专利名称：一种检测三聚氰胺的免疫胶体金试剂板的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测动物饲料、牛奶和奶粉中三聚氰胺残留的试剂板，具体 涉及一种检测三聚氰胺的免疫胶体金试剂板。
背景技术：
三聚氰胺(melamine)是一种三嗪类含氮杂环有机物，又名蜜胺，氰尿三酰胺。由 于其氮的含量高，无味低毒，加上既有的食品和饲料工业蛋白质含量测试方法存在一定缺 陷，三聚氰胺被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标。然而长期 摄入这种含三聚氰胺的食品，会造成生殖、泌尿系统的损害、膀胱和肾脏结石，甚至可进一 步诱发膀胱癌。2007年3月，美国曾发生多起因喂食受到三聚氰胺污染的原料生产的饲料 而导致宠物猫、狗中毒死亡事件；而在2008年9月份，中国多个品牌婴幼儿奶粉因含三聚氰 胺而导致孩子肾结石。这一系列事件引起国内外对食品安全问题的广泛关注，对食品和动 物饲料中三聚氰胺残留的检测已成为必须。2008年10月7日，继“毒奶粉”事件之后，卫生部、工业和信息化部、农业部、工商总 局、质检总局联合印发了关于乳制品及含乳食品中三聚氰胺临时管理限量值规定的公告。 在公告中规定婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为lmg/kg ；液态奶(包括原料乳)、奶 粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2. 5mg/kg ；含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺 的限量值为2. 5mg/kg。目前，对于三聚氰胺残留的检测方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化分析 法，如HPLC及LC-MS，具有特异性好、准确率高的特点，是各大检测机构对检测样本进行确 证的首选方法，但存在对设备、环境、操作技能等要求，所需费用高，不利于大规模样本筛 选，因而不适合广大基层部门。免疫分析法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，具有检测量大，操 作相对简单等优点，越来越多地被用于动物性食品中抗生素残留的检测，但是ELISA法整 个操作时间仍需要l_2h，且需用到昂贵的特殊仪器设备，具有一定局限性。食品安全关系国计民生，研制开发一种检测限符合要求，重现性好，检测时间短， 适合现场快速检测，技术产品或仪器设备成本较低，运行费用低的快速检测试剂迫在眉睫。
实用新型内容本实用新型的目的在于提供一种灵敏度高，特异性好，简便快速，生产成本低的三 聚氰胺免疫胶体金快速检测试剂板。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品 垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有l_2mm的重叠以保证层析作用从 样品垫到吸水垫部位的顺利进行。本实用新型试剂板的各部分组成成分和功能如下塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液PH值的作用。胶金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗三聚氰胺单克隆抗体与胶体金结合物。为样 品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，将反应结果 以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。本实用新型试剂板具有如下有益效果(1)特异性好。本实用新型试剂板对三聚氰胺的交叉反应率为100%，对链霉素、 氯霉素、庆大霉素等其他抗生素的交叉反应率均低于1%。可见，本实用新型试剂板对三聚 氰胺反应具有高度专一性。(2)灵敏度高。本实用新型试剂板对成品饲料及饲料原料、牛奶和奶粉(非婴儿配 方)中三聚氰胺的检出限为2mg/kg，符合国家限量要求。(3)操作简单快捷。本实用新型试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬 中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理， 滴样后5-10分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和质控线的颜色深浅读取 结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。(4)成本低，易推广。本实用新型试剂板生产工艺简单，流程成熟。生产成本低廉， 投资少，收效快。
图1为三聚氰胺免疫胶体金快速检测试剂板背衬结构示意图，其中1为样品垫，2 为胶金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC 底板。图2为三聚氰胺免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控 制区，T为检测区。图3为三聚氰胺免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T 为检测区。
具体实施方式
本实用新型试剂板的制备包括三聚氰胺-BSA偶联物的制备，抗三聚氰胺单克隆 抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗三聚氰胺单克隆抗体的制备和三聚氰胺免 疫胶体金快速检测试剂板的组装。1.三聚氰胺与载体蛋白的偶联采用戊二醛法将三聚氰胺与载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原。称取48mg 三聚氰胺溶于2mL水中，用IOmLPB缓冲液(0. lmol/LPH6. 0)溶解50mg牛血清白蛋白，加入 到上述溶液中，再缓慢加入ImLlO %戊二醛溶液，将混合溶液室温下搅拌2h，双蒸水透析5 天，滤膜过滤后，收集。2.抗三聚氰胺单克隆抗体的制备[0027]取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的三聚氰胺-BSA偶联物与等体积的 弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐 剂替代完全佐剂进行腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合 按常规方法进行将Sp20多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 10的比例混合，在50% PEG作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C、5% C02培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初 筛选择10mg/L三聚氰胺-OVA偶联物包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊 抗鼠IgG-HRPd 1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用三聚氰胺-OVA偶联物包被的酶 联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X 10_3mOl/L三聚氰胺溶液等量混合，37°C 感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS (0. Olmol/L、pH7. 4)替代三聚氰胺溶液作对 照，其余步骤同上。若三聚氰胺阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经 2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X IO5Hir1时停止换液，细胞 全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆 化细胞株IO7个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImLl %柠 檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗三聚氰胺单克隆抗体的制备取已制备好的IOOmL胶体金溶液，用0. lmol/L碳酸钾溶液调pH到8. 0。边搅拌 边加入1. 5mg抗三聚氰胺单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL25mol/L聚乙二醇20000 (PEG 20000)，搅拌15min。20，OOOrpm离心15min，弃上清液，加入IOmL pH 7. 4PBS缓冲液(含 0. 4mol/LPEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH7. 4)溶解，用0. 22 μ m 无菌过滤器过滤后，4 0C保存备用。5.三聚氰胺免疫胶体金快速检测试剂板的组装参照图1，用点膜机把适当浓度的三聚氰胺-BSA偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤 维素膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记三 聚氰胺单克隆抗体包被在胶金结合垫上。检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素 膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂 板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。6.三聚氰胺免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法6. 1样品制备成品饲料及饲料原料的样品处理方法称取待测样品2. 5g放入50ml带盖离心管中，加入三聚氰胺专用PBST缓冲液 7. 5ml，盖紧盖子充分混勻3min。室温静置30min，3000转/分离心5分钟，取上清液待检。牛奶的样品处理方法取400 μ L三聚氰胺专用PBST缓冲液加入洁净的1. 5mL离心管中；用滴管吸取3 滴(约ΙΟΟμ 牛奶加入离心管中，混合均勻。吸取混合溶液待检。[0043]当检测样本为奶粉时，称取少量奶粉，按照奶粉水(Ig 8mL)的比例溶解到水 中，取3滴(约100 μ L)溶解好的样本，后续步骤同牛奶样品处理方法。6. 2检测步骤从包装袋中取出试剂板，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100 μ L)， 加样后开始计时，结果应在3 5min读取，其他时间判读无效。6. 3结果判读读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。阴性(-):T线显色比C线深或一样深，表明样品中三聚氰胺浓度低于2mg/kg或无 三聚氰胺残留。如图3. a所示。阳性⑴T线显色比C线浅，或T线无显色，表明样品中三聚氰胺浓度高于2mg/ kg ；T线比C线越浅，表明样品中三聚氰胺浓度越高。如图3. b所示。无效未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新试 剂板重新测试。如图3. c所示。
权利要求一种检测三聚氰胺的免疫胶体金试剂板，其特征在于试剂板背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有1 2mm的重叠。
2.如权利要求1所说的试剂板，其特征在于硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依 次喷有检测线和质控线。
3.如权利要求1所说的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为30nm。
4.如权利要求1所说的试剂板，其特征在于硝酸纤维素膜上包被有三聚氰胺载体蛋白 偶联物，偶联三聚氰胺的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白。
5.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于背衬为一面涂有不干胶的PVC板，样品垫 由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。
专利摘要本实用新型涉及一种检测三聚氰胺的免疫胶体金试剂板，可用于检测成品饲料以及饲料原料和牛奶中三聚氰胺残留。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需5～10min，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合广大基层部门对饲料以及牛奶中的三聚氰胺进行大规模快速检测。
文档编号G01N33/52GK201724941SQ20102010799
公开日2011年1月26日 申请日期2010年2月1日 优先权日2010年2月1日
发明者卜令杰, 张少恩, 桑丽雅, 邵伟 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司