专利名称：检测体液中极长链脂肪酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测体液中极长链脂肪酸含量的方法。
背景技术：
过氧化物酶体病(PDs)是以细胞内过氧化物酶体损伤、减少或完全缺失为特征的先天性遗传性疾病。在各种类型PDs中，常见的是ALD，表现为进行性的精神运动障碍，视力及听力下降和/或肾上腺皮质功能低下。该病主要由于过氧化物酶体中极长链脂酰辅酶 A合成酶缺陷，导致极长链脂肪酸(C22:ci、C24:ci、C26:ci的直链饱和脂肪酸)(VLCFAs)的β氧化障碍，从而表现为VLCFAs在血浆和组织中累积，引起神经系统中脑白质脱髓鞘改变和肾上腺皮质功能低下。因此，对于ALD患者的诊断，除了临床症状、病理学特征和影像学检查外， 还可以检测血清、血浆和培养的皮肤成纤维细胞中VLCFAs的含量。目前的临床检验中，对于血清或血浆等生物样本的检测主要依据生化原理，如抗原、抗体反应，酶联免疫法和荧光免疫法等，而色谱法应用十分有限，仅在治疗药物监测中使用。随着色谱技术的不断发展，其在临床检验方面的应用也逐渐增多。色谱法中常用的分析方法包括GC，HPLC及色谱质谱联用技术(GC-MS，LC-MS, LC-MS/MS)。这些方法的灵敏度、特异性和准确性都能够满足临床检测的需要，其中，GC法适用于分析生物样品中蒸气压高、沸点低、热稳定性好、分子量较小的成分；HPLC法常需要待测物具有紫外或荧光吸收， 具有一定的局限性。液相-质谱联用技术是以液相色谱作为分离手段，质谱做为检测手段的新技术，它涵盖了液相色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度、高选择性、适用范围广等优点，能够获得稳定的定性定量信息，可用于大多数化合物的分析和检测。近几年来，MS/MS、 LC/MS和LC-MS/MS等技术不断发展和完善，其在临床检验领域得到了广泛应用，特别在是生物样本中微量成分的定量分析方面发挥了巨大的作用。由于血清样本具有成分复杂，干扰杂质多，取样量少，待测物质含量低等特点，给临床检测带来很大困难。上个世纪八十年代，Moser夫妇发现ALD患者血清中VLCFAs浓度异常增高，首次建立了检测VLCFAs的色谱学方法，即用盐酸-甲醇将VLCFAs甲酯化后用气相色谱法检测，为ALD疾病的诊断提供了可靠的依据。在国内，北京友谊医院首先采用GC方法检测血清中VLCFAs含量，作为诊断ALD疾病的辅助手段。Antolin EM评估了五种不同的前处理方法，包括用盐酸-甲醇，重氮甲烷，三氟化硼-甲醇，硫酸-甲醇和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺作为衍生试剂，其中，硫酸-甲醇以价格便宜，衍生过程快速、安全，衍生产物对GC的响应较高而得到认可。目前，文献报道最多的是采用GC-MS方法。由于C26:(1在正常人和ALD患者血清中含量有差异，通常表现为正常人含量很低，而ALD患者血清中含量较高，这就要求标准曲线具有适宜的线性范围和较低的定量下限，同时也应具有分析时间短，分析效率高的优点。故有必要建立一个特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短的方法检测血清中VLCFAs含量，为临床上诊断ALD疾病提供可靠的实验依据，并通过大范围推广该方法，为遗传代谢病的筛查、产前诊断提供有效地检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法。本发明所提供的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，包括如下步骤标品、待测样本分别和内标溶液混合，加入酸性溶剂使溶液pH < 7，加热水解，水解完成后加入碱性溶剂使溶液PH > 7，再加入有机溶剂，混合均勻，加热水解，水解完成后加入酸使溶液PH彡7，混合均勻；加入正己烷或环己烷，取上清液，吹干，加入草酰氯，加热 55°C 60°C，反应5min 20min后冷却，吹干，加入二甲基乙醇胺，常温反应，衍生反应完成后吹干试剂；加入流动相复溶液复溶，高速离心后取上清溶液，与流动相一起流经色谱柱进行液相色谱-质谱分析，根据极长链脂肪酸的特征性色谱-质谱行为，最终测定体液中极长链脂肪酸的含量。本发明的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其中所述酸性溶剂为盐酸-甲醇溶液或硫酸-甲醇溶液。本发明的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其中所述碱性试剂为氢氧化钠-甲醇溶液或氢氧化钾-甲醇溶液。本发明的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其中所述有机溶剂为甲醇或乙腈。本发明的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其中所述流动相复溶液和流动相为含1-5%。甲酸或乙酸的甲醇-水溶液或乙腈-水混合溶液。本发明的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其中所述流动相复溶液中甲醇或乙腈的体积百分比含量为20-80%。本发明的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，以液相色谱作为分离手段，质谱做为检测手段的新技术，它涵盖了液相色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度、高选择性、适用范围广等优点，能够获得稳定的定性定量信息。此方法为特异性强、准确度和灵敏度高、 分析时间短为临床上诊断ALD疾病提供可靠的实验依据，为遗传代谢病的筛查、产前诊断提供有效地检测手段。本发明的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法以同位素为内标，使得目标化合物的识别更为准确，同时更好的消除了系统误差，定量结果更为准确。此方法能使各种结合形式的极长链脂肪酸游离出来，从而大大提高了检测的准确性，去除了基质的干扰，使检测方法的灵敏度和准确性大大提高。
图1为乙草酰氯衍生后C22:Q色谱图。图2为乙酰氯衍生后C24:Q色谱图。图3为乙酰氯衍生后C26:Q色谱图。图4为C22:Q质荷比特征图。图5为C22:(1同位素内标质荷比特征图。图6为C24:Q质荷比特征图。图7为C24:Q同位素内标质荷比特征图。图8为C26:Q质荷比特征图。
图9为C26:(1同位素内标质荷比特征图。图10为C22:Q标准品色谱图。图11为C22:Q内标色谱图。图12为C24:Q标准品色谱图。图13为C24:Q同位素内标色谱图。图14为C26:Q标准品色谱图。图15为C26:Q同位素内标色谱图。图16为血清样本色谱图。图17为血清样本C22:Q内标色谱图。图18为血清样本CM:Q色谱图。图19为血清样本C24:0内标色谱图。图20为血清样本C26:0色谱图。图21为血清样本C26:0内标色谱图。
具体实施例方式(一 )检测方法步骤1 用移液器移取标准品和内标溶液于细长带螺旋盖的玻璃管中，涡旋仪混勻；同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混勻，密封。步骤2 水解过程使各种结合形式的极长链脂肪酸转变为游离的极长链脂肪酸， 包括A和B两种方法，用两种水解方法处理的同一份血清样本，每种方法各测定5次，统计5次测定值的平均值及标准差，并用配对t检验方法比较两组数据是否有显著性差异，P < 0. 05为两组数据具有显著性差异；A 取血清和内标溶液混勻，加入5mol/L盐酸和乙腈的混合溶液于玻璃离心管中，在 100°C条件下加热lh，冷却。B i、加入酸性有机试剂使溶液pH < 7，加热水解，水解完成后取出玻璃管冷却至室温；ii、加入碱试剂使溶液pH > 7，再加入有机溶剂，混合均勻，加热水解，水解完成后
取出玻璃管冷却至室温；iii、加入酸试剂使溶液pH彡7，混合均勻。步骤3 加入小极性有机萃取试剂(正己烷或乙酸乙酯)，剧烈涡旋混勻使分层，静置一段时间使萃取分配完全。步骤4 取部分体积的上清液，吹干。步骤5 加入衍生试剂1(草酰氯)，加热(温度55°〇、601、65°0反应(时间5111土11、 10min、20min、60min)后冷却，吹干。步骤6 加入衍生试剂2 ( 二甲基乙醇胺或乙醇胺)，室温或加热反应，反应完成后冷却，吹干；步骤7 加入流动相复溶液复溶，充分混勻或高速离心。
步骤8 取适量上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，再经质谱分析，最终定量分析体液中极长链脂肪酸(VLCFAs)的含量。极长链脂肪酸，包含C22:(l，C24:0, C2610三种无支链饱和脂肪酸，其分子结构式如下所
示
N、Z、\、y
R——C——OHCl式A 式 B式A为极长链脂肪酸结构式其中当R为-C21H43时，该结构为二十二烷酸(C22:。)； 当R为-C23H47时，该结构为二十四烷酸(C24:Q)；当R为-C25H51时，该结构为二十六烷酸 ( 26:0)。式B为衍生产物结构式其中当R为-C21H43时，该结构为二十二烷酸衍生产物；当 R为-C23H47时，该结构为二十四烷酸衍生产物；当R为-C25H51时，该结构为二十六烷酸衍生产物。两种水解方法对检测值的影响如表1所示从表1中数据可以看到，两组数据之间存在显著性差异，采用酸、碱两步水解后的血清样本测定值的平均值明显高于仅采用酸水解的测定值。从配对t检验结果中可以看到，两种处理方法得到的结果中，c22:(l、c24:0, c26:0 的P值均小于0. 05，两组数据之间存在显著性差异。从而说明采用步骤B方法比A水解方法的水解完全程度要高很多，有利于更加准确测定极长链脂肪酸的含量。表1.经不同水解方式测定血清中VLCFAs的值
权利要求
1.一种检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，包括如下步骤标品、待测样本分别和内标溶液混合，加入酸性溶剂使溶液PH < 7，加热水解，水解完成后加入碱性溶剂使溶液PH > 7，再加入有机溶剂，混合均勻，加热水解，水解完成后加入酸使溶液PH ( 7，混合均勻；加入正己烷或环己烷，取上清液，吹干，加入草酰氯，加热 55°C 60°C，反应5min 20min后冷却，吹干，加入二甲基乙醇胺，常温反应，衍生反应完成后吹干试剂；加入流动相复溶液复溶，高速离心后取上清溶液，与流动相一起流经色谱柱进行液相色谱-质谱分析，根据极长链脂肪酸的特征性色谱-质谱行为，最终测定体液中极长链脂肪酸的含量。
2.根据权利要求1所述的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其特征在于所述酸性溶剂为盐酸-甲醇溶液或硫酸-甲醇溶液。
3.根据权利要求1或2所述的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其特征在于所述碱性试剂为氢氧化钠-甲醇溶液或氢氧化钾-甲醇溶液。
4.根据权利要求3所述的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其特征在于所述有机溶剂为甲醇或乙腈。
5.根据权利要求4所述的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其特征在于所述流动相复溶液和流动相均为含1_5%。甲酸或乙酸的甲醇-水溶液或乙腈-水混合溶液。
6.根据权利要求5所述的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，其特征在于所述流动相复溶液中甲醇或乙腈的体积百分比含量为20-80%。
全文摘要
本发明公开了一种检测体液中极长链脂肪酸含量的方法，包括如下步骤标品、待测样本分别和内标溶液混合，加入酸性溶剂使溶液pH＜7，加热水解，水解完成后加入碱性溶剂使溶液pH＞7，再加入有机溶剂，混合均匀，加热水解，水解完成后加入酸使溶液pH≤7，混合均匀；加入正己烷或环己烷，取上清液，吹干，加入草酰氯，加热55℃～60℃，反应5min～20min后冷却，吹干，加入二甲基乙醇胺，常温反应，衍生反应完成后吹干试剂；加入流动相复溶液复溶，高速离心后取上清溶液，与流动相一起流经色谱柱进行液相色谱-质谱分析，根据极长链脂肪酸的特征性色谱-质谱行为，最终测定体液中极长链脂肪酸的含量。本发明的检测体液中极长链脂肪酸含量的方法特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短。
文档编号G01N30/06GK102539592SQ20101058131
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者倪君君, 宋彦强, 李玮, 韩鎏 申请人:北京国立柏林医学科技发展有限公司