专利名称：生物大分子浓缩除盐方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种对液体样本中的生物大分子进 行浓缩除盐的方法以及采用该方法的试剂盒。
背景技术：
膀胱癌是一种严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤，占全球癌症发病率的2. 3%。 在我国泌尿系统恶性肿瘤中，膀胱癌发病率和死亡率均占首位，复发率高达50 % -70 %，远 端转移占10% -20%。这种高死亡率在很大程度上是由于膀胱癌的检测技术不够灵敏所 致。目前，膀胱癌的诊断主要依靠膀胱镜检查，一般是在患者出现血尿后才引起注意；但是 在这种症状下，膀胱癌已发展至中晚期，伴随严重的并发症，很难找到有效的治疗手段，而 且也无法避免高复发率。因此，膀胱癌的早期诊断具有极其重要的临床应用价值，能够极大 地提高膀胱癌的早期诊断水平和明显地改善膀胱癌患者的生活质量。类似膀胱癌这种疾病的诊断是通过尿液的致癌标志物来检测。尿液或其它体液具 有样本体积很大、蛋白质浓度比较低的特点，如何富集蛋白质已成为尿液等体液的相关研 究和临床中必须面临与要解决的问题。现在用于蛋白质制备，样品浓缩、除盐的方法有超滤法、透析法、丙酮沉淀等方法。 相对来说，超滤法成本较高，且滤膜上会吸附部分蛋白质会造成蛋白损失，特别对于低分子 量和低丰度蛋白来说特别明显，超滤管一般用了 1次就不建议重复使用；透析法时间特别 长，虽然能除盐，但是不能富集蛋白；丙酮沉淀制备蛋白的方法具有使蛋白质变性的副作 用，并且不利于处理大体积的样本，回收率也不高。如何找到一种成本低，浓缩、除盐效率 高，使样品保持活性，化学试剂污染小，能回收的方法或试剂处理大体积液体样本将会给相 关研究与临床带来新的突破口。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种适合用于大体积液体样本、浓缩 或除盐效率高且不会造成生物大分子变性的对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐 的方法。本发明的另一目的在于提供一种适合用于大体积液体样本、浓缩和除盐效率高且 不会造成生物大分子变性的对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐的方法，所述方法 包括a、根据待浓缩或除盐的生物大分子的分子量配置聚丙烯酰胺凝胶，b、将凝固后的聚丙烯酰胺凝胶烘干；C、将烘干后的聚丙烯酰胺凝胶放置于液体样本中使干凝胶充分吸胀；d、收集留在凝胶外部的生物大分子。
优选的，步骤b中，聚丙烯酰胺凝胶的烘干温度为50 70°C。所述生物大分子为蛋白质或者核酸。优选的，所述液体样本为尿液，所述生物大分 子为尿液蛋白。所述步骤a中配置聚丙烯酰胺凝胶的浓度优选为10 15%，更优选13%。步骤c中，液体样本体积不超过烘干前聚丙烯酰胺凝胶体积的60%。且优选将步 骤c置于4°C _15°C更优选于4°C下进行。在本发明具体 的实施方式中，步骤d中，所述收集留在凝胶外部的生物大分子的 具体过程包括，用水或缓冲液冲洗凝胶外部，使留在凝胶外部的生物大分子溶解，然后将凝 胶转入提前置于收集管中的网状疏水性提篮，将提篮上提一定高度保证提篮中的凝胶高于 收集管内的液面，并与收集管固定后，于50 150g离心2 5min，收集冲洗及离心后的液 体，得到浓缩除盐后的生物大分子。优选的，所述方法在步骤d后进一步包括，将聚丙烯酰胺凝胶充分清洗干净后回 收使用，所述聚丙烯酰胺凝胶充分清洗干净的方法包括纯水充分浸泡或超声洗涤。本发明进一步公开了一种用于对液体样本中的生物大分子进行浓缩除盐的试剂 盒，所述生物大分子为蛋白质或者核酸，所述试剂盒含有能够配置得到聚丙烯酰胺凝胶的 配方成分，或者所述试剂盒含有于50 70°C进行烘干的聚丙烯酰胺干凝胶。优选的，所述液体样本为尿液，所述生物大分子为尿液蛋白，所述配置得到聚丙烯 酰胺凝胶的浓度为10 15%，优选13%，或者所述聚丙烯酰胺干凝胶在烘干前的浓度为 10 15%，优选 13%。由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于本发明提供的聚丙烯酰胺凝胶浓缩除盐方法和试剂盒能有效地处理液体样本，操 作流程简易，并使蛋白质、核酸等生物大分子不变性、损失小，不仅浓缩和除盐效率高，所用 聚丙烯酰胺凝胶还能回收、反复利用，化学试剂残余几乎为0，方便后期实验的处理，是现有 的液体蛋白质、核酸样品制备、样本浓缩和除盐方法的很好的替代品。特别低，本发明采用 温和烘干的方式(于50 70°C优选65°C充分烘干使脱水完全)制备干凝胶，不会改变凝 胶分子的亲水性及交联度，属自然无变性过程，烘干后吸胀速度快；避免了利用醇类或酮类 物质进行脱水会造成凝胶分子亲水性和交联度的改变，使凝胶孔径变大，蛋白质等大分子 物质容易进入胶内而造成损失，且吸胀速度慢的缺点。本发明制备干凝胶的方法操作简单 且无其他化学物质(如醇类和酮类)的残留，避免对蛋白质等样品的污染或变性和修饰等 不良影响。胶浓缩效率高，成本低(浓度为13%的聚丙烯酰胺凝胶即可浓缩得到分子量大 于IOKD的蛋白质)。
图1为本发明一种聚丙烯酰胺凝胶法制备浓缩、除盐样品的操作流程图；图2为本发明实施例5的4个尿液样本用不同方法处理后跑SDS胶的结果图。
具体实施例方式本发明公开了一种适合用于大体积液体样本、浓缩和除盐效率高且不会造成生物 大分子变性的对液体样本中的生物大分子进行浓缩除盐的方法和试剂盒。下面的实施例仅 用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
本发明是采用将一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶用温和烘干(50-70°C优选65°C )等 方式脱水完全至变硬后加入适当体积的液体样品，置于4°C -15°C优选4°C待凝胶自然吸胀 完全后，水分和一些盐类等小分子会被吸进胶内，而大分子的蛋白质、核酸则被截留在胶表 面，再用适当体积的溶剂将蛋白或核酸冲洗并溶解，快速转入新管。这样便得到浓缩和除盐 后的样品。在本发明具体的实施方式中，本发明的目的可以通过以下操作流程来实现1)按下表所列的对应关系，根据提取或浓缩或除盐生物大分子的最低分子量选择 配置合适的聚丙烯酰胺凝胶的浓度。表1截留分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围/Pa I 凝胶浓度/(%)— 蛋白质
_>5k__20_
>10k__\3_
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>30k__5_>50k3
核酸
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_>5k__12_
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>20k__5_
>50k__2_在本发明中，配置聚丙烯酰胺凝胶的配方采用本领域常规使用的配方，通 常包括单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)、交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(N， N-methylene-bisacylamide,简称 Bis)、加速剂 N，N, N, N-四甲基乙二胺(简称 TEMED)和 催化剂过硫酸铵(简称APS)或核黄素。2)待配置好的聚丙烯酰胺凝胶凝固后，将凝固后的凝胶于50 70°C优选65°C充 分烘干使脱水完全。65°C为常用烘干温度，波动范围50°C -70°C为宜，温度过低所需烘干时 间长，温度过高容易破坏分子结构，包括聚丙烯酰胺凝胶结构。3)将上述烘干脱水完全的干凝胶放置于液体样品内，于4°C -15°C (常用温度为 4°C，为冰箱常用温度之一)条件下使凝胶充分吸胀。温度在上述范围内变化对浓缩结果影 响不大，但温度过高样品容易降解，温度过低不利于凝胶吸收样品液体。 在本发明的方法中，烘干脱水完全后的聚丙烯酰胺凝胶能吸胀的最大体积配置 聚丙烯酰胺凝胶的液体总体积=0.6 1，即脱水完全后的聚丙烯酰胺凝胶完全吸胀后最 多能吸收相当于配置聚丙烯酰胺凝胶液体总体积60%的液体。因此，为保证浓缩和除盐效果，在该步骤中，应使液体样本体积烘干前聚丙烯酰胺凝胶体积(即配置聚丙烯酰胺凝 胶的液体总体积)<0.6 1。同时为便于操作，也可在上述步骤1)中根据待浓缩的液体 样本体积，直接换算并配制合适体积的聚丙烯酰胺凝胶。在本发明的方法中，聚丙烯酰胺凝 胶过量使用对样品的浓缩除盐效果无不良影响，但会造成成本浪费。 4)用适量的溶剂，如纯水或者适当的缓冲液冲洗凝胶表面，溶解截留于吸胀后凝 胶外部的蛋白质或核酸，转移入提前置于收集管中的网状疏水性提篮，将提篮上提一定高 度，保证提篮中的凝胶高于收集管中液面，并使提篮与收集管固定后低速离心，比如可于 50 150g离心2 5min，甩出吸附在凝胶表面的样品，收集冲洗及离心后的液体即为所得 浓缩除盐后的生物大分子。离心速度过低则离心时间长，影响样品的收集率和盐分的有效 去除；速度过高容易使凝胶破烂。在上述范围内，通常可根据所使用的聚丙烯酰胺凝胶浓度 不同而选择不同转速，浓度高的凝胶能承受的转速大，所需离心时间短。5)凝胶经过回收处理(如纯水下超声3次洗出吸胀的物质)后脱水烘干，以备下 次使用。本发明的方法和试剂盒特别适合用于大体积液体样品中，低含量生物大分子的富 集浓缩和除盐，比如，特别适合用于尿液中尿蛋白的富集浓缩。本发明的有益效果在于(1)操作流程简易本发明提供的聚丙烯酰胺凝胶试剂盒操作简易(见图1)，即使 是没有实验室背景的人员也能看说明直接识别、操作，并且所用的试剂、仪器比较简单、常 见，一般的实验室都会配有，很容易普及。(2)成本低、回收率高本发明所提供的聚丙烯酰胺试剂盒，只需花费制备聚丙烯 酰胺凝胶试剂的金额，花费小，并且经过处理后重复使用而不影响效果。(3)蛋白质损失小通过SDS跑出的图可看出，本发明提供的聚丙烯酰胺凝胶试剂 盒能够提取低分子量的蛋白质，并且凝胶表面残余的蛋白可通过低速离心甩出。(4)可灵活选用不同浓度和体积的聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的浓度不同， 能够截留的分子量大小就不同，一般来说13%的聚丙烯酰胺凝胶能截留约IOKD的蛋白质， 根据需要制备的蛋白质可选用不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶。并且该试剂盒所浓缩的液体样 品体积不受限制，可灵活选用，非常方便，非常适合于大体积液体的浓缩和除盐。(5)蛋白质能保持活性。本发明提供的聚丙烯酰胺凝胶试剂盒没有变性剂等物质， 蛋白质不会变性。(6)蛋白质富集浓度高，除盐率高。13%聚丙烯酰胺凝胶试剂盒处理50ml尿液样 本能够得到1. 069mg的蛋白质，并且通过看SDS图，除盐效果好。本发明的方法和试剂盒适用于对液体样本中，将一定分子量大小以上的所有蛋白 质进行富集浓缩并除盐，可大概归结为1、将浓度较低的蛋白样品进行浓缩。2、将盐含量较高的蛋白样品进行除盐。3、从体积较大、蛋白含量较低的液体样本中富集蛋白并除盐，例如尿液蛋白的样 品制备。本发明不仅适合少量样品的浓缩和除盐，还适合大量样品的浓缩和除盐，适用范 围大，从几微升到几百毫升甚至更大体积的样品都适用。
特别地，本发明采用温和烘干的方式(于50 70°C优选65°C充分烘干使脱水完全)制备干凝胶，不会改变凝胶分子的亲水性及交联度，属自然无变性过程，烘干后吸胀速 度快；避免了利用醇类或酮类物质进行脱水会造成凝胶分子亲水性和交联度的改变，使凝 胶孔径变大，蛋白质等大分子物质容易进入胶内而造成损失，且吸胀速度慢的缺点。本发明 制备干凝胶的方法操作简单且无其他化学物质(如醇类和酮类)的残留，避免对蛋白质等 样品的污染或变性和修饰等不良影响。胶浓缩效率高，成本低。本发明创造了凝胶重复使 用的方法50 70°C优选65°C烘干方式和纯水浸泡并超声处理的方法使凝胶的重复使用 成为可能，因为这些方式对凝胶都是非化学、无变性作用。在本发明的方法和试剂盒中，可以采用疏水性提篮与收集管配套使用，在低速离 心作用下充分回收样品，减少了样品损失，大大提高了样品回收率。本发明的方法或者试剂 盒可单用于浓缩或单用于除盐，适用范围广。下面通过具体实施方式
结合附图对本发明作进一步详细说明。实施例1聚丙烯酰胺凝胶的配制按下述配方配制浓度为13%的聚丙烯胺凝胶(13%浓度的聚丙烯酰胺凝胶能截 留IOKD以上的分子，通过调节聚丙烯酰胺凝胶的浓度，可以获得需要截留的分子)，烘干后 聚丙烯胺凝胶的饱和吸收量为配置聚丙烯酰胺凝胶液体总体积的60%，按浓缩样品的量配 制相应体积的聚丙烯酰胺凝胶。置于适当的模具中，待凝固后，用光滑薄刀片将其切成所需 形状和体积，在65°C热板或烘箱条件下使凝胶脱水完全至变硬。13%的聚丙烯胺凝胶的配方为(V V)水55.63%30%单体储液(acr bis = 29 1) 43. 33%10 % APS (过硫酸铵)1 %TEMED0. 04%如配制IOml 13%的聚丙烯酰胺凝胶的配方如下水5. 56ml30%单体储液(acr bis = 29 1) 4.34ml10 % APS (过硫酸铵)0. ImlTEMED0. 004ml实施例2样品浓缩与除盐干凝胶用网状疏水性提篮套住后，选择适当的离心管或容器，将干凝胶置于容器 中，倒入需要浓缩和/或除盐的样品(烘干后聚丙烯胺凝胶的饱和吸收量为配置聚丙烯酰 胺凝胶液体总体积的60% )，4°C -15°C (优选温度4°C )条件下充分吸胀，待样品溶液吸 收完全即可。样品中的水、盐分等小分子物质被凝胶完全吸收，蛋白质等大分子物质滞留在 凝胶外。如做尿液浓缩时，蛋白质被滞留在凝胶外。实施例3样品的冲洗和转移用一定量的纯水(或其它buffer，如PBS、TBS、lysis buffer 等，lysis buffer :8M 尿素+4% CHAPS+40mM Tris-HCl+lmM PMSF+2mM EDTA+IOmM DTT)冲洗吸胀后的凝胶表面， 使蛋白质溶于溶剂，之后转移入网状疏水性提篮并置于收集管中。将提篮向上提Icm(上提 的距离由收集管中液体的高度决定，约比液体高度高一点点)，固定提篮后，50-150g离心2-5min,液体样品被甩出网状疏水性提篮，收集得到浓缩和除盐后的样品。当用于冲洗凝胶的纯水(或其它合适的buffer)加入过多时，此时可通过冷冻抽 干的方法对样品进行进一步的浓缩(样品已经除盐，所以冷冻抽干不会使样品变质)。实施例4凝胶的回收从网状疏水性提篮中拿出聚丙烯酰胺凝胶，经过处理后可重复使用。参考的处理方法为(也可用本实施例以外的方法处理)在超声槽中加入5倍或 以上胶体积的纯水，加入吸胀后的聚丙烯酰胺凝胶，超声3次，每次换水。当超声后的水没 有气泡，清澈，可将聚丙烯酰胺凝胶置于65°C热板或烘箱条件下使凝胶脱水完全至变硬。将 脱水后的凝胶回收，干燥环境下保存，以备再次使用。除上述参考方法外，在本发明中，吸胀后的聚丙烯酰胺凝胶也可采用其它方法进 行回收处理，比如用纯水直接浸泡使聚丙烯酰胺凝胶清洗干净。实施例5尿液蛋白样品的制备 将同一批正常人尿液样本200ml分成4份，每份各50ml，分别标注为1、2、3、4号样 本。分别从1-4号样本中制备尿液蛋白。1号样本用常规的超滤法制备，2、3、4号样本分别 用本发明制备的浓度为15%、13%、10%的聚丙烯酰胺凝胶试剂盒制备，具体方法参考上述 实施例1-4。4份样本浓缩后的尿液蛋白质样品分别跑SDS胶，上样量都为20 μ g。SDS胶图如 图2所示。结果显示，2号、3号样品除盐效果很好，并且蛋白质的种类、浓度都比1号、4号 样品都高；并且看到2号、3号能截留IOKD的蛋白质，本发明试剂盒不会丢失小分子量的蛋 白质。由于盐分影响，含盐样品的泳道往下变宽成梯形状。在考虑成本的前提下，当用于尿液蛋白的制备时，13%的聚丙烯酰胺凝胶试剂盒 浓缩和除盐效果最好。实施例6 —种用于从尿液中富集尿液蛋白的试剂盒—种试剂盒，含有密封包装的聚丙烯酰胺干凝胶，该干凝胶在烘干前浓度为13 %， 且是在50 70°C温度条件下进行烘干脱水完全的。该试剂盒用于从尿液中富集尿液蛋白。实施例7另一种用于从尿液中富集尿液蛋白的试剂盒一种试剂盒，含有可配置得到聚丙烯酰胺凝胶的以下成分30%单体储液 (acr bis = 29 1)、10% APS(过硫酸铵)和TEMED。该试剂盒还含有说明书。该试剂 盒可用于从尿液中富集尿液蛋白。实施例8聚丙烯酰胺凝胶试剂盒浓缩和除盐样品的蛋白质浓度测定利用上述实施例6的试剂盒，按照实施例2-4所述的方法，或者利用上述实施例7 的试剂盒，按照实施例1-4所述的方法(聚丙烯酰胺凝胶浓度为13% )，在相同条件下分别 对3组各50ml正常人尿液样本进行浓缩和除盐。浓缩和除盐后的蛋白质样品分别用酶标 仪测定蛋白浓度。结果见下表，可以看出，本发明试剂盒提取的总蛋白量很高，能满足蛋白 质组等研究的需要。表213%聚丙烯酰胺凝胶试剂盒浓缩尿液后的蛋白质浓度测定
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权利要求
1.一种对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐的方法，所述方法包括a、根据待浓缩或除盐的生物大分子的分子量配置聚丙烯酰胺凝胶，b、将凝固后的聚丙烯酰胺凝胶烘干；C、将烘干后的聚丙烯酰胺凝胶放置于液体样本中使干凝胶充分吸胀；d、收集留在凝胶外部的生物大分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中，聚丙烯酰胺凝胶的烘干温度为 50 70 。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物大分子为蛋白质或者核酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述液体样本为尿液，所述蛋白为尿液蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤a中配置聚丙烯酰胺凝胶的浓 度为10 15%，优选13%。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤c中，液体样本体积不超过烘干 前聚丙烯酰胺凝胶体积的60%。
7.根据权利要求1、2、4、5中任意一项所述的方法，其特征在于步骤d中，所述收集留 在凝胶外部的生物大分子的具体过程包括，用水或缓冲液冲洗凝胶外部，使留在凝胶外部 的生物大分子溶解，然后将凝胶转入提前置于收集管中的网状疏水性提篮，使提篮中的凝 胶高于收集管中的液面，并固定于收集管，于50 150g离心2 5min，收集冲洗及离心后 的液体，得到浓缩除盐后的生物大分子。
8.根据权利要求1、2、4、5中任意一项所述的方法，其特征在于所述方法在步骤d后 进一步包括，将聚丙烯酰胺凝胶充分清洗干净后回收使用，所述聚丙烯酰胺凝胶充分清洗 干净的方法包括纯水充分浸泡或超声洗涤。
9.一种用于对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐的试剂盒，所述生物大分子为 蛋白质或者核酸，其特征在于所述试剂盒含有能够配置得到聚丙烯酰胺凝胶的配方成分， 或者所述试剂盒含有于50 70°C进行烘干的聚丙烯酰胺干凝胶。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述液体样本为尿液，所述生物大分 子为尿液蛋白，所述配置得到聚丙烯酰胺凝胶的浓度为10 15%，优选13%，或者所述聚 丙烯酰胺干凝胶在烘干前的浓度为10 15%，优选13%。
全文摘要
本发明公开了一种对液体样本中的生物大分子进行浓缩除盐的方法和试剂盒，所述生物大分子为蛋白质或者核酸，本发明的方法包括配置聚丙烯酰胺凝胶并烘干，然后放置于液体样本中使干凝胶充分吸胀，收集留在凝胶外部的生物大分子。本发明提供的聚丙烯酰胺凝胶浓缩除盐方法和试剂盒能有效地处理液体样本，操作流程简易，并使蛋白质、核酸等生物大分子不变性、损失小，不仅浓缩和除盐效率高，所用聚丙烯酰胺凝胶还能回收、反复利用，是现有的液体蛋白质、核酸样品制备，样本浓缩和除盐方法的很好的替代品。
文档编号G01N1/34GK102072836SQ201010542498
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者李启沅, 林志龙, 林梁, 邱雪梅 申请人:深圳华大基因科技有限公司