专利名称：体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法。
背景技术：
左旋肉碱(L-carnitine)，又称L-肉碱或音译卡尼丁，是一种促使脂肪转化为能量的维生素，对人体无毒副作用。左旋肉碱最突出的生理功能就是作为脂肪酸运输的载体， 以乙酰基左旋肉碱的形式将中长链脂肪酸，从细胞线粒体膜外转移到膜内，在线粒体基质中氧化，产生能量。存在于人体的肝脏和肾中产生，并储存在肌肉、精液、脑和心脏中。左旋肉碱的主要功能如下增强耐力，有利于心脏和血管的保健，有利于消除脂肪肝，促进疲劳恢复等。如果肉碱不足，则影响细胞内线粒体内的氧化过程，使细胞代谢失衡，进而引发骨骼肌、心肌和肝脏疾病。在骨骼肌方面，肉碱不足可致肌力下降，严重者走路困难和出现肌肉萎缩；在心肌方面，轻者无明显症状，重者可出现充血性心力衰竭；在肝脏方面，当出现肝功能障碍时，可出现恶心、呕吐、肝脏肿大和肝细胞脂肪蓄积，严重时可出现意识障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短的体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法。本发明所提供的体液中游离肉碱含量的检测方法，包括如下步骤标准品和内标溶液混勻，同时待测血清样本和内标溶液混勻；分别加入基质溶液； 再加入有机溶剂，混勻，离心；取上清液，加入有机溶剂或纯水定容混勻，取上清液，经液相色谱-质谱分析，定量体液中肉碱的含量。本发明的体液中游离肉碱含量的检测方法，其中所述内标溶液为二甲双胍水溶液或肉碱的同位素溶液。本发明的体液中游离肉碱含量的检测方法，其中所述基质溶液为4%的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。本发明的体液中游离肉碱含量的检测方法，其中所述有机溶剂为甲醇或乙腈。本发明所提供的体液中总肉碱含量的检测方法，包括如下步骤标准品和内标溶液混勻，同时待测样本和内标溶液混勻；分别加入基质溶液；力口入氢氧化钾水解液，加热水解；水解结束后，调节溶液7，加入有机溶剂，混勻，离心；取上清液，加入有机溶剂或纯水定容混勻，取上清液，经液相色谱-质谱分析，定量体液中肉碱的含量。本发明的体液中总肉碱含量的检测方法，其中所述基质溶液为4%的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。本发明的体液中总肉碱含量的检测方法，其中所述氢氧化钾水解液为含 0. 1-lmol/l氢氧化钾的生理盐水溶液。
本发明的体液中总肉碱含量的检测方法，其中所述有机溶剂为甲醇或乙腈。本发明的体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法，特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短，为临床上诊断由于肉碱缺乏引起的疾病提供可靠的实验依据，为遗传代谢病的筛查、产前诊断及优生优育提供有效地检测手段。本发明的体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法向用于定量的标准品溶液或质控溶液中加入基质溶液，能够大幅度提高加样回收率，从而大大提高检测结果的准确度，消除系统误差；以二甲双胍或同位素标记物为内标，使得目标化合物的识别更为准确，简单经济，定量结果准确。
图1为氢氧化钠水解色谱图。图2为氢氧化钾水解色谱图。图3为肉碱质谱特征图。图4为内标质谱特征图。图5为血清样本肉碱及内标色谱图。
具体实施例方式(一)检测方法A游离肉碱含量测定(1)用移液器移取标准品和内标溶液，同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混勻。(2)分别加入基质溶液，基质溶液为4%牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。(3)加入有机试剂(如甲醇、乙腈等)，混合均勻，高速离心。(4)取部分体积的上清液，加入有机试剂或纯水定容，混合均勻。(5)取上清液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，再经质谱分析， 最终定量分析体液中游离肉碱的含量。液相色谱条件在Waters Atlantis dC18色谱柱上进行分离，流动相为含0. 甲酸铵的水(V/ V)溶液和含0. 1 %甲酸铵的甲醇溶液(V/V)，采用梯度或等度洗脱方式，流速为200 μ 1/
mirio串联质谱条件质谱采用电喷雾离子源(ESI)、正离子模式、选择反应监测(SRM)进行定量分析。 离子源为ESI源，设置毛细管电压为1000V ；喷雾气压为25psi，干燥气温度250°C，干燥气流速9L/min，扫描方式为SRM。基质溶液对检测值的影响见表1，牛血清蛋白溶液作为标准曲线溶液的基质，可以大大提高加样回收率，从而提高标准曲线定量的准确性，消除基质干扰对标准溶液和样本溶液的不同程度的影响(即不同的质谱响应值的影响)。表1.不同的基质溶液对加样回收率的影响
权利要求
1.一种体液中游离肉碱含量的检测方法，包括如下步骤标准品和内标溶液混勻，，同时待测血清样本和内标溶液混勻；分别加入基质溶液；再加入有机溶剂，混勻，离心；取上清液，加入有机溶剂或纯水定容混勻，取上清液，经液相色谱-质谱分析，定量体液中肉碱的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述内标溶液为二甲双胍水溶液或肉碱的同位素溶液。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述基质溶液为4%的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述有机溶剂为甲醇或乙腈。
5.一种体液中总肉碱含量的检测方法，包括如下步骤标准品和内标溶液混勻，同时待测样本和内标溶液混勻；分别加入基质溶液；加入氢氧化钾水解液，加热水解；水解结束后，调节溶液7，加入有机溶剂，混勻，离心；取上清液，加入有机溶剂或纯水定容混勻，取上清液，经液相色谱-质谱分析，定量体液中肉碱的含量。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述基质溶液为4%的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述氢氧化钾水解液为含0.I-Imol/ 1氢氧化钾的生理盐水溶液。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述有机溶剂为甲醇或乙腈。
全文摘要
本发明公开了一种体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法。体液中游离肉碱包括的检测方法标准品和内标溶液混匀，同时待测样本和内标溶液混匀；分别加入基质溶液混匀；再加入有机溶剂，混匀，离心；取上清液，加入有机溶剂或纯水定容混匀，取上清液，经液相色谱-质谱分析，定量体液中游离肉碱的含量。体液中总肉碱含量的检测方法，还包括加入氢氧化钾水解液，加热水解；水解结束后，调节溶液PH≤7，加入有机试剂，混匀，离心的步骤。本发明的体液中游离肉碱或总肉碱含量的检测方法特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短。
文档编号G01N30/02GK102539546SQ20101058134
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者倪君君, 李玮 申请人:北京国立柏林医学科技发展有限公司