专利名称：一种检测对氯苯胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
一种检测对氯苯胺的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA) 技术领域，用于纺织品行业中对氯苯胺含量的检测。
背景技术：
纺织品在我国出口贸易中地位独特，从而要求了检验检疫的严格性，特别是由于 中国连年的贸易顺差，使得欧美国家纷纷提高了纺织品的标准，制定了严格的规定，其中 最为风行的纺织品环保生态标准标签要算Oko - TexlOO、MandardlOO和Eco — Textile, 而Oko - TexlOO在纺织品环保标准中最具权威、影响最广。主要包括法规性测试，品质性 能测试和生态测试，而生态测试中其检测项目有禁用偶氮染料、甲醛、PH酸碱性等。偶氮着色剂是合成着色剂中最大的类别，占世界市场份额的60% 70%。由于色调 种类繁多和良好的耐光性，其应用范围极为广泛。偶氮染料在印染合成过程中所剩余的某 些芳香胺中间体具有致癌作用，所以被列为首要的检测项目，目前共有M种芳香胺被列为 检测内容，其最高含量不超过30ppm。传统检测流程是将纺织品在70°C下利用水溶性的柠檬酸盐缓冲溶液(pH=6)中的 连二硫酸钠还原处理，样品加入到硅胶柱中，乙醚淋洗得到混合组分，经过浓缩后采用气相 质谱进行分析。传统检测方法，仪器设备昂贵、检测过程复杂、容易造成环境污染，不适合现 场监控和大量样本的筛查。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测对氯苯胺的酶联免疫试剂盒及其检测方法，用于 纺织品行业中对氯苯胺含量的检测。本发明的技术方案该检测对氯苯胺的试剂盒是由96孔包被板，对氯苯胺标准 品，抗对氯苯胺的抗体，酶标记的羊抗兔冻干品，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液 所组成。对氯苯胺包被抗原，是对氯苯胺半抗原与载体蛋白通过与碳化二亚胺反应得到的 偶联物；对氯苯胺半抗原是将对氯苯胺和丙酸通过修饰作用得到的；载体蛋白为卵血清蛋 白。对氯苯胺标准品，从干粉中稀释得到，稀释液为0. 15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共 6 瓶，对氯苯胺浓度分别为:0mg/L,0. 5 mg/L, 1. 5 mg/L, 5 mg/L，15 mg/L, 50 mg/L。本发明主要采用酶联免疫法(EIISA)来检测对氯苯胺。采用ELISA的技术主要有 两个方面第一、特异性多克隆抗体的制备，第二，对氯苯胺的EIISA试剂盒的制备。对氯苯胺多克隆抗体，先制备对氯苯胺全抗原，该抗原为对氯苯胺半抗原和牛血 清白蛋白的偶联物，具体的制备过程和前面对氯苯胺包被抗原的制备方法一样。然后将偶 联物免疫兔子，得到对氯苯胺多克隆抗体。测定方法为测定的基础是标记免疫反应。取包被有对氯苯胺-卵清白蛋白的微孔包被板，洗涤液洗涤，加入对氯苯胺标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入对 氯苯胺抗体，震荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗 涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光度，对照标准 曲线计算样品中的对氯苯胺含量。其操作为取包被有对氯苯胺-卵清白蛋白的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加 入IOOul对氯苯胺标准品和处理好的样品到各自的微孔中，再加入50ul对氯苯胺抗体，震 荡混勻，37°C孵育1小时，洗涤液洗涤三次，加50ul辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔抗体， 37°C孵育30分钟，洗涤液洗涤五次，加50ul显色液A和50ul显色液B，37°C孵育15分钟后 加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(0D值)，对照标准曲线计算样品中的对氯苯胺含 量。样品的前处理取有代表性试样，剪成5mmX5mm的小片，混合。从混合样品中称取 l.Og (精确至O.Olg)，置于反应器(具密闭塞，约65ml，由硬质玻璃制成管状)中，加入17m 预热到(70士2) °C的柠檬酸盐缓冲液，将反应器密闭，用力振荡，使所有试样浸于液体中，置 于水浴中，并在(70 士 2) °C保温30分钟，使所有的织物充分润湿。然后，打开反应器加入 3ml连二亚硫酸钠溶液，并立即密闭震摇，将反应器再于(70士2) °C保温30分钟，取出后两 分钟内冷却到室温。从中取5ml溶液，加入5滴5mol/LNa0H和Iml 二氯甲烷，震荡后弃去 水相，再加入2滴lmol/LHCl和Iml水，震荡后取水相用PH7. 5 0. 15mol/LPBS稀释2倍后 检测。本发明的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高。
图1 对氯苯胺PCV标准浓度表 图2:对氯苯胺PCV标准曲线图3 :PCV浓度和吸光度表 图4 对氯苯胺检测试剂盒的检测表 图5 标准品精密度(CV%)表 图6 试剂盒的准确度表。
具体实施例方式下面将结合附图对本实用新型做详细的介绍如图1所示以标准品浓度自然对 数为X轴，吸光值为Y轴，做标准曲线如图2所示PCA间接竞争法标准曲线图标+准曲线 方程Y = -0. 2413 (X) +1. 5015R2=0. 9912
定量限X=O. 5mg/L
实施例1、制备试剂盒和检测样品
具体的方法在氮气条件下向25毫升三口瓶中依次加入l.Ommol金属钐粉，10毫升无 水四氢呋喃和1. 5mmol单质碘，室温搅拌30分钟，制备得到黄色的Immol碘化钐，向反应 瓶中依次加入1. 2mmol芳香胺和1. Ommol丙烯酸，在室温下搅拌数小时，气相跟踪反应到结 束，混合物逐渐变成棕红色，反应完毕，冷却加入3毫升水分解，用乙醚(3*20毫升)萃取， 合并有机相，依次用饱和硫代硫酸钠(15毫升)和饱和食盐水(15毫升)洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，过柱分离得到纯的产品。对氯苯胺中R为氯原子。将对氯 苯胺修饰为对氯苯氨基丙酸，形成带一COOH的新化合物，再与卵血清蛋白通过碳化二亚胺 法进行偶联，得到对氯苯胺包被抗原。通过光谱扫描和蛋白电泳确定是否偶联成功。 对氯苯胺多克隆抗体的制备
先制备对氯苯胺-牛血清白蛋白的全抗原，制备方法与包被抗原的制备方法一样，只 是偶联蛋白变为牛血清白蛋白。用偶联好的对氯苯胺-牛血清白蛋白作为免疫原，免疫兔子，制备对氯苯胺多克 隆抗体，具体步骤如下
(1)准备两只成年兔，体重1.5-2. 0公斤，免疫前取3-5ml血清作为对照。按每只兔子 0. 5mg PCA-BSA的量溶于0.5ml磷酸缓冲液，然后与等体积弗氏完全佐剂混合，震荡使之充 分乳化。在兔背部脊柱两侧不同部位进行皮下注射抗原溶液。( 按照0周 2周、周、 周 10周的间隔进行免疫，在注射后的7天-10天进行血液收集。将收集的血液与注射前收 集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子 收集血液不能多于40ml以防止休克。( 收集血液在兔颈动脉处插管进行血液收集，将 血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。将血液转移至塑料离心管中，4°C， 10，OOOg离心10分钟，收集上清液即为抗血清，-20°C保存。包被板固相抗原制备
将对氯苯胺-卵清白蛋白用0. lmol/L PH9. 6 NaHCO3缓冲溶液稀释至2ug/L作为包被 液，在96孔酶标板中各加50ul，4°C放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加250ul 1%明胶封 闭，4°C放置过夜，弃去封闭液，冲洗两次，吹干，用铝箔袋塑封后置4°C保存。试剂的制备
(1)对氯苯胺标准品(0mg/L，0. 5 mg/L, 1. 5 mg/L, 5 mg/L，15 mg/L, 50 mg/L)从干粉 中稀释得到，稀释液为0. 15mol/L的磷酸盐缓冲溶液。(2)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体冻干品(HRP-羊抗兔抗体)市售，国外进□。(3)抗体稀释液的配制:0. 145mol/L NaCL+0. 15mol/L PBS 溶液，调 PH 为 7. 2。(4)洗涤液0. 15mol/LNaCL +0. 021mol/LTris-HCL+ 0. 7 1% 吐温，调 PH 为 7. 5。(5)显色液A的配制:0. 4M柠檬酸缓冲液50 mL, +50 uL30%H202,调PH5. 0
(6)显色液B的配制19. 5mgTMB溶于1. 5mL 二甲基亚砜，溶于沘.5mL H2O,加20 mL甘 油，充分混勻。(7)终止液2mol/L的硫酸溶液。(8)包被缓冲液0. lmol/L PH9. 6 NaHCO3 缓冲溶液 (9)封闭液1%明胶
以96孔测试盒为例，每一个盒中试剂足够进行80个样品的检测，盒中的材料如下
(1)1X96孔板包被有对氯苯胺-OVA.
(2)6X对氯苯胺标准液，1.0ml/瓶，标准液浓度为0，0.5，1. 5，5，15，50 mg/L
(3)IX对氯苯胺抗体血清80ul，用时用抗体稀释液1:100稀释。(4) IXHRP-羊抗兔抗体80ul，用时用抗体稀释液1 100稀释。(5) IX洗涤液50ml，用时用蒸馏水1:20稀释。
(6) 1 X 抗体稀释液30ml.
(7)IX 显色液 A: 8ml
(8)IX 显色液 B: 8ml
(9)IX终止液 8ml
实验室自备的试剂蒸馏水或去离子水。测定前注意事项
1、使用之前将所有试剂回升至室温(18~30°C )。2、使用之后立即将所有试剂放回2、°C。
3、如果样品量大，建议使用多通道移液器。4、取出需用数量的微孔板后，将不用的微孔板放进原锡箔袋中，保存于2 8°C。具体检测步骤如下
先将样品进行处理取含有对氯苯胺的试样，剪成5mmX5mm的小片，混合。从混合样品 中称取l.Og (精确至O.Olg)，置于反应器(具密闭塞，约65ml，由硬质玻璃制成管状)中， 加入17m预热到(70 士 2) ！的柠檬酸盐缓冲液，将反应器密闭，用力振荡，使所有试样浸于 液体中，置于水浴中，并在(70士2) °C保温30分钟，使所有的织物充分润湿。然后，打开反 应器加入3ml连二亚硫酸钠溶液，并立即密闭震摇，将反应器再于(70士2)°C保温30分钟， 取出后两分钟内冷却到室温。从中取5ml溶液，加入5滴5mol/LNa0H和Iml 二氯甲烷，震 荡后弃去水相，再加入2滴lmol/LHCl和Iml水，震荡后取水相用PH7. 5 0. 15mol/LPBS稀 释2倍后检测。取包被有氯苯胺-卵清白蛋白的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入IOOul对氯 苯胺标准品和处理好的样品到各自的微孔中，再加入50ul对氯苯胺抗体，震荡混勻，37°C 孵育1小时，洗涤液洗涤三次，加50ul辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔抗体，37°C孵育30分 钟，洗涤液洗涤五次，加50ul显色液A和50ul显色液B，37°C孵育15分钟后加终止液，在 450nm-630nm处测量吸光值(0D值)，对照标准曲线计算样品中的对氯苯胺含量。见图3，该 例样品中含有对氯苯胺8. 3mg/L0图3结果分析
所获得的每个浓度标准品溶液或样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准品(0标 准品)的吸光度值(Btl)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值(％)=B/B0X 100%
公式中B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，Btl为Omg/L标准溶液的平均吸光度值。 以对氯苯胺浓度的自然对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图1所示。相 对应每一个样品中对氯苯胺的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出 样本溶液中对氯苯胺的浓度。整个检测过程只需2小时就可以完成，最低检测限为0. 5 mg/ L0
实施例2对氯苯胺检测试剂盒前处理方法实验
取各不同纺织品材质的阴性的试样，前处理具体方法按实施例1中的方法进行，然后 用对氯苯胺检测试剂盒的检测，结果见图4。实施例3、对氯苯胺酶联免疫试剂盒的精密度、准确度试验1、标准品溶液精密度试验
从实施例1制备的酶联免疫试剂盒的同一批中分别选取10个酶标板，从每个酶标板 中，各抽出20个微孔，测定5mg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。用该方法考察板内 精密度。测定结果见图5。结果表明，试剂盒，标准品精密度的测定范围在5. 08%—11. 37% 之间，因此确定精密度范围均小于25%。2、试剂盒的准确度试验
取两个浓度的对氯苯胺标准品溶液分别为15 mg/L和30mg/L，对样品进行添加回收试 验，每个浓度做4个平行，具体方法如实施例1中样品前处理步骤，分别计算准确度，结果见 图6。结果表明100%毛样品的添加准确度在67. 3% — 118. 9%之间，100%棉样品的添加 准确度在63. 6%—119.洲之间100%麻样品的添加准确度在79. 8%—122. 6%之间，100%丝 样品的添加准确度在65. 7%—117. 7%之间，100%尼龙样品的添加准确度在66. 7%—112. 4% 之间，100%粘胶样品的添加准确度在63. 1%—109. 2%之间，100%腈纶样品的添加准确度在 64. 7%—1079. 9% 之间。
权利要求
1.一种检测对氯苯胺的酶联免疫试剂盒，其特征是由96孔包被板，对氯苯胺标准品， 抗对氯苯胺的抗体，酶标记的羊抗兔冻干品，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液所组 成；所述的酶标记的羊抗兔抗体冻干品为辣根过氧化物酶一羊抗兔抗体冻干品，封闭液为 含有封闭剂的，抗体稀释液为0. 15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，洗涤液为含有0.079Γ0. 1%吐 温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯 胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，终止液为2mol/L的硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被抗原，是对氯苯胺半抗原与载体蛋白与 碳化二亚胺反应后法得到的偶联物；所述的对氯苯胺半抗原是将对氯苯胺和短碳链物质通 过修饰作用得到的；所述的载体蛋白为卵血清蛋白。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的对氯苯胺标准品，从干粉中稀释得到，稀释液 为0. 15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，对氯苯胺浓度分别为:0mg/L,0. 5 mg/L, 1. 5 mg/ L，5 mg/L,15 mg/L,50 mg/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的对氯苯胺特异性抗体为多克隆抗体，它们均 是用对氯苯胺半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的对氯苯胺半抗原是将 对氯苯胺和丙酸通过修饰作用得到的；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白。
5.一种用权利要求1所述的试剂盒检测对氯苯胺的方法，其特征是取包被对氯苯 胺-卵清白蛋白的微孔包被板，加入对氯苯胺标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再 加入对氯苯胺抗体，震荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗 涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值OD 值，对照标准曲线计算样品中的对氯苯胺含量。
6.根据权利要求5所述的检测对氯苯胺的方法，其操作为取包被有对氯苯胺-卵清 白蛋白的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入IOOul对氯苯胺标准品和处理好的样品到各 自的微孔中，再加入50ul对氯苯胺抗体，震荡混勻，37°C孵育1小时，洗涤液洗涤三次，加 50ul辣根过氧化物酶HRP-羊抗兔抗体，37°C孵育30min，洗涤液洗涤五次，加50ul显色液 A和50ul显色液B，37°C孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值，对照标准 曲线计算样品中的对氯苯胺含量。
7.根据权利要求5所述的检测对氯苯胺的方法，其中样品处理取有代表性试样，剪成 5mmX 5mm的小片，混合；从混合样品中称取1. Og,置于反应器中，加入17m预热到70士2°C 的柠檬酸盐缓冲液，将反应器密闭，用力振荡，使所有试样浸于液体中，置于水浴中，并在 70士2°C保温30分钟，使所有的织物充分润湿；然后，打开反应器加入3ml连二亚硫酸钠溶 液，并立即密闭震摇，将反应器再于70士2°C保温30分钟，取出后两分钟内冷却到室温；从 中取5ml溶液，加入5滴5mol/LNa0H和Iml 二氯甲烷，震荡后弃去水相，再加入2滴lmol/ LHCl和Iml水，震荡后取水相用PH7. 5 0. 15mol/LPBS稀释2倍后检测。
全文摘要
一种检测对氯苯胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒，该检测对氯苯胺的试剂盒是由96孔包被板，对氯苯胺标准品，抗对氯苯胺的抗体，酶标记的羊抗兔冻干品，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液所组成；对氯苯胺包被抗原，是对氯苯胺半抗原与载体蛋白通过与碳化二亚胺反应得到的偶联物；对氯苯胺半抗原是将对氯苯胺和丙酸通过修饰作用得到的；载体蛋白为卵血清蛋白。
文档编号G01N33/543GK102147407SQ20101061852
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者奚奇辉, 孟凡国, 沈兵, 王练, 胡卫江, 蒋哲, 顾兰兰 申请人:中华人民共和国嘉兴出入境检验检疫局, 嘉兴博泰生物科技发展有限公司