专利名称：肥大细胞脱颗粒的直接监测方法
技术领域：
本发明属于医药检测技术领域，特别涉及一种测定引起类过敏反应的物质的方法。
背景技术：
过敏反应为常见的不良反应之一。过敏反应即变态反应，是外源性抗原物质与体内抗体间所发生的一种非正常的免疫反应。可以诱发过敏反应的物质很多，如蛋白质、多肽、多糖等大分子物质具有完全的抗原性；另一些分子较小的化合物可作为半抗原与体内蛋白质结合成全抗原，从而引起过敏反应。目前涉及到过敏反应的过敏物质很多，发生频率较高的有药品(中药及西药)、食品、花粉、螨虫等。最新调查研究表明，77 %的急性过敏反应为类过敏反应，类过敏反应发生率远高于I型超敏反应。类过敏反应无需IgE介导，首次接触药物即可出现过敏症状，给人类的生活带来及大的危害。类过敏反应属于非免疫反应，无免疫系统参与，不需接触抗原物质，也无抗体参与，首次用药即可激发，外来物质直接刺激肥大细胞和嗜碱粒细胞脱颗粒，释放大量组胺， 由此产生过敏症状。因此，肥大细胞脱颗粒是类过敏反应中最直接、最重要的环节。肥大细胞的脱颗粒过程是由一系列步骤组成的，它包括囊泡的转运、定向、锚定、 融合等环节，每一个环节均受到严格调控。因此直接观察囊泡的运动方向监测其与膜融合的过程无疑是动态观察脱颗粒的最直接方法，但目前还没有一个合适的方法对其进行评估。RBL-2H3细胞是离体实验中常用的大鼠肥大细胞株，具有与在体肥大细胞相似的反应特性，因此，常被做为过敏反应的离体研究对象。在本发明中，绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein, GFP)与囊泡表面的标志性表面分子CD63基因融合，使RBL-2H3细胞(离体实验中最常规使用的大鼠肥大细胞株)特异性表达GFP-⑶63分子，使囊泡具有可识别的绿色荧光，利用全内反射显微镜成像技术，通过对囊泡与细胞膜融合释放活性物质的直接观察，评估肥大细胞脱颗粒的程度，从而建立一种直接观测方法。该方法在活细胞状态下，直观、灵敏、快速对致敏原进行筛选，克服了原有方法的不足，将为过敏原过敏性筛查、过敏原检测、环境安全性监测等领域提供新的方法。
发明内容
本发明提供一种通过肥大细胞脱颗粒的直接监测测定过敏物质的方法，该方法包括以下步骤步骤1，转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞和过敏物质放到一起培养，步骤2，用显微镜扫描采集培养物的图像，步骤3，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。
优选的方法包括以下步骤步骤1，转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，步骤2，将培养液换为台氏液，孵育；步骤3，加入过敏物质用显微镜扫描采集图像，步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。更优选的方法包括以下步骤步骤1，将转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，培养 24h ；步骤2，将培养液换为台氏液，37°C孵育30min ；步骤3，加入过敏物质后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每IOs采图一张，连续采集图像，共采集40min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。更优选的方法还可以是以下方法，包括以下步骤步骤1，将转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，培养 24h ；步骤2，将培养液换为台氏液，37°C孵育30min ；步骤3，加入过敏物质后移至全内反射显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每Is采图一张，连续采集图像，共采集20min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。本发明所述的过敏物质包括但不限于以下物质药物，花粉，食物，螨虫，细菌，微生物，植物等。本发明针对药物中的过敏物质具有特别优越的价值，如药物的注射剂，特别是针对中药的注射剂如双黄连粉针、清开灵注射液、穿琥宁注射液、参麦注射液、鱼腥草注射液寸。本发明的方法经过以下实验证明本发明的方法比现有技术优越1 材料试剂MEM 培养基(GIBC0，美国)；Compound48/80 (Sigma,美国)；CD63-GFP 质粒；Iipofect转染试剂(Tiangen Biotech，中国)；无内毒素质粒提取试剂盒(Tiangen Biotech，中国)；E. coli感受态大肠杆菌(Tiangen Biotech，中国)；大鼠嗜碱性细胞细胞株RBL-2H3细胞购自协和细胞库，使用MEM培养基进行常规培养。仪器二氧化碳培养箱(Thermo 371，美国)；超净工作台(苏州净化，中国)；激光扫描共焦显微镜及全内反射显微镜(Olympus FV1000,日本)；PCR仪(英国TechneTC-512)2 方法2. 1CD63-GFP RBL-2H3 细胞的构建2. 1. 1CD63-GFP融合基因的构建CD63全长cDNA是从RBL-2H3细胞中应用逆转录PCR反应扩增获得。上游引物为 AGCTTCGAATTCatggc ggtggaagga ggaatg (EC0R I)，下游引物为ACCGGTGGATCCCGCATTACTTCATAGCCACTTCGA (BamH I)。CD63 cDNA通过EcoR I和BamH I双酶切后与经相同酶切后的 pEGFP-Nl质粒链接，后克隆入感受态E. coli DH5a中，构建成⑶63-GFP E. coli，抗生素筛选后，增菌，进行测序验证。2. 1. 2质粒提取增菌后，用质粒提取试剂盒提取质粒，具体过程按说明书所示。2. 1. 3 转染体外扩增质粒后按照DNAfection试剂盒说明书将质粒转染至RBL-2H3细胞内。 转染后使用不含青链霉素的MEM培养液进行培养。7 后培养液中加入G418 (G418浓度为 0. 6ug/ml)进行筛选。待筛选至有荧光的细胞达到50%左右时，利用流式细胞仪对细胞进行分选，纯化后，传代，得稳定表达细胞株。2. 2本发明的肥大细胞脱颗粒的活体检测方法2. 2. ITIRFM观察将RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜IOOX油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后切换至TIRFM扫描模式，开始连续扫描采集图像，曝光时间0. Is, Is采集一张图片，连续采集20min。compound48/80及阴性对照药(细胞培养液)分别均在图像采集前加入。2. 2. 2激光扫描共聚焦显微镜将RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h 后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜IOOX油镜下观察。 选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每隔IOs采集一张图像，共采集40min。COmpOimd48/80及阴性对照药(细胞培养液)分别均在图像采集前加入。4 结果4. 1CD63-GFP RBL-2H3 细胞株的建立转染了 GFP质粒的RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察，激发波长 488nm，500-600nm波长处采集荧光信号。图像大小512X512B CD63-GFP转染细胞，图1 CD63-GFP RBL-2H3细胞株的建立转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察，激发波长 488nm，500-600nm波长处采集荧光信号。图像大小512X512。从图1可以看出，在单纯转染Free GFP的对照组细胞中，GFP荧光均勻分布在整个细胞中；而在转染CD63-GFP的细胞中，GFP荧光分布在细胞内囊泡的膜表面，形成圆环样的形状，说明转染成功。4. 2Compound48/80刺激后TIRFM观察细胞膜表面荧光颗粒变化图2C0mp0und 48/80刺激后，细胞膜表面TIRF结果图转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察，激发波长 488nm，500-600nm波长处采集荧光信号。选取到合适的细胞及视野后，切换至TIRF状态， EM-CXD工作状态-60°C，图像采集时间0. ls，大小512X512，每Is采图一张，连续采集图像，共采集20min。TIRF图像采集在加入compound48/80后立即开始。通过图2可以看出，经抗原刺激后，细胞膜表面在不同时间出现多个荧光颗粒，表明我们观察到了细胞内被荧光标记的囊泡运动到细胞膜表面时的状态。图3细胞经Compound 48/80刺激后激光共聚焦成像结果转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察，激发波长 488nm，500-600nm波长处采集荧光信号。选取到合适的细胞及视野后，每IOs采图一张，连续采集图像，共采集40min。compound48/80在第二张图像采集后加入。通过图3可以看出，经抗原刺激后，细胞内部荧光颗粒在不同时间点有比较明显的向细胞外运动的现象，说明我们观察到了细胞内被荧光标记的囊泡向细胞膜运动的过程。4. 3无关刺激后TIRFM观察细胞膜表面荧光颗粒变化图4转染细胞加入无关刺激后TIRF成像结果转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察，激发波长 488nm, 500-600nm波长处采集荧光信号。选取到合适的细胞及视野后，切换至TIRF采集状态。EM-CCD工作状态-60°C，图像大小512X512，采集时间0. ls，每Is采图一张，连续采集图像，共采集20min。TIRF图像采集在加入无关刺激剂(细胞培养液)后立即开始。通过图4可以看出，经无关刺激后，细胞膜表面在不同时间点基本无新增荧光颗粒出现，说明没有被荧光标记的囊泡运动到细胞膜表面。图5无关刺激后共聚焦观察细胞内部荧光颗粒运动变化转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞接种至共聚焦培养皿中培养24h后，将培养液换为台氏液。37°C孵育30min后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察，激发波长 488nm，500-600nm波长处采集荧光信号。选取到合适的细胞及视野后，每IOs采图一张，连续采集图像，共采集40min。无关刺激剂(细胞培养液)在第二张图像采集后加入。通过图5可以看出，经无关刺激后，细胞内部荧光颗粒在不同时间点在做随机运动，说明我们对无关刺激细胞未观察到细胞内被荧光标记的囊泡向细胞膜运动的现象。讨论⑶63是一种分子量为50_60kDa的四次跨膜的糖蛋白，表达于静止的嗜碱性颗粒、 肥大细胞和血小板的嗜碱性颗粒膜的表面[1，2].嗜碱性粒细胞或肥大细胞抗原激活后， 胞浆内的颗粒与细胞浆膜融合，使颗粒内的炎症介质如组胺连续释放，引起过敏或类过敏反应。研究表明[3]，用抗IgE抗体激活人嗜碱性粒细胞后，用流式细胞技术检测，发现表面的CD63表达增加，说明肥大细胞脱颗粒的过程是细胞内嗜碱性颗粒运动到细胞膜表面， 与细胞膜融合后，释放出颗粒内的活性物质的过程，CD63的表达与脱颗粒呈正相关W]。为了监测肥大细胞脱颗粒的动态过程，2001年，Amano T.等用GFP转染大鼠RBL-2H3细胞的 CD63基因，获得CD63-GFP融合表达细胞[5]，动态观察了细胞内的荧光颗粒在IgE介导的I 型超敏反应过程中细胞内荧光颗粒的运动过程，但对于非IgE介导的类过敏反应的动态过程尚有待研究。嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放介质的机理不尽相同，例如嗜碱性粒细胞释放介质时，每个介质颗粒分别与细胞膜融合，形成各自的出口而被排出，而肥大细胞的大多数介质颗粒先在细胞内融合，然后经共同的通道排出W]。因此，对细胞表面脱颗粒过程的监测能更精确的反应出肥大细胞脱颗粒的进程。^rtSMMitIt (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, TIRF) 是近年来新兴的一种光学成像技术，是利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标记样品的极薄的区域，观测的动态范围通常在200nm以下。 因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景噪音，因此，此项技术非常适合观察细胞表面物质的动态观察。本发明用GFP-CD63转染肥大细胞株，使囊泡具有可识别的荧光标识，用TIRF观察它在表面出现的机率，直接评估药物刺激肥大细胞脱颗粒的特性，从而为类过敏反应的检测提供新的检测手段。实验结果表明，在无关抗原刺激下，细胞呈静止状态，囊泡几乎静止不动，在抗原的刺激下，囊泡向膜表面运动，并在细胞表面检测到瞬间出现的荧光信号，激光共聚焦扫描的结果与全内反射显微镜检测到的结果一致。本发明建立了一种通过追踪肥大细胞内囊泡运动状态反映其脱颗粒状况的方法， 并通过实际应用充分说明了本方法的快速、灵敏性及可靠性。该方法克服了传统方法的不足，可应用于类过敏原的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值。参考文献1. Metzelaar, M. J. , ffijngaard, P. L. J. , Peters, P. J. , Sixma, J. J. , Nieuwenhuis, H. K.，and Clevers, H. C. (1991) J. Biol. Chem. 266，3239-3245.2. Nieuwenhuis, H. K. , van Oosterhout, J. J. G. , Rozemuller, Ε. , van Iwaarden, F.，and Sixma, J. J. (1987) Blood 70，838-845.3. Knol, E. F.，Mul, F. P. J.，Jansen, H.，Calafat, J.，and Roos, D. (1991) J.Allergy Clin. Immunol. 88，328-338.4. Frruno Τ. , Teshima R. , Kitani S. Sawada J. , Nakanishi Μ. , Biochem. Biophys. Res. Commun.，219，740-744 (1996)5. Amano Τ. , Furuno Τ. , Hirashima N. , Ohyama N. , Nakanishi Μ. , JBiochem., 129,739-744(2001)6.Dvorak AM, Newball HH, Dvorak HF, et al. Antigen-induced IgE-mediated degranulation of human basophil. Lab Invest 1980 ；43 (2) 126-39
图IA左为荧光图，右为透射图GFP对照细胞，图IB左为荧光图，右为透射图⑶63-GFP转染细胞图2compound 48/80刺激后，细胞膜表面TIRF结果3细胞经Compound 48/80刺激后激光共聚焦成像结果图4转染细胞加入无关刺激后TIRF成像结果图5无关刺激后共聚焦观察细胞内部荧光颗粒运动变化
具体实施例方式通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。
具体实施例方式通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。实施例1、测定方法步骤1，将转染了 CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞用MEM培养液培养(MEM培养液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用时加入10%胎牛血清， 青、链霉素10万单位)，传代三次后，将细胞接种至共聚焦培养皿(直径3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培养箱中培养24h后；步骤2，将培养液换为台氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2IOOg,加蒸馏水至 1000ml,临用前加葡萄糖 1. Og)， 37 °C 孵育 30min ；步骤3，加入测试药后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每IOs采图一张，连续采集图像，共采集40min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。或者步骤1，将转染了 CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞用MEM培养液培养(MEM培养液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用时加入10%胎牛血清， 青、链霉素10万单位)，传代三次后，将细胞接种至共聚焦培养皿(直径3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培养箱中培养24h后；步骤2，将培养液换为台氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸馏水至 1000ml,临用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步骤3，加入测试药后移至全内反射显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每Is采图一张，连续采集图像，共采集 20min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。实施例2、过敏物质测定方法步骤1，将转染了 CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞用MEM培养液培养(MEM培养液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用时加入10%胎牛血清， 青、链霉素10万单位)，传代三次后，将细胞接种至共聚焦培养皿(直径3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培养箱中培养24h后；步骤2，将培养液换为台氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸馏水至 1000ml,临用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步骤3，加入待测疑似过敏物质后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察。 选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每IOs采图一张，连续采集图像，共采集40min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。或者步骤1，将转染了 CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞用MEM培养液培养(MEM培养液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用时加入10%胎牛血清， 青、链霉素10万单位)，传代三次后，将细胞接种至共聚焦培养皿(直径3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培养箱中培养24h后；步骤2，将培养液换为台氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHC03500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 IOOg,加蒸馏水至 1000ml,临用前加葡萄糖 1. Og)， 37 °C 孵育 30min ；步骤3，加入疑似待测过敏物质后移至全内反射显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每Is采图一张，连续采集图像，共采集20min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。实施例3、中药注射剂过敏物质测定方法步骤1，将转染了 CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞用MEM培养液培养(MEM培养液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用时加入10%胎牛血清， 青、链霉素10万单位)，传代三次后，将细胞接种至共聚焦培养皿(直径3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培养箱中培养24h后；步骤2，将培养液换为台氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸馏水至 1000ml,临用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步骤3，加入中药注射剂后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每IOs采图一张，连续采集图像，共采集40min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。或者步骤1，将转染了 CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞用MEM培养液培养(MEM培养液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用时加入10%胎牛血清， 青、链霉素10万单位)，传代三次后，将细胞接种至共聚焦培养皿(直径3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培养箱中培养24h后；步骤2，将培养液换为台氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸馏水至 1000ml,临用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步骤3，加入中药注射剂后移至全内反射显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每Is采图一张，连续采集图像， 共采集20min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。
权利要求
1.一种通过肥大细胞脱颗粒的直接监测测定过敏物质的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞和过敏物质放到一起培养， 步骤2，用显微镜扫描采集培养物的图像，步骤3，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，步骤2，将培养液换为台氏液，孵育；步骤3，加入过敏物质用显微镜扫描采集图像，步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，将转染了 CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，培养24h ； 步骤2，将培养液换为台氏液，37°C孵育30min ；步骤3，加入过敏物质后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每IOs采图一张，连续采集图像， 共采集40min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。 或步骤1，将转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3细胞放到MEM培养基中培养，培养Mh ； 步骤2，将培养液换为台氏液，37°C孵育30min ；步骤3，加入过敏物质后移至全内反射显微镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每Is采图一张，连续采集图像，共采集20min。 步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的过敏物质包括但不限于以下物质药物，花粉，食物，螨虫，细菌，微生物，植物。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的过敏物质为药物。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的过敏物质为药物注射剂。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的过敏物质为中药注射剂。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的过敏物质为双黄连注射剂、清开灵注射剂、穿琥宁注射剂、参麦注射剂、鱼腥草注射剂。
9.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤1，将转染了CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞用MEM培养液培养，传代三次后，将细胞接种至共聚焦培养皿37度培养箱中培养24h后；步骤2，将培养液换为台氏液，37°C孵育30min ；步骤3，加入测试药后移至激光扫描共聚焦显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每IOs采图一张，连续采集图像，共采集40min。步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤1，将转染了⑶63-GFP质粒的RBL-2H3 细胞用MEM培养液培养，传代三次后，将细胞接种至共聚焦培养皿37度培养箱中培养24h后；步骤2，将培养液换为台氏液，37°C孵育30min ；步骤3，加入测试药后移至全内反射显微镜100X油镜下观察。选取细胞生长状况良好且无互相重叠的视野后开始连续扫描采集图像，每Is采图一张，连续采集图像，共采集 20mino步骤4，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。
全文摘要
本发明属于药物检测领域，涉及一种通过肥大细胞脱颗粒的直接监测测定过敏物质的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，转染了CD63-GFP质粒的RBL-2H3细胞和过敏物质放到一起培养，步骤2，用显微镜扫描采集培养物的图像，步骤3，根据图像中显示的荧光颗粒的存在和运动确定过敏物质的存在。
文档编号G01N21/84GK102156113SQ201010585029
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者于友华, 侯燕鸣, 张倩, 李连达, 王丹巧, 王毅, 胡剑江, 雷洪涛 申请人:中国中医科学院医学实验中心