专利名称：一种快速检测抗草甘膦g2-epsps蛋白的金标试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种生物样品的检测装置，尤其是快速检测抗草甘膦G2-EPSPS 蛋白的金标试剂盒。
背景技术：
在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需 要对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。G2-EPSPS蛋白编码基因克隆自荧光假单胞菌G2基因组文库，该菌筛选自草甘 膦污染土壤，具有高草甘膦耐受性。该基因编码的蛋白经分析属于Class I类型，酶活测 定显示该蛋白具有高底物亲和能力和低草甘膦亲和力，因此能赋予宿主高草甘膦除草剂 耐受力。现有的检测装置，如采用酶免、放免等方法的装置，受仪器(酶标仪、放免闪 烁仪、离心机等)、场地等因素的限制，而且检测时间长(酶免检测时间需20hr、放免检 测需30min Ihr)，检测成本较高，很难推广应用。因此，实践中需要有一种可快速检 测转基因植物中G2-EPSPS蛋白，且操作简便、结果准确可靠、快速的装置。发明内容为了克服现有装置操作复杂、检测时间长的不足，本实用新型提供了一种快速 检测转基因成分(G2-EPSPS)的免疫检测试剂盒，不仅操作简便，而且结果准确可靠。本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是一种快速检测G2-EPSPS蛋白的金标试剂盒，包括盒体、测试带和上盖，盒体 盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于所述上盖设置有一个观测窗和一个加样孔，所述盒 体和上盖的形状是六边形。所述盒体的深度不限，其上表面可以设置一条可以嵌入所述测试带的凹槽。所述盒体或上盖可具有卡槽，以保证盒体与上盖扣紧。所述观测窗优选是长方形，观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在 上盖上用字母C、T标示出。所述测试带形状为长方形片状，用于检测G2-EPSPS蛋白。所述测试带是一 种具有检测系统主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维膜、塑料等多层材料制 成。测试带分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗体； G2-EPSPS蛋白测试带的样品检测区包被特异功能性EPSPS单克隆抗体或多克隆抗体。外源基因转入植物表达后，将产生目的蛋白(EPSPS)，可通过免疫反应检测样 品中是否含有该蛋白来确定该基因是否存在。如果外源基因转入植物，发生基因沉默， 无目的蛋白产生，将不能达到预期目的(抗草甘膦)。本实用新型的目的是这样实现的当盒体盖入上盖后，观测窗和加样孔对应测 试带，通过盒盖上的加样孔和观测窗可进行加样和观察检测结果。检测时，将送检物品的提取液滴加在试剂盒的加样孔中，5-10分钟后，通过肉 眼就可以通过上盖的观测窗直接观察到准确的检测结果。[0017]对于每个观测窗来说，用以下方式判断检测结果1、阴性(-)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带。检测结果待检样品中不含待检基因或其含量在其阈值以下。2、阳性(+)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带，在测试区(T)内同时出现 紫红色条带。检测结果待检基因含量在阈值以上。3、无效反应状况质控区(C)未出现紫红色条带，检测结果表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。本实用新型所述试剂盒的优点在于经济高效使用成本低廉，保存方便；简便快速检测转基因成份一步法操作，不需任何附加设备。直接将待测样品 液滴加在加样孔中，5-10分钟可出结果；结果直观不借助任何仪器对抗原进行检测，用肉眼可观察到结果；准确可靠灵敏度高、特异性强；应用广泛可检测玉米、棉花、水稻、小麦、烟草、大豆等各类农作物的叶 片、种子及加工产品。本实用新型可对植物样品进行EPSPS分析，检测快速、特异、敏感、方便， 特别适用于转基因产品的研制开发和转基因产品的快速筛选，可用于实验室、田间、边 防、海关植物检验、检验检疫局、食品安全检测及种子经营销售等部门对可疑样本现 场、快速筛查。
以下结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。图1和图2是本实用新型一种试剂盒的结构示意图，其中图1是盒体的俯视图， 图2是试剂盒上盖的俯视图；图中1是加样孔，2是观测窗，3是测试带，C是质控区，T是测试区。
具体实施方式
实施例1试剂盒的制备一、制备测试带EPSPS单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL。1周后，将EPSPS单抗杂交瘤细胞注射于以上 预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1 3X106。10天后收获腹 水，以上过程皆在无菌条件下完成。1 .EPSPS单克隆抗体的纯化 1)以DEAE离子交换层析及Sephacryl S-300分子筛对单抗进行纯化； SDS-PAGE平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；[0042]2)纯化过程取小鼠单抗腹水一3,000 Xg离心15分钟一上清液加50%硫酸铵 沉淀，过夜一3,000 Xg离心20分钟一沉淀溶于0.0IM磷酸盐缓冲液(pH 7.2) — S-300凝 胶柱一DEAE Blue层析柱一0-800mM NaCl梯度洗脱一超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在 95%以上；4)蛋白浓度测定紫外分光光度计测定279nm处的OD值，按以下公式计算蛋 白含量OD279/1.4 = mg/mL(纯化单抗)。将单抗浓度调节为约lmg/mL ；5)单抗活性测定选用EPSPS抗原包被ELISA板(lyg/孔)，及羊抗鼠 IgG-HRP复合物，测定各单抗效价(大于1 5000)。2.羊抗DOAt高效价免疫抗血清的制备和纯化1)纯化好的上述单抗+完全佐剂一免疫山羊一加强免疫二次，每次间隔一月一 第二次加强后10天左右取血一离心取血清一硫酸铵沉淀一DEAE离子交换层析纯化；2)效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1 256;3)蛋白浓度测定紫外分光法测定OD279，计算蛋白浓度。3.胶体金及金标抗体制备1)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将0.01 ^HauCl4 加热至沸，加入一定量的柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 ·2Η20)，继续加热煮沸5分钟，待 胶体金溶液颜色由兰一紫一红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期 保存，可加入0.02% NaN3O2)将胶体金液500mL用0.IMNaOH调pH8.4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2mL， 搅拌20分钟。5,500Xg离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体 金标记抗体沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用0.45 μ m微孔滤膜过滤。取样进行检定， 其余置4°C保存。4.膜反应体系Ml的制备1)将EPSPS抗体及纯化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约 0.2-2mg/mL。2)纯化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，浓度为2.0mg/mL ；3)硝酸纤维素膜大小10CmX27Cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4 条；4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；5)设置喷速为2 μ L/cm，NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗EPSPAD2 (2mg/ mL)在NC膜上包被反应检测线，以l.Omg/mL兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检 测线的距离为4-4.5mm;6)完成包被后，置37°C干燥箱24小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB 洗液抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥备用；8)切制备好的硝酸纤维素膜1.8CmX27Cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。
置室温保存备用。5.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备[0063]将吸水纤维膜分别浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，装入塑
料袋中，室温保存。l)M2a制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1.2cm/条；2)M2b制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1.8cm/条；3)M3制备将制好的玻璃纤维切27cmX 1.2cm/条。6.膜反应体系M4的制备1)取胶体金-单抗复合物加稀释液，混勻配成工作浓度；2)将溶液加入喷涂机Biodot的Airjet喷头储存瓶中；3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s ；4)喷制规格为0.5-1.5cmX 25cm/条，每条喷2遍；5)于37°C烘干12小时，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。7.反应体组装1)在M6塑料基板上贴双面胶带M7 二条；2)在M7中间贴反应膜Ml (18mm)，离M6上缘约22mm ；3)在M7上贴M5 (22mm)，与M6上缘对齐并与Ml上缘交Imm ；4)在M7上贴M2a(12mm)，与Ml下缘相接；5)在 M2 上贴 M4 (IOmm)，压住 Ml 下缘 0.5mm ；6)在 M7 上贴 M3 (12mm)，上缘压住 M4 约 2/3 ；7)在M7上贴M2b (18mm)，上缘压住M4约2/3，下缘与M7的下缘对齐；8)在M4和M7上贴透明保护胶带M8，上缘完全压住M4，并压住Ml约 1.5mm ；9)在M5上贴彩色标记胶带M9，与Ml上缘交1mm，另一端翻过M6上缘，贴 于M6背面；10)将组装成型的反应体用全自动切条机切成3.5_规格。二、试剂盒装配将上述制备好的检测G2-EPSPS蛋白的测试带3嵌入图1盒体的凹槽中，然后将 上盖与盒体扣紧，即成试剂盒。将试剂盒、滴管和使用说明书装塑料袋封装后，即可。实施例2试剂盒使用过程1.检测样本处理及准备植物种子、叶子、籽苗等样本在检测前需经研磨，并以蒸馏水抽提和稀释。为 获得最佳检测效果，各不同样品应根据下表中的比例稀释，在完成研磨和稀释后，将样 本混勻，静置，取上清液作为检测样品。植物种类叶子及籽苗种子叶子/蒸馏水(g/mL )种子/蒸馏水(g/mL )水稻1 201 2小麦1 101 4其余双子叶植物1 101 4其余单子叶植物1 201 22.检测及结果将检测盒平放，用所配塑料吸管吸取样品液，滴加4-5滴于检测盒的加样孔 中，吸水材料使待检样品缓慢移动，膜反应体系被启动。无论待测基因是否存在于植物 样品中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带 是判定是否有足够的植物样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标 准。3.结果判定观测窗检测待检基因是否存在。1)若待测植物样本中不含特定G2-EPSPS蛋白，或其浓度低于检测灵敏度，胶 体金抗体在层析过程中不会被固定在膜上检测带内的单抗免疫，因而测试区内(T)不会 出现一条紫红色检测带，显示阴性(-)结果，即仅在质控区(C)内出现一条紫红色条带。2)若待测植物样本中G2-EPSPS蛋白浓度高于其检测阈值时，抗原免疫金与检 测带上的另一单抗结合，在测试区内(T)还将出现另一紫红色检测带，显示阳性(+)结 果，即在质控区(C)和检测区(T)内各出现一条紫红色条带。注意测试区(T)内的 紫红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深 浅，都应判定为阳性结果。3)若试剂盒质控区(C)未出现紫红色条带，则检测结果无效，表明不正确的操 作过程或试剂盒已变质损坏。
权利要求1.一种快速检测抗草甘膦G2-EPSPS蛋白的金标试剂盒，包括盒体、测试带和上盖， 盒体盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于所述测试带置于所述盒体内表面，所述上盖设 置有一个观测窗和一个加样孔；所述盒体和上盖的形状是六边形。
2.根据权利要求1所述的快速检测抗草甘膦G2-EPSPS蛋白的试剂盒，其特征在于所 述盒体内表面设置有可以嵌入所述测试带的凹槽。
3.根据权利要求1或2所述的检测抗草甘膦G2-EPSPS蛋白的试剂盒，其特征在于所 述盒体或上盖具有卡槽。
专利摘要本实用新型涉及一种快速检测抗草甘膦G2-EPSPS蛋白的金标试剂盒，包括盒体、测试带和上盖，盒体盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于所述测试带置于所述盒体内表面，所述上盖设置有一个观测窗和一个加样孔。本试剂盒可为快速检测植物种子、叶片及加工产品中是否含有抗草甘膦G2-EPSPS蛋白基因成份提供直接证据，不需其它任何附加仪器设备。本试剂盒操作简便、检测结果形象、准确、快速只要将送检物品的提取液滴加在试剂盒的加样孔中，5-10分钟后，不借助任何仪器可直接观察到准确的检测结果。
文档编号G01N33/577GK201796033SQ20102010724
公开日2011年4月13日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者刘奇, 张维, 李亮, 林敏 , 郑建, 陆伟 申请人:中国农业科学院生物技术研究所