一种水飞蓟宾的检测方法

文档序号:5881643阅读:849来源:国知局
专利名称:一种水飞蓟宾的检测方法
技术领域
本发明涉及一种药物检测方法,特别涉及一种治疗肝病的药物水飞蓟宾的检测方法。
背景技术
水飞蓟宾是菊科植物水飞蓟中提取分离得到的黄酮类化合物,具有保肝、护肝等功效。近年来药效学研究表明,水飞蓟宾还具有较强的抗炎,抗肿瘤活性。定天明等采用胶束电泳毛细管色谱法对水飞蓟宾的非对映体(水飞蓟宾A和水飞蓟宾B)进行了分离,从而证明了水飞蓟宾为两个非对映体的混合物,其化学结构见图1。目前,已有多篇文献报道了水飞蓟宾在动物和人体内的定量分析研究,但有关水飞蓟宾A和水飞蓟宾B各自的药动学研究报道极少。Rickling等采用高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)测定人血浆中水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的浓度,但该方法的灵敏度低,且样品预处理较为繁琐,不能满足药动学研究需要。本实验建立了一种简单、快速、灵敏的LC-MS/MS方法,同时测定大鼠血浆中水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度,并成功用于水飞蓟宾A和水飞蓟宾B各自的药动学及生物利用度研究。

发明内容
本发明建立一种简单、快速、灵敏的液-质联用法(LC-MS/MS),该方法用于测定血浆中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B浓度。本发明的方法,包括以下步骤步骤1、含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆经沉淀蛋白预处理;步骤2、将经过预处理的血浆,经液-质联用仪,测定其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B 浓度。优选的本发明的方法如下0. ImL血浆样品经沉淀蛋白预处理后,以甲醇-0. 1% 甲酸 08 52,ν/ν)为流动相,采Eclipse XDB-C18 色谱柱(150X2. 1 匪,5 μ m) 分离,以ESI源负离子模式、选择反应监测(SRM)方式进行定量分析。本发明的检测方法,其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B在血浆中的线性范围为 2.0-500001^.111171,最低定量限(LLOQ)为Z.Ong.mr1。药物的日内、日间精密度在9. 1 % 以内,准确度(相对误差)小于士5.7%。


图1水飞蓟宾A (a)和水飞蓟宾B (b)的化学结构图2水飞蓟宾A(a)、水飞蓟宾B(b)和柚皮苷(c)的质谱3血浆样品色谱4水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在大鼠体内的平均药-时曲线
a-水飞蓟宾A,静脉注射13. 3mg/kg;b-水飞蓟宾A,灌胃给药13. 3,26.6 and 53. 2mg/kg ;C-水飞蓟宾B,静脉注射14. 7mg/kg;d-水飞蓟宾B,灌胃给药14. 7,29. 4 and 58. 8mg/kg.
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步叙述,以使公众对发明内容有更深入的了解,并非对本发明的限制,凡依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换, 均属于本发明的保护范围。实施例11材料与方法1. 1药品与试剂水飞蓟宾A和水飞蓟宾B标准品(天津天士力集团研究院自制,纯度>98. 5%); 内标柚皮苷(中国药品生物制品检定所,纯度> 99.0%,批号110722-200610);水飞蓟宾胶囊(天津天士力制药股份有限公司,规格35mg水飞蓟宾/粒,批号090509);乙腈为色谱纯(美国Fisher公司);其余试剂均为分析纯。1. 2 仪器Finnigan TSQ Quantum三重四极杆液-质联用仪(美国Finigan公司);XW-80A 微型漩涡混合仪(上海卢西分析仪器厂有限公司);TG 16W微量高速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)。1. 3色谱条件色谱柱ZorbaxEclipse XDB-C18 柱(150X 2. 1mm,5 μ m),美国 Agilent 公司;流动相甲醇-0. 甲酸(48 52,ν/ν);流速0. 25mL · min—1 ;柱温:30°C ;进样量=IOyL01. 4质谱条件离子源为电喷雾离子源,负离子方式检测;喷雾电压3800v ;毛细管温度390°C ;鞘气(N2)压力25Psi ;辅助气(N2)压力3psi ;碰撞气(Ar)压力为1. 4mTorr ;扫描方式为选择性反应监测(SRM);碰撞能量(CE)分别为20eV(水飞蓟宾A和水飞蓟宾B)和34eV(柚皮苷),用于定量分析的离子反应分别为m/z481. 1 — m/z 300. 9 (水飞蓟宾A和水飞蓟宾 B)和m/z 579.2 —m/z 271.1(柚皮苷)。水飞蓟宾Α、水飞蓟宾B和内标柚皮苷的二级全扫描质谱图见图2。1. 5实验动物与实验方案1. 5. 1实验动物Wistar大鼠,雄性,体重Q20 士 20) g(北京维通利华实验动物中心)。1. 5. 2静注、灌胃用水飞蓟宾溶液的配置精密称取水飞蓟宾140mg,溶于25mL聚乙二醇200 乙醇二纯水(5:2: 3,v/v/v)混合溶液中,即得水飞蓟宾静注溶液;分别取4,8和16粒水飞蓟宾胶囊,去壳,混悬于70mL 二纯水中,配置成水飞蓟宾低、中、高3个剂量的灌胃液。上述给药溶液均需现用现配。1.5.3给药及血样采集5只大鼠按^mg ^kg4静脉注射给予水飞蓟宾静注溶液(相当于水飞蓟宾A13. 3mg · kg—1,水飞蓟宾B14. 7mg · kg—1) ;15只大鼠分别按沘,56和lUmg^g—1灌胃给予低、中、高3个剂浓度的水飞蓟宾混悬液(相当于水飞蓟宾A13. 3,26. 6 和 53. 2mg · kg、水飞蓟宾 B14. 7,29. 4 和 58. 8mg · kg-1)。大鼠给药后 0,0. 17,0. 33,0. 67, 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12. Oh,经大鼠眼球后静脉丛采集静脉血约0. 3mL,置肝素化试管中,3500r · miiT1离心lOmin,分离血浆,置_20°C冰箱中冷冻保存待测。1. 6血浆样品预处理取血浆样品100 μ L置于1. 5mL Eppendorf管中,依次加入乙腈100 μ L,内标溶液 (200ng · mL-1柚皮苷溶液,乙腈配置)100 μ L,旋涡Imin,然后于12000r · mirT1离心8min, 取上清液 ο μ L进行LC-MS/MS分析。2 结果2. 1专属性考察由图3可见,在“1. 3”所述条件下,水飞蓟宾Α、水飞蓟宾B和内标的保留时间分别为6. 45,7. 35和2. 55min,且血浆中的内源性物质不干扰待测物与内标的测定。2. 2线性范围及灵敏度取大鼠空白血浆,加入水飞蓟宾A、水飞蓟宾B标准溶液,配制成含水飞蓟宾A和水飞蓟宾 B2,5,20,50,500,2000,20000 和 50000ng · ml/1 的血浆样品,按 “ 1. 6 ” 项操作, 记录色谱图;以血浆样品中待测物的浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权(W = 1/X2)最小二乘法进行回归运算,求得水飞蓟宾A的回归方程为Y = 0. 00125Χ+0. 00063 (r = 0. 9981),水飞蓟宾 B 的回归方程为Y = 0. 00122Χ+0. 00096 (r =0. 9959),本法水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的线性范围均为2 50000ng · mL"1, LLOQ为 2ng · mL-1 (S/N > 10)。2. 3精密度与准确度取大鼠空白血浆若干份,分别加入水飞蓟宾A和水飞蓟宾B标准溶液,配置成水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度为20,500,20000ng -πιΓ1的血浆样品,按“1. 6”项操作,每个浓度进行6样本分析,连续测定3天,计算精密度(日内、日间RSD)与(RE)结果见表1。2.4提取回收率取空白血浆100 μ L,制备水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度为20,500,20000ng · mL-1 的血浆样品,按“1. 6”项操作,每个浓度进行3样本分析,记录色谱峰。同时,另取纯水 IOOy L代替空白血浆,同法操作,获得相应峰面积,以二者色谱图的峰面积之比考察样品的提取回收率。结果表明,在上述3个浓度下水飞蓟宾A的提取回收率分别为95. 2士2. 2%, 93. 2士 1. 7%和95. 4士4. 5%,水飞蓟宾B的提取回收率分别为94. 3士5. 1%,94. 7士4. 1% 禾口 96. 1 士 1. 9%,内标的提取回收率为93. 8士5. 4%。2. 5稳定性考察本实验分别考察了血浆样品-20°C冻存2个月,冻-融3个循环及血浆样品处理后室温放置Mh的稳定性。结果表明,水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在上述3个条件下稳定性良好。2. 6药动学及生物利用度研究水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在大鼠体内的药-时曲线图见图4,Topfit 2.0软件用于计算其主要药动学参数,见表2和表3。经统计分析,水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的主要药动学参数Cmax,AUCchJP AUCchoo与给药剂量呈线性关系。由公式F = (AUCi. g./AUCi. J X 100%,计算得到水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的绝对生物利用度分别为2. 86%和1. 93%。本实验对正离子和负离子两种电离模式进行了比较,结果显示负离子模式下水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的响应值远高于正离子模式,故选负离子模式检测。水飞蓟宾和内标的分子离子峰[Μ-ΗΓ分别为m/z 481. 1和579. 2,由图2可见,水飞蓟宾和内标分别在m/z 300. 9和271. 1的子离子峰强度最大,故分别选择m/z 481. 1 — m/z 300. 9和m/z 579. 2 -m/z 271. 1检测水飞蓟宾和内标。尽管水飞蓟宾A和水飞蓟宾B定量分析的离子反应均为为m/z 481. 1-m/z 300. 9,但本实验通过比较所选定的色谱条件保证水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B具有良好的分离度,从而确保了方法具有良好的专属性。本实验建立了一种简单、快速、灵敏的LC-MS/MS方法,同时测定大鼠血浆中水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度,并首次报道了水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在动物体内的药动学及生物利用度研究数据,为水飞蓟宾及其制剂的深入研究奠定基础。以下为附表表1精密度与准确度实验结果Tab. 1 Precision and accuracy of the method
权利要求
1.一种水飞蓟宾的检测方法,包括以下步骤步骤1、采集含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆,经沉淀蛋白预处理;步骤2、将经过预处理的血浆,经液-质联用色谱仪,测定血浆中水飞蓟宾A与水飞蓟宾 B浓度。
2.权利要求1的检测方法,其特征在于,所述色谱条件为色谱柱=ZortaxEclipse XDB-C18柱体积为150 X 2. Imm,粒径为5 μ m,美国Agilent公司;流动相甲醇-0. 1 %甲酸为 48 52 ;流速0. 25mL · mirT1 ;柱温:30°C ;进样量10μ L。
3.权利要求1的检测方法,其特征在于,其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B在血浆中浓度的线性范围为2. 0-50000ng · mL—1,最低定量限为2. Ong · mL—1,药物的日内、日间精密度在 9. 以内,相对误差小于士5. 7%。
4.权利要求1的检测方法,其特征在于,所述预处理包括取血浆样品100μ L置于 1. 5mLEppendorf管中,依次加入乙腈100 μ L,内标溶液为200ng · mL—1柚皮苷溶液,乙腈配置,用量100 μ L,旋涡lmin,然后于12000r · mirT1离心8min,取上清液10 μ L进行LC-MS/ MS测定。
5.权利要求1的检测方法,其特征在于,所述血浆来源于动物,是动物经过服用水飞蓟宾A和水飞蓟宾B药物后经过取血后处理得到的。
6.权利要求5的检测方法,其特征在于,所述服用包括静注和口服。
7.权利要求5的检测方法,其特征在于,所述水飞蓟宾A和水飞蓟宾B药物用以下方法得到称取水飞蓟宾140mg,溶于25mL聚乙二醇200 乙醇二纯水为5 2 3混合溶液中,即得水飞蓟宾静注溶液;取水飞蓟宾胶囊,去壳,混悬于70mL 二纯水中,配置成水飞蓟宾的口服液。
8.权利要求1的检测方法,其特征在于,所述液-质联用色谱仪器为FirmiganTSQ Quantum三重四极杆液-质联用仪。
9.权利要求1的检测方法,其特征在于,所述质谱条件为离子源为电喷雾离子源, 负离子方式检测;喷雾电压3800v ;毛细管温度390°C ;鞘气队压力25Psi ;辅助气队压力 3psi ;碰撞气Ar压力为1. 4mTorr ;扫描方式为选择性反应监测SRM ;碰撞能量CE分别为水飞蓟宾A和水飞蓟宾B20eV、柚皮苷34eV,用于定量分析的离子反应分别为水飞蓟宾A和水飞蓟宾 B m/z481. 1 — m/z 300. 9、柚皮苷 m/z 579. 2 — m/z 271.1。
10.权利要求1的检测方法,其特征在于,所述采集血浆方法如下静脉注射给予水飞蓟宾静注溶液,灌胃给予水飞蓟宾混悬液,给药后经静脉采集静脉血,置肝素化试管中,离心,分离血浆待测。
全文摘要
本发明属于医药领域,具体涉及一种水飞蓟宾的检测方法,本发明的方法,包括以下步骤步骤1、含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆经沉淀蛋白预处理;步骤2、将经过预处理的血浆,经液-质联用仪,测定其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B浓度。
文档编号G01N30/02GK102478553SQ201010556030
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者万梅绪, 周水平, 李伟, 栗志文, 褚扬, 郭嘉华, 马晓慧 申请人:天津天士力制药股份有限公司
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