探针。步骤一、运用生物信息学知识和相关生物信息学软件检索Sanger MiRBase数据库 中所有的microRNA序列信息，取成熟microRNA序列作为探针序列，在探针的5’端加上C12 分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针，将特异性检测探针与荧光微球偶联，成为特异性 检测微球，即液相芯片。具体做法是取200 μ (2. 5Χ IO6个)羧基化的微球(购自美国 Bio-Rad公司)，10000 g离心2 min后弃上清，加入2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES) (0.1 M, pH=4. 5)25 μ 1，混勻。将特异性检测探针用MES稀释至0. 1福，取2 μ 1加至反应体系中， 再加入新鲜配置的10 mg/ml 1-乙基-3- (3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)2. 5 μ 1 (1. 25 2. 5 μ 1)，混勻后室温避光孵育30 min,重复加入新鲜配置的EDC —次，再次室温避光孵育30 min，用0. 5 ml吐温-20 (Tween-20) (0. 02% V/V)和0. 5 ml十二烷基磺酸钠 (SDS) (0. 1% W/V)各洗涤一次，最后用200 μ 1 Tris-EDTA (TE)重悬微球，血细胞计数器 计数后混合各种微球，用TE稀释每种微球的浓度至2000个/y 1，4°C避光保存。步骤二、运用生物信息学知识和相关生物信息学软件检索Sanger MiRBase数据 库中所有的mi croRNA序列信息，取成熟mi croRNA序列后8位反向互补序列的在5 ’端 加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物(R)，剩余序列在5，端 加上ACACTCCAGCTGGG组成正向引物(F )，通用反向引物(UR )序列为TGGTGTCGTGGAGTCG， 通用反向引物的5’端第1位及第5位T碱基以生物素标记，通用正向引物(UF)序列为 ACACTCCAGCTGGG, 5’端第3位和第5位碱基进行锁核酸(LNA)修饰；
步骤三、提取样品中总RNA，将待检测的RNA定量，每50 ng总RNA加入外 源性人工合成的2种microRNA各5 fmol,外源性人工合成的microRNA序列为 CA⑶CA⑶CA⑶CA⑶CA⑶CAG，GACCUCCAUGUAAACGUACAA。步骤四、反转录反应，反转录反应含10X Reverse Transcription Buffer 2 μ 1， 25XdNTPs 0. 8 μ 1， MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μ L) 1 μ l,RNAase^ 制剂1 U，各种反转录引物(R)5 nM,RNA 50 ng，补水至20 μ ，反应条件为16°C 30 min, 60 个循环的20°C 30 s, 42°C 30 s,50°C 1 s，最后85°C 5 min灭活反转录酶。步骤五、预扩增反应，反应体系为Multiplex PCR master mix 12.5 μ 1，正向引物 (F)各50 ηΜ，通用反向引物(UR)O. 2 μ Μ,步骤四合成的cDNA 2 μ ，补充水至25 μ ，反 应条件为 95°C 15min，18 个循环的 94°C 15 s，60°C 5 s，55°C 15 s，72°C 15 s，最后 72°C 2 min。步骤六、进行不对称PCR扩增，反应体系为Multiplex PCR master mix 10 μ ，通 用正向引物(UF)各0. 1 μ Μ，通用反向引物(UR)I μΜ,步骤五预扩增产物(以水1 :400稀 释)2 μ 1，补充水至20 μ ，反应条件为95°C 15min，40个循环的94°C 15 s，60°C 1 min, 最后 72°C 2 min,94°C 3 min。步骤七、取步骤六中待测样品的PCR扩增产物与制得的特异性检测微球杂交，得 到杂交反应物，PCR扩增产物与液相芯片的杂交反应体系为50 μ 1 :1.5Χ氯化四甲铵 (TMAC) 33 μ 1，液相芯片5 μ 1，PCR扩增产物1-10 μ 1，空白孔以等量TE取代PCR扩增产 物，用TE补足反应体积至50 μ 1。杂交反应的条件为52°C杂交15min ；
步骤八、杂交反应产物与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白(SA-PE)进行反应，取步骤 四制得的杂交反应产物10000 g离心2 min后弃上清，加入IXTMAC新鲜稀释的SA-PE (4 μ g/ml)共 75 μ 1，52°C杂交 10 min ；
步骤九、通过液相芯片检测仪检测，分析数据；首先，通过液相芯片检测仪(Bio-Plex System)直接读取以上实验中偶联特异性探针的微球，重复3次，确定Gate value的值为 4000-15000，然后芯片检测仪的参数设置如下
Events 50 ；Min Events :0 ；偶联特异性探针的微球所确定的Gate value 4000-15000。杂交反应产物与SA-PE反应IOmin后上机检测。所述主要溶液的配方如下
20% Sarkosyl 配方Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine) 50 g,力口水至 250 ml,过滤后室温储存；
1.5 X TMAC 杂交缓冲液配方(250 ml) 5 M TMAC 225 ml, 20% Sarkosyl 1.88 ml, 1 M Tris-HCl (ρΗ8· 0) 18. 75 ml，0· 5 M EDTA (pH 8. 0) 3. 0 ml,水 1. 37 ml,室温储存；
1 X TMAC 杂交缓冲液配方(250 ml) 5 M TMAC 150 ml, 20% Sarkosyl 1.25 ml, 1 M Tris-HCl (pH8. 0) 12. 5 ml,0. 5 M EDTA 2. 0 ml，水 84. 25 ml，室温储存。检测结果与数据分析
1获得各个样本每种microRNA原始荧光值(MFI)；
2将原始MFI值减去空白孔对应的荧光值得到净MFI ；
3将外源性人工合成的2种microRNA的净MFI取几何均数；
4将各样本每种microRNA的净MFI除以步骤3得到的几何均数即可得到各个 microRNA的相对表达水平。本实施例中对一例样本中15种microRNA进行检测，并与荧光定量检测方法进行 比较，结果如下可见本发明检测方法一次性检测种类多，且与荧光定量检测方法有较高的
一致性。
权利要求
一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，包括以下步骤步骤一、制备液相芯片，从Sanger MiRBase数据库中选取成熟的microRNA序列作为探针序列,在所述探针序列的5’端加上C12 分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片；步骤二、设计引物和探针，在所述成熟的microRNA序列后8位反向互补序列的5’端加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物，剩余序列的5’端加上ACACTCCAGCTGGG组成正向引物；并设计通用正、反向引物，在通用反向引物5’端第1位及第5位T碱基以生物素标记，在通用正向引物的第3位和第5位碱基进行锁核酸修饰；步骤三、在待检测的RNA中加入外源性人工合成的2种microRNA ，加入量为每50 ng待测RNA各加5 fmol；步骤四、对待测样品RNA进行反转录反应，得到合成的cDNA；步骤五、对所述cDNA进行预扩增反应，得到预扩增产物；步骤六、对所述预扩增产物进行不对称PCR扩增反应，得到待测样品的PCR扩增产物；步骤七、将所述待测样品的PCR扩增产物与特异性检测微球杂交，得到杂交反应产物；步骤八、将所述杂交反应产物离心弃上清后，与链霉菌抗生物素蛋白 藻红蛋白反应，得到反应产物；步骤九、用液相芯片检测仪对步骤八中的反应产物进行检测，得到检测结果。
2.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是步骤一中 偶联的体积为25 μ 1，每1 X IO6个荧光微球对应的特异性检测探针加入量为0. 04 0. 1 nmol ο
3.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是步骤二中 所述通用反向引物序列为TGGTGTCGTGGAGTCG，所述通用正向引物序列为ACACTCCAGCTGGG。
4.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是 步骤三中所述外源性人工合成microRNA的序列为CA⑶CA⑶CA⑶CA⑶CA⑶CAG， GACCUCCAUGUAAACGUACAA。
5.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是步骤四中 反转录反应体系为 10X Reverse Transcription Buffer 2 μ 1，25XdNTPs 0. 8 μ 1，50 U/μ L 的 MultiScribe Reverse Transcriptase 1 μ 1，RNAase 抑制剂 1 U，所述反转录 引物5 nM, RNA 50 ng，补水至20 μ ，反应条件为16°C 30 min, 60个循环的20°C 30 s, 42°C 30 s，50°C 1 s，最后85°C，5 min灭活反转录酶，得到合成的cDNA。
6.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是步骤五中 反应体系为Multiplex PCR master mix 12.5 μ 1，正向引物各50 ηΜ，通用反向引物0.2 μ Μ,步骤四中合成的cDNA2 μ ，补充水至25 μ ，反应条件为95°C 15 min，18个循环 的 94°C 15 s，60°C 5 s，55°C 15 s，72°C 15 s，最后 72°C 2 min。
7.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是步骤六中 反应体系为Multiplex PCR master mix 10 μ 1，通用正向引物各0. 1 μ Μ，通用反向引物 1 μ Μ,以水1 :400稀释步骤五中的预扩增产物2 μ 1，补充水至20 μ 1，反应条件为95°C 15 min，40 个循环的 94°C 15 s，60°C 1 min，最后 72°C 2 min, 94°C 3 min。
8.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是步骤七中杂交反应体系是33 μ 1的1. 5XTMAC、液相芯片2. 5 5 μ 1、待测样品的PCR扩增产物 1 10 μ 1，空白孔以等量TE取代PCR产物，以TE补足反应体积至50 μ1，52 杂交10mirio
9.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是步骤八中 加入IXTMAC稀释后浓度为4 μ g/ml的链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋的白反应，52°C杂交 IOmin0
全文摘要
本发明涉及一种检测核糖核酸的方法，尤其是一种检测微小核糖核酸(microRNA)的方法，属于生物技术领域。利用不对称PCR扩增结合液相芯片技术，先在生物样品中加入定量的外源性microRNA，将microRNA进行预扩增及扩增得到扩增产物，并将修饰后的含有microRNA特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，扩增产物与液相芯片杂交后通过液相芯片检测仪检测，通过比较待检测microRNA的荧光信号与外源性microRNA的荧光信号的相对水平达到相对定量检测microRNA的目的，为microRNA的定量检测提供新的途径。
文档编号G01N21/64GK101962685SQ201010539260
公开日2011年2月2日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者单云峰, 史智扬, 周明浩, 崔仑标, 戚宇华, 汪华, 葛以跃, 赵康辰 申请人:江苏省疾病预防控制中心