专利名称：一种猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒及其应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征病毒(reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是猪的主要传染病之一，以母猪妊娠后期发生流产、死胎和产木乃伊胎、新生仔猪死 亡，小猪及育肥猪实质性肺炎为特征的疾病。PRRSV主要在单核巨噬细胞和淋巴系统内复 制，破坏这些细胞的机能并最终破坏感染猪只的免疫力。结果将导致对其他病毒的抵抗力 下降及多种病原微生物如多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪副嗜血杆菌和沙门氏菌等混合感 染，造成大批猪只死亡。2006年下半年以来，由PRRSV变异株引起的“高热病”在我国爆发 并持续流行，除极少数隔离条件好且管理水平高的猪场外，几乎100%的猪场受到冲击，据 估计有超过4000万头的猪场在这场疫病暴发中死亡，而一些中型和小型的养猪场则因此 被迫关闭，给养猪业造成了巨大的经济损失。就目前人类拥有的技术来看，疫苗是对付病毒的最佳选择，虽然现在国内外已生 产出多种猪繁殖与呼吸综合征疫苗在市场上使用，但目前该病的防治工作仍面临很大的困 难。其中主要的问题是没有准确区别感染与免疫、确定保护性免疫力的方法和标准，这造成 疫苗评价和使用方面的混乱，也妨碍了高效疫苗的研制工作。自20世纪80年代发现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以来，许多专家、学者对 该病进行了多方面的研究，其中包括该病毒的免疫机理，研究发现在不同的状态下，PRRSV 感染机体后产生的抗体类型和保护力是不一致的，这给传统免疫学提出挑战，给有效免疫 预防设置了障碍，其结果是到目前为止人类没能对PRRSV的疫苗保护作用进行有效的评 价。具体难题有如下几点
(1)利用现有的检测方法对自然感染或传统疫苗免疫后的动物体进行抗体检测，检测 的抗体存在无保护作用甚至有害的现象。已经知道，PRRSV可诱导产生抗体的抗原表位位于基质(M)、糖蛋白GP3和GP5蛋 白、核(N)蛋白，其中基质(M)、糖蛋白GP3和GP5蛋白可诱导产生中和抗体，核(N)蛋白和 GP5蛋白可诱导ADE抗体，中和抗体参与清除病毒过程，产生免疫保护作用，而ADE抗体能使 PRRSV的感染和复制增强(抗体介导的增强作用，ADE)。现有的检测方法只能检测出动物体 内PRRSV诱导的所有抗体，而不能区别其抗原表位特异性，因此虽然有时检测到很高的抗 体滴度，但中和抗体的水平很低，仍然起不了保护作用。(2)中和抗体与免疫力间的关系有待进一步明确
Osorio研究小组用来自PRRSV康复高免猪血清的免疫球蛋白注射妊娠母猪，产生极好 的免疫保护，免疫猪均未发生繁殖障碍。进一步研究证明，该免疫球蛋白有效成分主要是中 和抗体，从而明确了中和抗体与保护性免疫的相关性。Lopez OJ等人近来报导，给妊娠母猪输入中和抗体可保护其不发生繁殖障碍，并 在母猪和其后代产生永久性免疫力。但为了得到完全保护，需要输入高滴度PRRSV中和抗体(1:32)，但即使如此，只有50%得到保护。另外，在血液中存在滴度1:8的中和抗体足以 阻止PRRSV病毒血症，但不能阻止其向周围组织接种及向与之接触的猪传播病毒。母猪血 液中较低水平的NA可表明它产生了对PRRSV的永久保护力，而断奶小猪产生完全保护时 需要的NA量明显高。由此可以看出，NA滴度在一定程度上有助于判定疫苗的保护作用。从临床实验感染动物体内的免疫特征来看，在接种后14-120天可检测到血清中 和抗体(Batista L, et al. 2004)。这些结果提示中和抗体参与清除病毒过程，但早期中 和抗体出现时间差异较大。目前还不完全清楚中和抗体在PRRSV疫苗功效中的地位，Diaz I等(2006)用两 个不同株PRRSV疫苗免疫小猪，到42天时未发检测到中和抗体。Nilubol D等(2004)报导 PRRSV灭活疫苗激发已感染动物产生中和抗体。同样Bassaganya-Riera J等(2004)人也 发现，灭活疫苗可刺激曾免疫动物产生中和抗体。研究并掌握疫苗功效与中和抗体的规律， 对研制高效疫苗、正确使用疫苗、缩短决策周期均有重要意义。我国2007年在PRRSV疫苗 突击生产时，因缺乏关键的标志性检验技术而导致生产周期延长这一事实就充分说明了这
——占
；^ ο(3)现有检验方法不能满足防控需要
目前国内外筛查PRRSV感染的主要方法是用RT-PCR检测病毒核酸，用免疫过氧化 物酶单层试验(IPMA)、间接荧光抗体试验(IFA)、血清中和试验(SN)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)等血清学方法检测特异性抗体。值得指出的是，由于SN法的灵敏度较低、操作复 杂，目前无法在兽医临床实践中广泛使用。受病毒在感染动物体内的动态变化规律影响， RT-PCR仅适用于感染早期。Horter等对ELISA、RT-PCR和病毒分离进行的比较表明，接种 后63 105天期间，ELISA敏感性和特异性最高，均为98%，RT-PCR特异性为100% (口咽拭子 和扁桃体样品)敏感性为81%和66%，病毒分离敏感性为47%和27%。Torremorell等发现 ELISA试验存在一定的假阳性，IDEXX ELISA假阳性率为0. 89%，且成年猪出现假阳性几率 高于小猪。由于对PRRSV的免疫机理尚缺乏完全的了解，因此在PRRSV免疫学方面的研究 及建立完善的免疫评估方法和标准仍然是最重要的研究方向。现有的检测试剂存在一定缺陷，不能区分野毒感染产生的抗体和疫苗免疫产生 的抗体，也不能区分疫苗免疫后产生的抗体是保护性抗体还是非保护性抗体，因此检测的 数据不能真正判断出猪群是否对PRRSV具有保护力，对疫苗的免疫效果不能作出正确的评 估，这是制约现有检测试剂广泛使用的最重要原因。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒及其应 用。该试剂盒操作简便，稳定性和重复性好，具有良好的可靠性。本发明的猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒，其组成包括
1)96孔PRRSV N蛋白包被的酶标板
2)洗涤液
3)兔抗猪酶标抗体
4)显色液
5)终止液6)阳性对照
7)阴性对照。其中所述96孔PRRSV N蛋白包被的酶标板包括一对引物，上游引物PNl 5，-CGGATCCATGCCAAATAACAACG-3，，下游引物 PN2 5，-GCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT-3，，酶 标板的制备为利用所述引物进行基因扩增，形成一长度为372bp的核酸片段，将此扩增产 物连接至一表达载体上进行原核细胞表达，然后将表达的N蛋白进行纯化，抗原量达到5 μ g/mL时即可包被于酶标板上。所述试剂盒中的试剂配制如下
(1)洗涤液
含0. 05%Tween-80的PBS缓冲溶液，使用时进行10倍稀释；所述PBS缓冲溶液浓度为 0. lmol/L, pH=7.2 ；
(2)兔抗猪酶标抗体
辛酸-SAS沉淀法提纯猪血清IgG后，用DEAE-52纤维素层析、S印hadeX-G200分子 筛层析进一步提纯IgG，按常规方法免疫家兔，制备兔抗猪IgG抗血清，然后经过辛酸-50% SAS-35% SAS盐析以及过DEAE-52纤维素层析柱提纯兔抗猪IgG，最后用辣根过氧化物酶标 记得到兔抗猪酶标抗体；
(3)显色液底物A :TMB200mg, DMSOlOOml，加双蒸水至 IOOOml 底物 B 0. Imol/ 1柠檬酸-0. 2磷酸氢二钠缓冲液 PH5. (Γ5. 4 磷酸氢二钠14. 6g 柠檬酸9.33g 加双蒸水至1000ml调pH值；使用时按底物A 底物B=I :1 混合后加过氧化氢至终浓度为0. 75% ；
(4)终止液=IMHCl。利用上述的猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 的方法，具体步骤如下
(1)分别取阳性对照及阴性对照加入酶标板孔内，50ul/孔，各加两个孔；
(2)加样待测样品孔中每孔各加入待测血清样品50ul;(3)将酶标板置于37 °CX60 min或2-8°C冰箱中过夜孵育；(4)吸出酶标板孔中的液体并弃去；
(5)用250 350ul的洗涤液洗涤每个孔5次，每次洗涤后，甩去孔中液体，最后一次甩 掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余液体；(6)每孔加入兔抗猪酶标抗体IOOul ； (7) 将酶标板置于37 V 30 min ； (8)重复步骤4和5; (9)每孔中加入显色液lOOul，置于室 温暗处反应5 10 min ； (10)每孔中加入IOOul终止液终止反应。(11)用酶标仪在450nm 处测吸光值。其中阳性对照和阴性对照可根据现有技术中的常规方法制备。本发明的试剂盒可用于对PRRSV感染与保护性免疫的鉴别诊断。(1)确定对不同PRRSV感染/免疫状态的标志性抗原表位(群)
不同PRRSV状态下，猪体内抗体变化较大，但对这些抗体的特异性研究较少。为掌握这 些抗体的特异性谱，拟建立高灵敏的免疫分析方法，对动物在不同PRRSV状态下M、GP3和 GP5单抗原表位的免疫反应性逐个分析，可得出具有标志性的抗原的信息。(2)建立相应的灵敏检测方法
现有免疫分析方法的灵敏度不足，不能监测到感染或免疫早期特定免疫反应的变化，因而无法直接用于需要快速评价免疫效果的情况(如新疫苗评价、新药评价等)。根据目前 检测技术的发展和实践应用的结果，建立基于不同原理的酶免疫检测技术，以排除血清学 的干扰，找出真正反映免疫力水平的指标和方法。
( 3 )商品化试剂的试制
根据已建立的检测方法进行商品化试剂的试制，并进行符合性试验。本发明采用基因工程方法，构建病毒特定中和表位多肽片段和酶免疫技术制成， 能有效区分各类抗体，并建立评判免疫保护作用的的技术标准，对猪繁殖与呼吸综合征的 防控具有非常重要的意义，应用市场广阔。本发明试剂盒便于操作、使用成本低、重复性好， 适合大规模推广应用。
具体实施例方式1、本发明的试剂盒的组成包括
1)96孔PRRSV N蛋白包被的酶标板
2)洗涤液
3)兔抗猪酶标抗体
4)显色液
5)终止液
6)阳性对照
7)阴性对照。2、所述试剂盒中的试剂配制如下
(1)洗涤液
含0. 05%Tween-80的PBS缓冲溶液，使用时进行10倍稀释；所述PBS缓冲溶液浓度为 0. lmol/L, pH=7.2 ；
(2)兔抗猪酶标抗体
辛酸-SAS沉淀法提纯猪血清IgG后，用DEAE-52纤维素层析、kphadex-G200分子 筛层析进一步提纯IgG，按常规方法免疫家兔，制备兔抗猪IgG抗血清，然后经过辛酸-50% SAS-35% SAS盐析以及过DEAE-52纤维素层析柱提纯兔抗猪IgG，最后用辣根过氧化物酶标 记得到兔抗猪酶标抗体；
(3)显色液底物A :TMB200mg, DMSOlOOml，加双蒸水至 IOOOml 底物 B 0. Imol/ 1柠檬酸-0. 2磷酸氢二钠缓冲液 PH5. (Γ5. 4 磷酸氢二钠14. 6g 柠檬酸9.33g 加双蒸水至1000ml调pH值；使用时按底物A 底物B=I :1 混合后加过氧化氢至终浓度为0. 75% ；
(4)终止液=IMHCl ；
(5)N蛋白利用引物(上游引物 Pm :5，-CGGATCCATGCCAAATAACAACG-3，，下游引物 PN2 5，-GCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT-3，)进行基因扩增，94°C预变性 3min，94°C变形 50s，56°C退 火40s，72°C延伸lmin，30CyCles，形成一长度为37^p的核酸片段，将此扩增产物连接至 一表达载体(pET-32a)上进行原核细胞表达，然后将表达的N蛋白进行纯化，抗原量达到5 μ g/mL时即可用于包被酶标板上。(6)阳性对照为PRRSV弱毒疫苗免疫健康猪，21日后采血所分离到的血清，抗体效价可达到1:256。(7)阴性对照为采集健康猪血所分离到的血清。3、利用所述的猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病 毒的方法，具体步骤如下
(1)分别取阳性对照及阴性对照加入酶标板孔内，50ul/孔，各加两个孔；
(2)加样待测样品孔中每孔各加入待测血清样品50ul;(3)将酶标板置于37 0C X60 min或2-8°C冰箱中过夜孵育；(4)吸出酶标板孔中的液体并弃去；
(5)用250 350ul的洗涤液洗涤每个孔5次，每次洗涤后，甩去孔中液体，最后一次甩 掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余液体；(6)每孔加入兔抗猪酶标抗体IOOul ； (7) 将酶标板置于37 V 30 min ； (8)重复步骤4和5; (9)每孔中加入显色液lOOul，置于室 温暗处反应5 10 min ； (10)每孔中加入IOOul终止液终止反应。(11)用酶标仪在450nm 处测吸光值。4、结果
当阳性对照OD值平均值(ODp)与阴性对照OD值平均值(ODn)之差大于或等于0. 150， ODn小于或等于0. 250时检测结果成立。PRRSV抗体是否存在由S/P值决定。S/P= (0D样一ODn)/ (0DP—ODn) 5、结果判定
1)当S/P大于或等于0. 3时的被检样品判为PRRSV抗体阳性。2) S/P大于或等于0. 2，但小于0. 3被检样品判为PRRSV抗体可疑。3) S/P小于0. 2的被检样品判为PRRSV抗体阴性。6、结果分析
通过临床采集80份血清样本，与RT-PCR结果相比，该方法的特异性为89%，敏感性为
90%。实施例1
取两头猪，1只确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪 采血，采用如具体实施方式
所述制备的试剂盒对样本进行检测。结果表明，感染病毒猪的S/ =0.4，健康猪的5/卩=0. 15。
权利要求
1.一种猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒组成包括96孔PRRSV N蛋白包被的酶标板洗涤液兔抗猪酶标抗体显色液终止液阳性对照7)阴性对照。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒，其特征 在于所述96孔PRRSV N蛋白包被的酶标板包括一对引物，上游引物Pm 5，-CGGATCCATGCCAAATAACAACG-3，，下游引物 PN2 5，-GCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT-3，，酶 标板的制备为利用所述引物进行基因扩增，形成一长度为372bp的核酸片段，将此扩增产 物连接至一表达载体上进行原核细胞表达，然后将表达的N蛋白进行纯化，抗原量达到5 μ g/mL时即可包被于酶标板上。
3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒，其特征在于试剂盒 中的试剂配制如下(1)洗涤液含0. 05%Tween-80的PBS缓冲溶液，使用时进行10倍稀释；所述PBS缓冲溶液浓度为 0. lmol/L, pH=7. 2 ；(2)兔抗猪酶标抗体辛酸-SAS沉淀法提纯猪血清IgG后，用DEAE-52纤维素层析、kphadex-G200分子 筛层析进一步提纯IgG，按常规方法免疫家兔，制备兔抗猪IgG抗血清，然后经过辛酸-50% SAS-35% SAS盐析以及过DEAE-52纤维素层析柱提纯兔抗猪IgG，最后用辣根过氧化物酶标 记得到兔抗猪酶标抗体；(3)显色液底物A :TMB200mg, DMSOlOOml，加双蒸水至 IOOOml 底物 B 0. Imol/ 1柠檬酸-0.2磷酸氢二钠缓冲液 ΡΗ5.(Γ5.4:磷酸氢二钠14. 6g 柠檬酸9.33g 加双蒸水至1000ml调pH值；使用时按底物A 底物B=I :1 混合后加过氧化氢至终浓度为0. 75% ；(4)终止液=IMHCl。
4.一种利用权利要求1、2或3所述的猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒检测猪繁殖 与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述方法具体步骤如下(1)分别取阳性对照及阴性对照加入酶标板孔内，50ul/孔，各加两个孔；(2)加样待测样品孔中每孔各加入待测血清样品50ul；(3)将酶标板置于37V X60 min或2-8°C冰箱中过夜孵育；(4)吸出酶标板孔中的液体并弃去；(5)用250 350ul的洗涤液洗涤每个孔5次，每次洗涤后，甩去孔中液体，最后一次甩 掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余液体；(6)每孔加入兔抗猪酶标抗体IOOul；(7)将酶标板置于37V 30 min ；(8)重复步骤4和5 ；(9)每孔中加入显色液lOOul，置于室温暗处反应5 10 min ；(10)每孔中加入IOOul终止液终止反应；(11)用酶标仪在450nm处测吸光值。
全文摘要
本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征免疫检测试剂盒及其应用。试剂盒中包括96孔PRRSV N蛋白包被的酶标板、洗涤液、兔抗猪酶标抗体、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照。本发明采用基因工程方法，构建病毒特定中和表位多肽片段和酶免疫技术制成，能有效区分各类抗体，并建立评判免疫保护作用的技术标准，对猪繁殖与呼吸综合征的防控具有非常重要的意义，应用市场广阔。本发明试剂盒便于操作、使用成本低、重复性好，适合大规模推广应用。
文档编号G01N33/569GK102062775SQ20101058115
公开日2011年5月18日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者吴润生, 陈先进 申请人:福州大北农生物技术有限公司