血小板血栓或脏器损伤的检测方法

专利名称：血小板血栓或脏器损伤的检测方法
技术领域：
本发明涉及血小板血栓或脏器损伤的检测方法，尤其是涉及弥散性血管内凝血 (Disseminated Intravascular Coagulation ；DIC) sK^^-f^i^SEixlSi^^in (Systemic inflammatory response syndrome ；SIRS)患者的上述检测方法。根据本发明，通过分析受 试者(尤其是，DIC或SIRS患者)的生物样本(例如，血液)中的血管性血友病因子(von Willebrand factor ；VffF)和/或其分解因子，可检测血小板血栓或脏器损伤，例如，检测或 预测血小板血栓形成程度、对血栓症或脏器损伤的发病情况进行预测(即，发病的危险性 评价)、判断血栓症或脏器损伤的有无、对血栓症或脏器损伤的预后进行预测、监测、确定治 疗方法等。
背景技术：
DIC继发于严重的基础性病变，在全身微血管内形成微血栓。因而，微循环发生障 碍，表现出脏器功能衰竭或出血倾向。DIC的病情，也和SIRS有关。DIC时，会发生以下三 种障碍或反应。(1)微血栓形成引发的微循环障碍，由于缺血致使多种脏器功能衰竭。(2)微血栓形成引发的消耗性凝血障碍，即，组织因子在细胞表面大量表达，促进 外源性血液凝固。此外，血液凝固因子、血小板被消耗，呈现出血倾向。(3)过度纤溶，即凝固促进了纤溶系统的激活，生成分解纤维蛋白的纤溶酶。抑制 纤溶酶的α2纤溶酶抑制物(Ci2PI)被消耗，当其减少到低于正常情况的60%时，纤维蛋白 就会被纤溶酶分解，呈现出血倾向。此外，在并发败血症的DIC的情况下，单核细胞(巨噬细胞)产生的肿瘤坏死因 子(TNF-a)、白介素(IL-Ιβ)等细胞因子，激活嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞产生的嗜中 性粒细胞弹性蛋白酶、活性氧引起血管内皮细胞损伤，使得血管内皮通透性过度增加，血管 痉挛，循环泥化淤滞，发生微循环障碍。此外人们还认为，在受损的血管内皮上，单核细胞本 身、血管内皮细胞被激活，细胞表面表达组织因子，形成微血栓。微血栓形成使微循环障碍 进一步恶化，引发多脏器功能衰竭(multiple organ failure ；M0F) 0近年普及的SIRS概 念中，将该MOF解释成是由全身性炎症反应引起的。ARDS(adult respiratory distress syndrome)时，血小板集中于肺循环，引起肺动脉闭塞。SIRS并非由于因与特定抗原反应， 引起细胞因子数量增加所导致的炎症反应，而是因没有特定靶标，针对入侵生物体的侵袭 的非特异性免疫反应被激活，细胞因子生成失控而引起重症MOF的一类疾病(非专利文献 1，2)。SIRS可分为非感染性SIRS和脓毒症(S印sis)，前者是由休克、外伤、烧伤或急性 胰腺炎等引起的，后者则是由各种病原菌的菌血症、其他重症感染引起的。SIRS是生物体对病原体入侵、组织损伤或缺氧等发生的自身免疫反应，是和侵袭种类无关的由各种内源 性介质引起的非特异性全身急性炎症反应。SIRS并发的脏器功能衰竭，早期是源于组织 缺血、炎症，但由SIRS拖延引起的多脏器功能失调综合征(Multiple organ dysfunction syndrome ；MODS)的病情恶化与各种介质介导的过度生物反应有关，SIRS是一组很难预测 预后的疾病。SIRS时，血中TNF-α、IL-I、IL_6等炎症因子显示高值，其中，TNF-α被认为是引 发SIRS状态下的嗜中性粒细胞激活、血液凝固反应亢进的细胞因子。若嗜中性粒细胞的活 化程度超过其对血管内皮细胞的细胞保护作用，会发生嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋 白酶G(Cath印sin G)所致的血管内皮细胞损伤。引起微循环障碍或形成微血栓。活化的 嗜中性粒细胞，不但聚集于引起炎症反应的局部部位，而且还会聚集于肺、肝(灌流压低， 白细胞易于粘附)等远处脏器。一般认为，微循环障碍引起血液泥化(sludging)，进而通 过形成微血栓，引起血流停滞(stasis)，组织处于缺血状态，从而引发多脏器功能衰竭。此 外，嗜中性粒细胞通过血管外浸润，引起实质性脏器损伤。若微血栓形成持续下去，血液凝 固因子、血小板将被消耗掉。若SIRS状态持续3天以上，则易并发DIC。由此，DIC和SIRS 病情非常紧密的关联在一起。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶是分子量约3万的中性蛋白酶，存在于嗜天青(7夂一 颗粒。生理状态下，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，在嗜中性粒细胞内，消化、分解被吞噬的
细菌、异物，在嗜中性粒细胞外，则分解弹性蛋白、胶原(III型、IV型)、纤连蛋白、免疫球蛋 白、血液凝固因子XIII等，调节组织生物合成。病理状态下，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶则使 生物体构成成分，例如，弹性纤维、蛋白聚糖、胶原纤维、抗凝血酶III、α 2-纤溶酶抑制物失 活。若嗜中性粒细胞弹性蛋白酶作用于抗凝血酶III的肝素结合位点，使抗凝血酶III失 活，则引发DIC。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，在血液中，结合于蛋白酶抑制物(cifprotease inhibitor ； α rAT)，α ^AT可在3毫秒内使由嗜中性粒细胞释放到血液内的嗜中性粒细胞 弹性蛋白酶失活。然而，在发生炎症反应的组织，由于Ci1-AT被嗜中性粒细胞释放的活性 氧、髓过氧化物酶、乳铁蛋白氧化，这使得嗜中性粒细胞弹性蛋白酶不能被失活，从而引起 组织损伤。由于嗜中性粒细胞弹性蛋白酶底物特异性低，因而当其释放过量，并且α「AT等 抑制物缺乏时，则存在生物体构成成分被分解，引发嗜中性粒细胞弹性蛋白酶所致的自身 组织损伤的危险。受到严重损伤的血管内皮细胞脱落，血小板粘附凝集于脱落部位，形成血 栓。血浆中人VWF是该血小板粘附所必需的，以其为导火索，引发血小板凝集、细胞内 颗粒释放等一系列血小板活化过程，其结果是，形成血栓，从而止血。通常，VWF是作为分子 量在20，OOOkDa以上的超大分子由血管内皮分泌到血中，然后被其中的金属蛋白酶，即VWF 分解酶切断成500 20，OOOkDa的多聚合体(multimer)后，在血液中循环。在疾病状态下 (因闭塞等而产生高应力的状态)，VWF的立体结构发生变化，成为伸展结构。这样的VWF很 难被VWF分解酶分解，因而，血中残留大量通常观察不到的巨大VWF分子，与血小板的结合 更为有效，由此，促进了血管内血小板的凝集，在微循环形成血栓。尽管这种以血小板为主 体的血栓形成是生理性止血机制所必需的，但血栓形成源自凝固因子(第VII因子、第H因 子等)活化所引起的血小板融合和纤维蛋白形成。非专利文献1 :Bone RC, CriticalCare Medicine (美国)，1996，24 卷，第
41125-1128 页非专利文献2:Davies MG.等，British Journal of Surgery (英国)，1997，84卷， 第 920-935 页

发明内容
发明要解决的问题如上述，明确解释以血小板为主体的血栓和以纤维蛋白为主体的血栓的形成的调 控机制的因子，尽管至今尚未报道，然而，通过探明DIC患者、SIRS患者身上观察到的全身 微血管中的由纤维蛋白和血小板构成的微血栓的形成机制，可以对DIC、SIRS患者常见的 预后不良状态予以改善。此外，通过适当早期治疗，则有可能阻止脏器损伤的发病。本发明 人经过锐意研究，其结果是，发现弹性蛋白酶、纤溶酶或凝血酶使VWF分解酶分解，该分解 模式因弹性蛋白酶、纤溶酶或凝血酶而有所不同，进而发现弹性蛋白酶值高的DIC或SIRS 患者的血浆中的VWF分解酶的浓度显著低于正常健康人，由此完成了本发明。S卩，本发明的目的在于提供检测受试者(尤其是，DIC或SIRS患者)的血小板血 栓或脏器损伤的方法，以及上述检测用试剂盒。解决问题的手段根据本发明方法，通过分析血管性血友病因子(Von Willebrand VffF)和/或其分 解因子，检测弥散性血管内凝血或全身性炎症反应综合征患者的血小板血栓或脏器损伤， 可以解决上述问题。根据本发明方法的优选实施方式，上述分解因子是选自弹性蛋白酶、纤溶酶和凝 血酶组成的组的蛋白酶(更优选弹性蛋白酶)。此外，根据本发明方法的其它优选实施方式，通过免疫学方法对血管性血友病因 子予以分析。此外，根据本发明的其它优选实施方式，在加入含有血管性血友病因子分解酶的 拮抗剂，抑制剂，激动剂或活性调节剂作为有效成分的医药组合物后，进行上述分析。此外，根据本发明方法的其它优选实施方式，加入含有选自弹性蛋白酶、纤溶酶和 凝血酶的蛋白酶的拮抗剂，抑制剂，激动剂或活性调节剂作为有效成分的医药组合物后，进 行上述分析。此外，本发明还关于弥散性血管内凝血或全身性炎症反应综合征患者的血小板血 栓或脏器损伤的检测用试剂盒，其含有与血管性血友病因子分解酶特异性结合的抗体或其 片段，和/或与血管性血友病因子分解酶的分解因子特异性结合的抗体或其片段。根据本发明的试剂盒的优选实施方式，还含有与经选自弹性蛋白酶、纤溶酶和凝 血酶的蛋白酶切断后的VWF分解酶特异性结合的抗体或其片段。本说明书中的用语“分析”包含“检测”和“测定”，即判断分析对象物质(例如， VffF)是否存在(检测)，又定量或半定量确定分析对象物质的量或活性(测定)。发明效果本发明可检测受试者，例如DIC或SIRS患者，更具体而言，发生弹性蛋白酶值度高 的尿道感染、转移性肺癌、和/或急性骨髓性白血病等基础病变的DIC或SIRS患者的血小 板血栓或脏器损伤情况，具有很高的临床价值。根据本发明，可简便、迅速和高特异性地对血小板血栓或脏器损伤进行检测。


图1是经弹性蛋白酶处理后的重组VWF分解酶抗原的电泳结果示意图。图2是经纤溶酶或凝血酶处理后的重组VWF分解酶抗原的电泳结果示意图。图3是显示VWF分解酶和弹性蛋白酶相关的图。图4是以弹性蛋白酶含量区分的各组患者的VWF分解酶抗原量的分布示意图。
具体实施例方式(1)本发明的检测方法根据本发明，通过对VWF分解酶和/或其分解因子的量(浓度)或酶活性进行定 量，并与正常健康人的VWF分解酶和/或其分解因子的量(浓度)或酶活性进行比较，可对 血栓症或脏器损伤进行检测(诊断)。本说明书中，血栓症或脏器损伤的检测包括，例如， 血小板血栓形成程度的检测或预测、血栓症或脏器损伤的发病预测(即，发病的危险性评 价)、血栓症或脏器损伤的存在与否的判定、血栓症或脏器损伤的预后预测、检测、治疗方法 的确定等。本发明方法既可分析VWF分解酶或VWF分解酶的分解因子的量(浓度)，也可分 析酶活性，但优选分析量(浓度)。以下，主要基于分析VWF分解酶或其分解因子的量(浓 度)的实施方式，对本发明进行说明，以下说明也应当适用于分析酶活性的实施方式。本说明书中，血管性血友病因子分解酶(VWF分解酶)是指特异性切断血管性血友 病因子(VWF)的A2区域的酪氨酸(842)和甲硫氨酸(843)，也被称为ADAMT13的金属蛋白 酶。本发明方法中，可以将VWF分解酶浓度比正常健康人低作为指标。如后述实施例3 所示，弹性蛋白酶为高值(例如，lOOng/mL以上)的DIC和SIRS患者，与正常健康人相比， 其体液样本中所含的VWF分解酶浓度要低，其具有统计学意义(50%或其以下)。类似地， 采用本发明方法，对VWF分解酶浓度进行定量，若比正常健康人的正常值范围低(例如，超 过阈值)，可断定血小板血栓形成程度高，还可断定血栓症或脏器损伤发病的危险性高，进 而还可断定血栓症或脏器损伤的预后情况不好。另一方面，若VWF分解酶浓度在正常值范 围内，则可断定血小板血栓形成程度低，还可断定血栓症或脏器损伤发病危险性低，进而还 可断定血栓症或脏器损伤的预后情况良好。本发明方法的可适用对象(受试者)，只要是需要进行血小板血栓形成程度的检 测，或血栓症或脏器损伤(例如，肾损伤或肝损伤，优选肾损伤)的发病或预后预测的患者 即可，没有特别限定，例如，可以是DIC或SIRS患者，优选弹性蛋白酶为高值的DIC或SIRS 患者，例如，患有白血病(例如，急性骨髓性白血病)、感染(例如，尿道感染)或癌(转移性 肺癌)等基础病变的DIC或SIRS患者。血栓症时，血液在血管中凝固，附着于血管壁形成血栓，由此，血管变狭窄，完全阻 塞，血液流动停滞，引起组织、脏器损伤。血管受伤破裂时，血液中的血小板聚集于上述伤 口，进行止血。纤维蛋白凝集于此处形成血栓，完全止血，血管壁细胞开始增殖，血管被修 复。通常情况下，随后，溶解血栓的成分发挥作用，血流恢复流动。若该纤溶作用没有正常发挥作用，则血栓会阻碍血液流动，当血液流动被完全阻断时，就成了血栓症。据说，40多 岁的日本人，5人中就有1人，50多岁的，3人中就有1人，60多岁的2人中就有1人，70多 岁的基本上都患有血栓症。血栓症的主要症状是，在脑部，发生脑血栓、脑栓塞、短暂性脑缺 血发作；在肺部，发生肺血栓栓塞症，在心脏，发生心绞痛、心肌梗塞、心房内血栓，其它的还 有，肠系膜血栓、深部静脉血栓症(工二 7 S —症等)。本发明方法，通过分别从正常健康人和受试者(例如，DIC或SIRS患者)采集待 检样品，分别测定其VWF分解酶浓度后，比较测定值，可进行上述检测和/或预测，然而，通 常优选预先用采自正常健康人的待检样本，确定VWF分解酶浓度的正常值范围或判定用阈 值。在正常值范围或判定用阈值预先确定的情况下，只需对作为预测对象的受试者的VWF 分解酶进行分析，就可以对上述受试者进行上述检测和/或预测。上述正常值范围或判定 用阈值范围，会因各种条件，例如，基础病变、性别、年龄等有所变化，但本领域的技术人员， 通过适当选择与受试者对应的适当的母集团，并对从该集团获得的数据进行统计学处理， 就可确定正常值范围或判定用阈值。本发明方法中，VWF分解酶的分析方法，只要能够定量或半定量确定VWF分解酶的 量，或者是判定VWF分解酶的存在与否即可，没有特别的限定，例如可以举出，使用抗VWF分 解酶抗体或其片段的免疫学方法(例如，酶免疫测定法、乳胶凝集免疫测定法、化学发光免 疫测定法、荧光抗体法、放射免疫测定法、免疫沉降法、免疫组织染色或ffesternblot等)、 生化学方法(例如，酶学测定法)或测定mRNA量的分子生物学方法等。在采用免疫学方法作为VWF分解酶的分析方法的情况下，抗VWF分解酶抗体或其 片段，可以依照公知的方法，例如，W02004/029242号小册子中记载的方法进行制备，各种免 疫学测定，例如，可依据W02004/029242号小册子中记载的方法进行。VWF分解酶的测定方法，从敏感度和简便性考虑，优选免疫学方法。此处，免疫学方 法指的是，使用VWF分解酶的抗体，例如，以ELISA法、乳胶法或免疫色谱法对VWF分解酶进 行分析的方法。免疫学方法，例如有，对VWF分解酶进行标记的竞争结合法、对抗体进行标 记的夹心法、观察涂覆有抗体的珠子的凝集情况的乳胶珠法、或使用了结合于胶体金等着 色粒子的抗体的方法等各种各样的方法，只要是使用了 VWF分解酶的抗体的方法，就包含 在本发明的优选实施方式内。抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。此外，抗体 片段，例如可以使用Fab、Fab，、F (ab，)2或Fv。本发明方法中，待检样本，优选，例如血浆形态的血液，但也可使用其它材料，例 如，细胞组织液、淋巴液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、胰液、骨髓液或唾液等各种体液。此 外，上述血浆优选是枸橼酸血浆或肝素血浆。本发明方法中，可以对VWF分解酶和VWF分解酶分解因子一起分析，也可以分别独 立分析。作为待分析的上述分解因子，例如，可以是至少一种选自弹性蛋白酶、纤溶酶或凝 血酶的蛋白酶。如后述实施例1和实施例2所示，本发明人发现VWF分解酶可被弹性蛋白 酶、纤溶酶或凝血酶分解，并且，其分解模式也因弹性蛋白酶、纤溶酶或凝血酶而有所不同。 因而，VWF分解酶的低下，是由弹性蛋白酶、纤溶酶或凝血酶造成的。本发明方法，通过分析VWF分解酶或VWF分解酶分解因子的任意一方，可对血小板 血栓或脏器损伤进行检测，但若既对VWF分解酶进行分析，又对上述分解因子(即，蛋白酶) 进行分析，则可更准确地检测或预测。
本发明方法，可以将和正常健康人比较得到的上述蛋白酶浓度的变动作为指标。上述蛋白酶浓度，可用各种公知方法予以测定，例如，可采用如下方法测定。在血 中，90%或90%以上的弹性蛋白酶以和Ci1-抗胰蛋白酶结合的状态存在。该复合体可采用 使用单克隆抗体的ELISA法测定。此外，血中产生的凝血酶，也由于被各种因子快速中和， 因而，无法直接测定。然而，通过测定凝血酶和抗凝血酶III形成的复合体(TAT)，可在一定 程度上对血中产生的凝血酶的量进行预测。纤溶酶，和凝血酶一样，由于很快从血中消失， 因而无法直接测定，但可作为纤溶酶和α 2-抗纤溶酶形成的复合物(PIC)来测定。在测定 TAT、PIC复合物时，可以使用采用单克隆抗体、多克隆抗体的ELISA法、乳胶凝集法等。本发明方法也可用于监测患者服用所需的医药组合物后的状态(例如，血小板血 栓形成程度的评价、血栓症或脏器损伤发病或预后预测)。上述医药组合物，没有特殊限定， 例如可以举出，含有VWF分解酶的拮抗剂、抑制剂、激动剂或活性调节剂作为有效成分的医 药组合物，或者是，含有选自弹性蛋白酶、纤溶酶和凝血酶的蛋白酶的拮抗剂、抑制剂、激动 剂或活性调节剂作为有效成分的医药组合物。此外，由于上述各种蛋白酶对VWF分解酶的分解模式不同，本发明人认为，血小板 血栓和纤维蛋白血栓的生成调控如下首先，通过弹性蛋白酶分解VWF分解酶，形成血小板 血栓，接着，纤维蛋白沉淀附着，形成纤维蛋白血栓，据此分泌的纤溶酶、凝血酶分解VWF分 解酶。例如，通过掌握导致VWF分解酶的量的变化的主要因素是基于哪种蛋白酶，可更准确 的判断病情。例如，当观察到弹性蛋白酶量的增高和VWF分解酶量的减少时，可判断处于血小 板血栓形成初期阶段，或者是当观察到纤溶酶或凝血酶量的增高和VWF分解酶量的减少 时，可判断处于血小板形成后的后期阶段。通过更准确地掌握病情，可选择更为适当的治疗 方案。上述蛋白酶之中，从VWF分解酶分解活性最高和参与初期阶段考虑，优选以弹性蛋白 酶作为诊断指标。(2)本发明的检测用试剂盒本发明试剂盒，至少包含抗VWF分解酶抗体或其片段，和/或与VWF分解酶的分解 因子特异性结合的抗体或其片段，优选包含2种或2种以上不同的抗VWF分解酶抗体，和/ 或2种或2种以上不同的抗分解因子抗体。此外，本发明试剂盒，根据需要还可含有与经蛋 白酶切断后的VWF分解酶特异性结合的抗体或其片段，其中，上述蛋白酶选自弹性蛋白酶、 纤溶酶和凝血酶。本发明试剂盒，可在实施本发明方法时使用。本发明试剂盒所含的抗VWF分解酶抗体或抗分解因子抗体，可以是单克隆抗体或 多克隆抗体。此外，在含有2种或2种以上不同的抗VWF分解酶抗体，或2种或2种以上不 同的抗分解因子抗体的情况下，可将任意一方(第2抗体)作为标记抗体，或者不标记，而 是再在试剂盒中追加经过标记的抗第2抗体的抗体。
实施例以下，根据实施例对本发明进行详细说明，本发明的范围并不限于此。《实施例1弹性蛋白酶对重组VWF分解酶抗原的分解作用》将重组VWF分解酶1. 5 μ g溶解于tris缓冲液/生理盐水，添加弹性蛋白酶直至 终浓度为20nmol/L或140nmol/L，37°C孵育15分钟或1小时后，分别取相当于0. 5 μ g的VffF分解酶。将其以非还原SDS电泳(5 20%凝胶)分离后，用Westernblot法转移至 PVDF(聚偏氟乙烯)膜。用市售封闭剂(Block Ace，大日本制药)室温封闭30分钟后，以 tris缓冲液清洗。于1 μ g/mL抗VWF分解酶单克隆抗体(WH2-22-1A 以VWF分解酶的解联 蛋白区域作为抗原决定簇)/tris缓冲液(pH7. 4)/10% Block Ace中，室温反应1小时后， 以tris缓冲液(pH7. 4)/0. 05% NP-40清洗3次，然后在稀释了 2000倍的HRP (辣根过氧 化物酶)标记的抗小鼠IgG抗体(BioRad)/tris缓冲液(pH7. 4)/10% Block Ace溶液中， 室温孵育1小时。以tris缓冲液(ρΗ7· 4) /0. 05% ΝΡ-40清洗3次后，用TMB溶液(Pierce 公司)显色。结果示于图1。图1中各泳道的对应关系如下1 未添加弹性蛋白酶2 添加20nmol/L弹性蛋白酶后，37°C反应15分钟3 添加140nmol/L弹性蛋白酶后，37°C反应15分钟4:未添加弹性蛋白酶5 添加20nmol/L弹性蛋白酶后，37°C反应1小时6 添加140nmol/L弹性蛋白酶后，37°C反应1小时在添加20nmol/L弹性蛋白酶，37°C反应15分钟的情况下，VWF分解酶的160KDa条 带基本上都被切断成50KDa，在37°C反应1小时的情况下，160KDa条带消失，50KDa的条件 也基本上消失。另外，在添加140nmol/L弹性蛋白酶的情况下，若孵育15分钟以上，160KDa 的条带全部消失。该结果提示，弹性蛋白酶对VWF分解酶的分解作用具有浓度和时间依赖 性。《实施例2纤溶酶或凝血酶重组VWF分解酶抗原的分解作用》将重组VWF分解酶1. 5 μ g溶解于tris缓冲液/生理盐水，添加纤溶酶原(终浓 度1 μ mol/L)和组织纤溶酶原激活物(tPA)(终浓度0. 2nmol/L或2nmol/L)，或者是添加凝 血酶直至终浓度为20mU或200mU，37°C孵育15分钟或1小时后，分别取相当于0. 5 μ g的 VffF分解酶。将其用SDS电泳分离后，以和实施例1 一样的方法.进行Wfesternblot，检测 VWF分解酶的条带。结果示于图2。图2中各泳道的对应关系如下1 添加 0. 2nmol/L tPA 后，37°C反应 15 分钟2 添加 2nmol/L tPA 后，37°C反应 15 分钟3 添加20mmol/L凝血酶后，37°C反应15分钟4 添加200mmol/L凝血酶后，37°C反应15分钟5:未添加蛋白酶6 添加 0. 2nmol/L tPA 后，37°C反应 1 小时7 添加 2nmol/L tPA 后，37°C反应 1 小时8 添加20mmol/L凝血酶后，37°C反应1小时9 添加200mmol/L凝血酶后，37°C反应1小时在添加纤溶酶或凝血酶，在37°C反应15分钟的情况下，基本上都没有观察到 160KDa条带分解。在添加纤溶酶，37°C反应1小时的情况下，两个浓度，除160KDa条带外， 还都出现被认为是分解得到的130KDa和IOOKDa的条带。此外，在添加凝血酶，37°C反应1小时的情况下，添加200mU时，出现130KDa条带。由此显示，纤溶酶和凝血酶对VWF分解酶 剪切的部位相同，但在剪切时间上，两者存在差异。《实施例3=VffF分解酶和弹性蛋白酶之间的相关性》本实施例中，以来自正常健康人、DIC患者和SIRS患者的血浆为待检样本，测定 VffF分解酶抗原量和弹性蛋白酶量。VWF分解酶抗原量，用市售试剂盒(VWF分解酶ELISA kit，三菱化学~卜口 >)测定。此外，用市售试剂盒(PMN弹性蛋白酶/α I-PI复合物ELISA 试剂盒，CALBI0CHEM公司)，测定弹性蛋白酶/ α 1-抗胰蛋白酶量来表示弹性蛋白酶量。结果示于图3和图4。图3中，X轴是弹性蛋白酶/ α 1-抗胰蛋白酶量(单位ng/ mL)，Y轴是VWF分解酶抗原量(单位%)。此外，图4中，“N. S.”表示没有显著性差异。弹性蛋白酶/α 1-抗胰蛋白酶和VWF分解酶抗原量之间显示了良好的负相关(y =-0. 1382X+74. 643 ；R2 = 0. 1549)，这表明，在弹性蛋白酶/ α 1-抗胰蛋白酶高值，即组 织破坏继续发展之类的MOF状态下，由于VWF分解酶抗原被弹性蛋白酶分解，因而，VffF 分解酶抗原量降低。此外，弹性蛋白酶高于等于lOOng/mL的患者，VWF分解酶抗原量为 46. 4士23. 2% (Mean士SD)，而弹性蛋白酶低于等于50ng/mL的患者，为71.7士29.0%，VffF 分解酶抗原量显著降低(P < 0. 05)。产业上的可利用性基于本发明得到的信息提示，TNF-α等细胞因子激活嗜中性粒细胞，引发血液凝 固反应过度进行，在嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G等蛋白酶作用下，血管内皮细 胞受损，此时，为修复损伤组织而释放到血中的弹性蛋白酶，将VWF分解酶积极分解，从而 促进血小板血栓形成。另一方面，血液发生过度凝固反应，纤维蛋白从血小板血栓上析出， 纤溶酶类开始发挥作用，该作用晚于比弹性蛋白酶的作用，纤溶酶将VWF分解酶分解，引起 纤维蛋白和血小板构成的微血栓在微血管中形成，引发DIC、SIRS发病。该信息提示，血小 板血栓和纤维蛋白血栓的形成始于丝氨酸蛋白酶对VWF分解酶的调控参与。世界上还有大 量血栓症不能仅用纤维蛋白血栓分解物解释。本发明可能有助于解释上述这样的血栓症的 机制。本发明可适用于检测受试者(例如，DIC或SIRS患者)的血小板血栓或脏器损伤。多数DIC，常常合并恶性病变或严重病变等预后不良病情，不乏病情进一步恶化的 情况。因此，在DIC治疗时，DIC是继发于各种基础病变，引发凝固体系活化或凝固调控因 子降低，微血栓在全身微血管大量发生，引起血管内闭塞，另一方面，由该血栓形成使血小 板和凝固纤溶因子被消耗，并发消耗性止血障碍，出现严重出血倾向、脏器损伤。因此，在早 期阻止微血栓形成并进行早期治疗是非常重要的。早期预测诊断SIRS的意义如下所述。发展至多脏器损伤的病例的救活率很低，即 使进行高度集中治疗，改善效果也微乎其微，病例并没有减少。因此，早期捕捉到向脏器损 伤转移的警告信号，防止其向脏器功能衰竭发展，至为重要。即，正确判断SIRS阶段患者病 情、严重程度，商讨对策，是必要的。以上，依照特定实施方式，对本发明进行了说明，本领域技术人员公知的变形或改 良，也包含在本发明范围内。
权利要求
1.抗弹性蛋白酶抗体或其片段在制备用于预测弥散性血管内凝血症患者或全身性炎 症反应综合征患者的体液试样中血管性血友病因子分解酶的量或酶活性的试剂盒中的用 途。
2.根据权利要求1所述用途，其中，所述的试剂盒进一步包含与血管性血友病因子分 解酶特异结合的抗体或其片段。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述的试剂盒是根据预测的血管性血友病因 子分解酶的量或酶活性进一步检测血小板血栓症或脏器损伤的试剂盒。
4.与血管性血友病因子分解酶特异结合的抗体或其片段在制备用于预测弥散性血管 内凝血症患者或全身性炎症反应综合征患者的体液试样中弹性蛋白酶的量的试剂盒中的 用途。
5.根据权利要求4所述用途，其中，所述的试剂盒进一步包含抗弹性蛋白酶的抗体或 其片段。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其中，所述的试剂盒是根据预测的抗弹性蛋白酶的 量进一步检测血小板血栓或脏器损伤的试剂盒。
7.试剂盒，其包含抗弹性蛋白酶抗体或其片段，所述试剂盒是用于预测弥散性血管内 凝血症患者或全身性炎症反应综合征患者的体液试样中血管性血友病因子分解酶的量或 酶活性的试剂盒。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其中，还含有与血管性血友病因子分解酶的分解因子 特异性结合的抗体或其片段。
9.试剂盒，其包含与血管性血友病因子分解酶特异性结合的抗体或其片段，所述试剂 盒是用于预测弥散性血管内凝血症患者或全身性炎症反应综合征患者的体液试样中弹性 蛋白酶的量的试剂盒。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其中，还含有抗弹性蛋白酶的的抗体或其片段。
11.试剂盒，其包含(1)与血管性血友病因子分解酶特异性结合的抗体或其片段，以及(2)抗弹性蛋白酶抗体或其片段。
全文摘要
本发明公开了分析血管性血友病因子VWF分解酶和/或其分解因子，检测弥散性血管内凝血(DIC)或全身性炎症反应综合征(SIRS)患者的血小板血栓或脏器损伤的方法。公开了弥散性血管内凝血或全身性炎症反应综合征患者的血小板血栓或脏器损伤的检测用试剂盒，其含有与血管性血友病因子VWF分解酶特异性结合的抗体或其片段，和/或与血管性血友病因子VWF分解酶的分解因子特异性结合的抗体或其片段。
文档编号G01N33/573GK102121939SQ201010550130
公开日2011年7月13日 申请日期2005年11月8日 优先权日2004年11月8日
发明者小野智子 申请人:三菱化学美迪恩斯株式会社