专利名称：荧光检测装置及荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及一种对分析对象物上附着荧光色素的测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理的荧光检测装置及荧光检测方法。
背景技术：
流式细胞仪在医疗、生物领域中广泛应用。该流式细胞仪用光电倍增管或者雪崩光电二极管等光电转换器接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并分析细胞或者基因等测量对象物的种类或频率或特性。具体来说，流式细胞仪用荧光试剂将细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等的活体物质等的分析对象物标签化而制作测量对象物，且施加压力使测量对象物在以每秒大约IOm以内的速度在管道内流动的鞘液中流动，由此形成分层鞘流。通过流式细胞仪向该流动中的测量对象物照射激光，由此流式细胞仪接收分析对象物上附着的荧光色素发出的荧光，并将该荧光作为标签进行识别，由此特定分析对象物。该流式细胞仪例如能够测出细胞内的DNA、RNA、酶、蛋白质等的细胞内的相对量， 并能够在短时间内分析这些对象物的作用。另外，流式细胞仪通过荧光判别特定类型的细胞或者染色体，并且用细胞分类器等仅对已判别的细胞或者染色体，以活着的状态下在短时间内进行分选收集。在该流式细胞仪的使用中，要求在短时间内根据荧光信息对更多的测量对象物进行正确特定。在特开2006-2^698号公报中记载有通过计算出通过激光照射与测量对象物结合的荧光色素发出的荧光的荧光寿命(荧光弛豫时间)，能够在短时间内对更多的测量对象物进行正确特定的荧光检测装置及方法。该公报记载了以下内容荧光检测装置对激光进行强度调制并将其照射在测量对象物上，并求出从测量对象物发出的荧光的荧光信号相对于用于激光强度调制的调制信号的相位滞后，并根据该相位滞后计算出荧光弛豫时间。但是，测量对象物发出的荧光，除了包括与细胞等分析对象物结合的荧光色素发出的荧光之外，还包括细胞等分析对象物自身发出的自发荧光。大部分情况下这样的自发荧光的荧光强度相比于荧光色素发出的荧光的荧光强度小，但也有接收的荧光色素发出的荧光的荧光强度小的情况。这样的情况下，无法忽视接收的自发荧光的影响，会导致无法正确计算出相位滞后，进一步无法正确计算出荧光弛豫时间。
发明内容
因此，本发明的目的在于，为了解决上述课题，提供一种荧光检测装置及荧光检测方法。其中，在对分析对象物上附着荧光色素的测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理时，能够计算出高精度的荧光弛豫时间。本发明的一个实施方式涉及荧光检测装置，其中，对分析对象物上至少附着一个荧光色素的测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理。该装置包括光源部，利用频率的调制信号对第一激光进行强度调制，并利用与频率1不同的频率f2的调制信号对第二激光进行强度调制，以发射出调制的所述第一激光以及调制的所述第二激光；受光部，包括将被所述第一激光以及所述第二激光照射所发出的测量对象物的荧光在第一波段接收并输出第一荧光信号的第一受光元件，和在与所述第一波段不同的第二波段接收所述测量对象物的所述荧光并输出第二荧光信号的第二受光元件；第一处理部，通过将所述第一荧光信号与所述频率的调制信号混合，生成包括相位信息以及强度信息的第一荧光数据P1，通过将所述的第二荧光信号与所述频率f2的调制信号混合，生成包括相位信息以及强度信息的第二荧光数据P2 ；第二处理部，利用从所述第一荧光数据Pl乘以第一常数的结果减去第二荧光数据P2乘以第二常数的结果得到的荧光数据，计算出所述荧光色素的荧光弛豫时间。本发明的其它实施方式涉及荧光检测方法，其中，对分析对象物上附着荧光色素的测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理。该方法是对分析对象物上附着荧光色素的测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理的荧光检测方法，该检测方法包括下述步骤利用频率f\的调制信号对第一激光进行强度调制，且利用与频率fi不同的频率f2 的调制信号对第二激光进行强度调制，以输出调制的所述第一激光以及所述第二激光；在第一波段接收测量对象物受到所述第一激光以及所述第二激光照射后发出的荧光，并输出第一荧光信号，且在与所述第一波段不同的第二波段接收所述测量对象物的所述荧光，并输出第二荧光信号；通过将所述第一荧光信号与所述频率的调制信号混合，生成包括相位信息以及强度信息的第一荧光数据P1，通过将所述第二荧光信号与所述频率f2的调制信号混合，生成包括相位信息以及强度信息的第二荧光数据P2 ；利用从所述第一荧光数据P1乘以第一常数的结果减去第二荧光数据P2乘以第二常数的结果得到的荧光数据，计算出所述荧光色素的荧光弛豫时间。在上述实施方式的荧光检测装置及荧光检测方法中，对测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理时，可以计算出高精度的荧光弛豫时间。
图1是采用本发明的强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪的一个例的概略构成图；图2是用于图1所示的流式细胞仪光源部的一个例的概略构成图；图3是用于图1所示的流式细胞仪受光部的一个例的概略构成图；图4是用于图1所示的流式细胞仪控制和处理部的一个例的概略构成图；图5是用于图1所示的流式细胞仪分析装置的一个例的概略构成图。附图标记说明10 流式细胞仪
12 样品20 信号处理装置22:激光光源部22a,22b 光源23a,26b 分色镜23bJ6a:透镜系统24,26 受光部26ci,26c2 带通滤波器27a、27b 光电转换器28 控制和处理部30 管道32:回收容器3乜、34b:激光驱动器40 信号生成部42 信号处理部44 信号控制部46a、46b 振荡器48a、48b 功率分配器50a、50b、52a、52b、54a、54b、64 放大器58a、58b :IQ 混频器60 系统控制器62 低通滤波器66:A/D 转换器80 分析装置82 =CPU84 存储器86:自发荧光除去部88 荧光信号校正部90 荧光强度计算部92 相位滞后计算部94 荧光弛豫时间计算部
具体实施例方式以下，关于优选使用本发明的强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪进行详细说明。图1是采用本发明的强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪10的概略构成图。流式细胞仪10包括信号处理装置20和分析装置(计算机)80。信号处理装置20朝向作为测量对象的样品12照射激光，并对样品12发出的荧光的荧光信号进行检测以进行信号处理。分析装置(计算机)80根据信号处理装置20中得到的处理结果，计算出荧光强度或者荧光弛豫时间。作为样品12的例子，以下，利用由在细胞(分析对象物) 上附着荧光蛋白(荧光色素U1来构成的测量对象物进行说明。在本实施方式中，除了荧光蛋白之外还可以用其它的荧光色素。分析对象物也是，除了细胞之外，还可以用DNA、RNA、酶、蛋白等活体物质，除此之外还可以用人工制造的发出荧光的微球(Micro-beads)。另外，图1所示的样品12的构成为荧光蛋白&通过丝带等附着在细胞)(2上，但是这仅仅是模式化的表示。 样品12的构成，例如，也可以是荧光蛋白&进入细胞)(2内，形成荧光蛋白&被注入到细胞 X2内并分散的构成。另外，附着于细胞\的荧光蛋白&不限定于一个，也可以是多个。信号处理装置20包括激光光源部22、受光部M，沈、控制和处理部观、管道30。控制和处理部28包括控制部，对从激光光源部22发射的激光按照特定频率进行强度调节；信号处理部，对样品12发出的荧光的荧光信号进行信号处理。在管道30中，使样品12包括在形成高速流的鞘液中一起流动，由此形成样品12的流动。在管道30的出口处设置有回收容器32。在流式细胞仪10的构成中也可以配置用来通过激光照射在短时间内分离出样品12中的特定细胞等活体物质的细胞分类器，以将其分离于各自的回收容器中。激光光源部22是发射两束不同波长激光的部分。透镜系统按照使激光聚焦在管道30中规定位置的方式设置，并在该聚焦位置上形成样品12的测量点。图2是表示激光光源部22构成的一个例的图。激光光源部22发射具有可见光区域波长且进行强度调制的激光。激光光源部22包括光源2 和光源22b。光源22a，具有荧光蛋白&的光吸收特性(光吸收系数)相比于细胞(分析对象物) 的光吸收特性(光吸收系数)处于高位置的波段内波长的第一激光L1作为CW(连续波)激光发射，且用特定频率的调制信号对该 CW激光L1强度进行强度调制。光源22b，具有荧光蛋白&的光吸收特性(光吸收系数)相比于细胞(分析对象物) 的光吸收特性(光吸收系数)处于低位置的波段内波长的第二激光L2作为CW(连续波)激光发射，且用特定频率f2的调制信号对该CW激光L2的强度进行强度调制。进一步，激光光源部22包括分色镜23a、透镜系统23b、激光驱动器!Ma以及1Mb。 另外，代替分色镜23a，可以用半透明反射镜。分色镜23a使特定波段的激光透射，使其它波段的激光反射。透镜系统2 使由激光L1和L2构成的激光LJL2聚焦在管道30中的测量点上。激光驱动器3 和34b分别驱动光源2 和光源22b。作为发射这样的激光的光源，例如，可以利用半导体激光器。激光的输出功率是例如5 lOOmW。另一方面，用于对激光L1和L2进行强度调制的频率(调制频率)，其周期与荧光弛豫时间相比稍长，例如10 50MHz。对激光L1和L2进行强度调制的频率不同。这是因为， 通过使被激光激发的样品12发出的荧光的频率互为不同，信号处理装置20得知所接收的荧光来自哪个激光的激发而产生的荧光，并分离荧光信号。分色镜23a透射激光L1、反射激光L2。通过该构成激光L1和L2被合成而形成为照射测量点样品12的一束照射光。光源22a、22b在预先规定好的波段振荡，以使激光LpL2通过激发荧光色素使其发射出特定波段的荧光。当被激光LpL2激发的样品12通过管道30的测量点时，在测量点受到激光Lp L2照射后荧光蛋白&发射特定波长的荧光，同时细胞\也发射自发荧光。受光部M按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置。受光部 M包括光电转换器，通过在测量点上通过的样品12使激光发生前向散射，由此输出样品12 正通过测量点情况的检测信号。从该受光部M输出的检测信号被供给到控制和处理部观和分析装置80，用作通知样品12正通过管道30测量点的时间的触发信号、处理开始的ON 和OFF信号。另一方面，受光部沈配置在相对于从激光光源部22发射的激光发射方向垂直的方向且相对于管道30中样品12的移动方向垂直的方向，并包括多个光电转换器，以用来接收样品12在测量点被激光照射后发出的荧光。图3是受光部沈一个例的概略构成图。图3所示的受光部沈包括对来自样品12的荧光信号进行聚焦的透镜系统^a、 分色镜^b、带通滤波器^ci、26c2、光电倍增管等光电转换器(受光元件)元件27a、27b。透镜系统26a按照使入射至受光部沈的荧光在光电转换器27a、27b受光面上聚焦的方式构成。分色镜^b反射规定范围波段的荧光，透射其它波段的荧光。按照用带通滤波器 26ci,26c2过滤后光电转换器27a、27b捕获规定波段的荧光的方式设定分色镜^b的反射波段以及带通滤波器^Cl、26c2的透射波段。带通滤波器^c1、26C2设置在各光电转换器27a、27b的受光面前面，仅透射具有规定波段的荧光。透射的荧光波段R1和&分别设定成对应于荧光蛋白&发出的荧光和细胞 &发出的自发荧光的波段。波段是例如为，用来主要接收被从光源2 发射的波长为408nm 的激光L1照射后发出的荧光的波长为474nm 514nm波段队。另外，波段是例如为，用于主要接收被从光源22b发射的波长为455nm的激光L2照射后发出的荧光的波长为530nm 570nm 波段 Ii2。此时，优选的是，波段R1的荧光蛋白&发出的荧光的荧光强度和细胞)(2发出的荧光的荧光强度之比，与波段民的荧光蛋白&发出的荧光的荧光强度和细胞)(2发出的荧光的荧光强度之比不同。例如，波段R1优选按照在被激光L1照射的样品12中荧光蛋白&发出的荧光的荧光强度相对于细胞&发出的自发荧光的荧光强度高的方式对应于荧光蛋白&设定。此时， 波段&优选按照在被激光L2照射的样品12中细胞&发出的自发荧光的荧光强度相对于荧光蛋白&发出的荧光的荧光强度高的方式对应于自发荧光设定。自发荧光是指，成为荧光测量对象的荧光色素以外的部分发生荧光，并其成为背景噪音妨碍荧光测量的荧光，并指没有被染色的细胞等自发的、在较宽波段上分布的荧光。光电转换器27a、27b是例如包括光电倍增管等传感器、并将光电面上接收的光转换成电信号的受光元件。在这里，所接收的荧光是基于用特定频率进行强度调制的激光激发的荧光，输出的荧光信号也是用特定频率改变强度的信号。该荧光信号被供给到控制和处理部28。如图4所示，控制和处理部28包括信号生成部40、信号处理部42、信号控制部44。信号生成部40生成用于对激光Lp L2的强度用特定频率进行调制的调制信号。
具体地说，信号生成部40包括振荡器46a、46b、功率分配器48a、48b以及放大器 50a、50b、52a、52b。信号生成部40将生成的各调制信号供给到激光光源部22的激光驱动器34a、34b，同时供给到信号处理部42。如后述，将调制信号供给到信号处理部42是用作对从光电转换器27a、27b输出的荧光信号进行检波的参照信号。另外，调制信号是在DC成分上载有特定频率的正弦波信号的信号，其频率范围设定成IOMHz 50MHz。振荡器46a和振荡器46b振荡不同频率f\、f2的信号，并生成具有不同频率的调制信号。信号处理部42利用从光电转换器27a、27b输出的荧光信号，获取被激光照射后所发出的荧光相位滞后信息。信号处理部42包括放大器Ma、Mb、IQ混频器58a、58b、低通滤波器62。放大器Ma、54b将从光电转换器27a、27b输出的荧光信号放大。IQ混频器58a、58b是将从光电转换器27a、27b供给的荧光信号与从信号生成部 40供给的调制信号作为参照信号混合的装置。具体地说，IQ混频器58a，58b各自将参照信号与荧光信号(RF信号)相乘，并各自生成荧光信号的、包括与调制信号相位相同的成分的 I信号和荧光信号的、包括相对于调制信号相位90度位移的成分的Q信号。包括相位相同的成分的I信号是通过调制信号和荧光信号混合生成，包括相位90度位移的成分的Q信号是通过相位90度位移的调制信号和荧光信号混合生成。由此，被激光L2激发而在波段R1 中接收的荧光的荧光信号被除去，并被激光L1激发而在波段&中接收的荧光的荧光信号被除去。低通滤波器62是过滤在IQ混频器58a、58b中生成的I信号、Q信号的低频率信号的部分。通过过滤，荧光信号的、与调制信号相位相同的成分(Re成分)和荧光信号的、 相对于调制信号相位90度位移的成分am成分)作为荧光数据被提取。被提取的各成分送到信号控制部44。Re成分以及Lii成分分别在光电转换器27a、27b上设定的波段R1以及波段&中得到，因此波段R1的Re成分以及Lii成分的组和波段&的Re成分以及Lii成分的组送到信号控制部44。下面，IQ混频器58a、58b的混合处理和低通滤波器62的过滤处理统称为降频转换处理、通过该处理所得到的数据称为荧光数据。信号控制部44放大从信号处理部42送来的荧光信号的Re成分以及Lii成分，并进行AD转换。具体地说，信号控制部44包括系统控制器60，下达用于控制各部分动作的指令， 且管理流式细胞仪10的整个动作；放大器64，放大信号处理部42生成的Re成分以及Lii成分；A/D转换器66，对被放大的Re成分以及Lii成分进行抽样。分析装置80根据在信号控制部44中通过AD转换而得到的Re成分和Lii成分， 求出相对于激光的荧光相位滞后角，进一步地，根据该相位滞后角求出荧光弛豫时间常数 (荧光弛豫时间)以及荧光强度。图5为表示分析装置80的概略构成图。分析装置80由包括CPU82以及存储器84的计算机构成。分析装置80进一步包括自发荧光除去部86、荧光强度计算部90、相位滞后计算部92、荧光弛豫时间计算部94。这些部分是通过启动计算机上的软件发挥其功能的软件模块。当然，这些部分可以由专用电路构成。自发荧光除去部86是利用从信号控制部44供给的Re成分和加成分除去细胞\ 发出的自发荧光并计算出荧光蛋白&发出的荧光的荧光数据的部分。供给到分析装置80的Re成分以及Lii成分包括被激光L1激发的荧光蛋白&发出的荧光和细胞\发出的自发荧光通过在波段Rl中被接收而得到的信息、以及被激光L2 激发的荧光蛋白&发出的荧光和细胞&发出的自发荧光通过在波段&中接收而得到的信息。因此，分析装置80为了计算出被激光L1激发的荧光蛋白\发出的荧光信息，从被测量的荧光数据中除去细胞\发出的自发荧光信息。具体地说，分析装置80将以下四个荧光数据预先求出并存储，并利用这些荧光数据和从信号控制部44供给的Re成分和Lii成分的荧光数据，从测量的荧光数据中除去细胞 X2发出的自发荧光，由此计算出荧光蛋白\发出的荧光的荧光数据。即，在流式细胞仪10中，荧光蛋白\和细胞&各自作为样品在管道30中流动，信号处理装置20在波段(第一波段)R1和波段(第二波段) 中接收荧光蛋白&发出的荧光(第一荧光)和细胞&发出的荧光(第二荧光)。此时，信号处理装置20将波段R1的荧光信号和波段&的荧光信号分别用频率的调制信号和频率f2的调制信号进行混合处理和过滤处理，即进行降频转换处理。由此，分析装置80得到包括相位信息以及强度信息的四个荧光数据。更加具体地说明的话，在波段R1中接收荧光蛋白&发出的荧光而得到的荧光信号通过频率4的调制信号进行混合处理所生成的荧光数据(第三荧光数据)用A3表示。在波段&中接收荧光蛋白&发出的荧光而得到的荧光信号通过频率f2的调制信号进行混合处理所生成的荧光数据(第五荧光数据)用A5表示。进一步，在波段R1中接收细胞)(2发出的荧光而得到荧光信号通过频率的调制信号进行混合处理所生成的荧光数据(第四荧光数据)用A4表示。在波段&中接收细胞&发出的荧光而得到的荧光信号通过频率f2 的调制信号进行信号处理所生成的荧光数据(第六荧光数据)用A6表示。这些荧光数据 A3 A6被表示为包括Re成分和Lii成分的值的复数。这些复数预先存储于分析装置80中。另外，在本实施方式中，荧光数据A3 A6的值是分别将荧光蛋白&和细胞作为样品在管道30中流动而求出的值。但是，还可以是，利用分别适合于荧光蛋白&和细胞& 的滤波器进行荧光数据的正确测量，对该测量结果，利用用于流式细胞仪10的滤波器特性进行校正，预先求出荧光数据A3 A6的值，并存储于分析装置80中。另外，还可以利用其它装置进行测量。该状态下，从信号控制部44供给的对应于频率的荧光数据，即用频率的调制信号进行混合处理而得到的Re成分和Lii成分用复数表示的荧光数据用P1表示。另一方面，从信号控制部44供给的对应于频率f2的荧光数据，即用频率f2的调制信号进行混合处理而得到的Re成分和Lii成分用复数表示的荧光数据用P2表示。此时，荧光蛋白&发出的荧光和除去细胞)(2发出的自发荧光的荧光数据P，利用下述式(1)计算出。P = (A3A4) / {(A3A4) - (A5A6)} · P1- (A3A6) / {(A3A4) - (A5A6)} · P2 (1)在这里，式⑴中的(a3/A4)/{(A3/A4)-(A5/A6)}是关联到第一荧光数据Pl的第一常数，(VA6)/{(VA4)-(VA6)}是关联到第二荧光数据P2的第二常数。如此地，通过从上述第一荧光数据P1乘以第一常数的结果减去第二荧光数据I32乘以第二常数的结果得到荧光数据P。另外，第一常数以及第二常数根据荧光数据A3 A6而确定。利用上述式(1)能够除去自发荧光的荧光数据是基于以下方面的考虑。
通常，按照细胞)(2上附着荧光蛋白&的方式构成的样品12除了荧光蛋白&发出荧光之外还发出自发荧光。因此，利用在波段R1中生成的荧光信号和频率的调制信号生成的荧光数据P1可以用通过荧光蛋白&发出的荧光的荧光数据P1X1’和通过细胞&发出的自发荧光的荧光数据Pix2’的加法来表示。同样，利用在波段&中生成的荧光信号和频率f2 的调制信号生成的荧光数据P2可以用通过荧光蛋白&发出的荧光的荧光数据P2xi’和通过细胞&发出的自发荧光的荧光数据P2x2’的加法来表示。进一步，根据通过激光L1和激光L2收敛的测量点的样品12的宽度方向的通过位置，所通过的每一个样品12上荧光强度变动。例如，通过测量点的样品12通过照射光的端部(激光强度低的部分)，后续通过的其它样品12通过照射光的中心部分(激光强度最大的部分)。这样的荧光强度变动的变动系数用C(0以上且小于1)表示，将样品12通过照射光的中心部分时的荧光数据用对应于各荧光数据Pixi’、Pix2’以荧光数据P1X1、P1X2表示时，可以用下述式O)、(3)表示。另外，在荧光蛋白&发出的荧光中，假设相对于一个细胞)(2有多个(η个)焚光蛋白&发出荧光，并表示为η · Plxl，η · P2xl。P1 = C · (η · Ρ1Χ1+Ρ1Χ2)(2)P2 = C · (η · Ρ2Χ1+Ρ2Χ2)(3)在这里，式O)中的Pm、P1X2对应于上述的荧光数据Α3、Α4，式(3)中的Ρ2Χ1、Ρ2Χ2对应于上述荧光数据Α5、Α6。这些荧光数据A3 A6的值预先存储在分析装置80上。因此，利用式( 、(；3)可以定C、n。另一方面，应该根据荧光数据Pl计算出的通过激光Ll激发荧光蛋白Xl发出的荧光数据是On· Pixi，因此如果将该On· Pixi用荧光数据A3 A6和P1、 P2表示，就是上述式(1)。如此地，式(1)中，考虑根据通过测量点的样品12的通过位置荧光强度变动，且还要考虑相对于一个细胞\多个荧光色素&发出的荧光，由此可以除去自发荧光，并能够计算出仅荧光蛋白&发出的荧光的荧光数据。荧光强度计算部90针对通过自发荧光除去部86计算出的荧光蛋白&的荧光数据P，通过求出复数的绝对值，计算出荧光蛋白&的荧光强度。相位滞后计算部92针对通过自发荧光除去部86计算出的荧光蛋白&的荧光数据P，将复数的辐角(tan—1 (荧光数据的Lii成分/荧光数据Re成分))，作为相位滞后角θ 计算出。荧光弛豫时间计算部94利用通过相位滞后计算部92计算出的θ，将荧光蛋白\ 的荧光弛豫时间τ根据式τ = 1/(2^1^) · tan ( θ )计算出。在这里，是用于对激光L1 进行强度调制的频率。能够通过式τ = 1/(2^1^) - tan(9)算出荧光弛豫时间τ是由于荧光现象表示随着一次弛豫过程的变化。计算出的荧光蛋白&的荧光强度、相位滞后角θ以及荧光弛豫时间τ是作为结果信息在未图示的打印机或者显示器上输出。另外，该结果信息作为样品12通过管道30 的测量点时测量的结果，可作为统计处理对象。流式细胞仪10的构成如上面所述。接着，关于用流式细胞仪10进行的荧光检测方法进行说明。首先，在流式细胞仪10中，针对荧光蛋白&以及细胞)(2，将按照一方的光吸收相对于另一方的光吸收高的方式准备的多个波长的激光Lp L2用不同的多个频率(f1; f2)进行强度调制后作为照射光从光源部22射出。接着，具有波段R1以及&的受光部沈接收荧光并输出荧光信号。此时，优选的是，波段R1中的、荧光蛋白&发出的荧光强度和细胞)(2发出的荧光的荧光强度之比与波段&中的、荧光蛋白&发出的荧光的荧光强度和细胞)(2发出的荧光的荧光强度之比不同。例如，优选的是，按照在波段R1中、荧光蛋白&以及细胞)(2中一方的荧光的荧光强度相对于另一方的荧光的荧光强度高，而在波段&中、所述一方的荧光的荧光强度相对于所述另一方的荧光的荧光强度低的方式设定波段R1以及&。控制和处理部观通过各输出的荧光信号与对激光LpL2进行强度调制的调制信号的混合，生成包括荧光信号相对于调制信号的相位滞后角和强度振幅的荧光数据Pp P2。分析装置80将生成的荧光数据P1I2代入到上述式(1)来计算出荧光数据P。该荧光数据P是荧光蛋白\发出的荧光的荧光数据，是已除去细胞&发出的自发荧光的荧光数据。进一步，分析装置80利用该荧光数据P计算出荧光蛋白\发出的荧光的荧光强度、 相位滞后角θ以及荧光弛豫时间τ。另外，用于式(1)的荧光数据A3 A6的值是存储于分析装置80的值。这些值是预先利用流式细胞仪10将荧光蛋白^c1以及细胞单独或者一起测量后得到的值。如此地，分析装置80在计算出荧光弛豫时间τ之前，从荧光数据中可以除去细胞 )(2发出的自发荧光的荧光数据，因此计算出的荧光弛豫时间τ精度高。本实施方式利用两个具有不同波长的激光，一方的激光相比另一方的激光荧光色素的吸收特性低，因此可以除去分析对象物发出的自发荧光。此时，作为优选的实施方式， 用于计算荧光数据的第一常数以及第二常数通过利用通过将荧光色素以及分析对象物分别测量所得到的四个荧光数据而确定。此时，由于利用第一常数以及第二常数和在相同的激光激发条件和相同的受光条件下所得到的荧光数据P1、Ρ2，因此可以除去根据测量对象物通过测量点的通过位置荧光数据变动的变动原因。以上，关于本发明的荧光检测装置以及荧光检测方法进行了说明，但是本发明不仅限定于上述实施方式，在不脱离本发明的主要思想的情况下，可以进行各种各样的改进或者变更。
权利要求
1.一种荧光检测装置，该装置对分析对象物上至少附着一个荧光色素的测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理，该检测装置包括光源部，利用频率的调制信号对第一激光进行强度调制，且利用与频率&不同的频率&的调制信号对第二激光进行强度调制，以发射出调制的所述第一激光以及调制的所述第二激光；受光部，包括第一受光元件，在第一波段接收被所述第一激光以及所述第二激光照射所发出的测量对象物的荧光，并输出第一荧光信号；第二受光元件，在与所述第一波段不同的第二波段接收所述测量对象物的所述荧光，并输出第二荧光信号；第一处理部，通过将所述第一荧光信号与所述频率的调制信号混合，生成包括相位信息以及强度信息的第一荧光数据P1，通过将所述第二荧光信号与所述频率f2的调制信号混合，生成包括相位信息以及强度信息的第二荧光数据P2 ；第二处理部，利用从所述第一荧光数据P1乘以第一常数的结果减去第二荧光数据P2乘以第二常数的结果得到荧光数据，计算出所述荧光色素的荧光弛豫时间。
2.根据权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于所述第一激光具有所述荧光色素的光吸收特性相对于所述分析对象物的光吸收特性高的波段内的波长，所述第二激光具有所述荧光色素的光吸收特性相对于所述分析对象物的光吸收特性低的波段内的波长。
3.根据权利要求1或者2所述的荧光检测装置，其特征在于所述第一波段中的、所述荧光色素发出的荧光的荧光强度与所述分析对象物发出的荧光的荧光强度之比和所述第二波段中的、所述荧光色素发出的荧光的荧光强度与所述分析对象物发出的荧光的荧光强度之比不同。
4.根据权利要求1至3任一项所述的荧光检测装置，其特征在于所述第二处理部预先存储通过在第一波段分别接收所述荧光色素发出的第一荧光和所述分析对象物发出的第二荧光而得到的两个荧光信号与所述频率f\的调制信号混合所生成的包括相位信息以及强度信息的两个荧光数据A3、A4 ；且预先存储通过在第二波段分别接收所述荧光色素发出的第一荧光和所述分析对象物发出的第二荧光而得到的两个荧光信号与所述频率f2的调制信号混合所生成的包括相位信息以及强度信息的两个荧光数据 A5、A6，在计算所述荧光弛豫时间时，所述第一常数以及所述第二常数根据已存储的所述荧光数据A3、A4、A5、A6而确定。
5.根据权利要求2所述的荧光检测装置，其特征在于所述第二处理部利用将所述荧光数据A3、A4、A5、A6代入到下述式而计算出的荧光数据P，计算出荧光弛豫时间。P = (A3A4)/{(A3A4)-(VA6)} · P1 -(A3A6)/{(A3A4)-(A5A6)I · P2
6.根据权利要求1至5任一项所述的荧光检测装置，其特征在于所述测量对象物的荧光包括所述荧光色素发出的荧光和所述分析对象物自身发出的自发荧光。
7.根据权利要求6所述的荧光检测装置，其特征在于所述分析对象物是活体物质。
8.一种荧光检测方法，对分析对象物上附着荧光色素的测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理，该检测方法包括下述步骤利用频率的调制信号对第一激光进行强度调制，且利用与频率f\不同的频率f2的调制信号对第二激光进行强度调制，以输出调制的所述第一激光以及所述第二激光；在第一波段接收测量对象物受到所述第一激光以及所述第二激光照射后发出的荧光， 并输出第一荧光信号，且在与所述第一波段不同的第二波段接收所述测量对象物的所述荧光，并输出第二荧光信号；通过将所述第一荧光信号与所述频率的调制信号混合，生成包括相位信息以及强度信息的第一荧光数据P1，通过将所述第二荧光信号与所述频率f2的调制信号混合，生成包括相位信息以及强度信息的第二荧光数据P2 ；利用从所述第一荧光数据P1乘以第一常数的结果减去第二荧光数据P2乘以第二常数的结果得到荧光数据，计算出所述荧光色素的荧光弛豫时间。
9.根据权利要求8所述的荧光检测方法，其特征在于所述第一激光具有所述荧光色素的光吸收特性相对于所述分析对象物的光吸收特性高的波段内的波长，所述第二激光具有所述荧光色素的光吸收特性相对于所述分析对象物的光吸收特性低的波段内的波长。
10.根据权利要求8或者9所述的荧光检测方法，其特征在于所述第一波段中的、所述荧光色素发出的荧光的荧光强度与所述分析对象物发出的荧光的荧光强度之比和所述第二波段中的、所述荧光色素发出的荧光的荧光强度与所述分析对象物发出的荧光的荧光强度之比不同。
11.根据权利要求8至10任一项所述的荧光检测方法，其特征在于 所述第一常数以及所述第二常数根据预先得到的四个荧光数据而确定， 所述荧光检测方法包括为得到所述四个荧光数据的步骤，该步骤包括通过在第一波段分别接收所述荧光色素发出的第一荧光和所述分析对象物发出的第二荧光而得到的两个荧光信号与所述频率f\的调制信号混合，求出包括相位信息以及强度信息的两个荧光数据A3、A4，并将其存储；通过在第二波段分别接收所述荧光色素发出的第一荧光和所述分析对象物发出的第二荧光而得到的两个荧光信号与所述频率f2的调制信号混合，求出包括相位信息以及强度信息的两个荧光数据A5、A6，并将其存储。
12.根据权利要求11所述的荧光检测方法，其特征在于所述第二处理部利用将所述荧光数据A3、A4、A5、A6代入到下述式而计算出的荧光数据P，计算出荧光弛豫时间。P = (A3A4)/{(A3A4)-(A5A6)I · P1 -(VA6)/{(VA4)-(A5A6)} ·Ρ2。
全文摘要
本发明提供一种荧光检测装置及荧光检测方法，在利用在分析对象物上附着荧光色素的测量对象物求出荧光色素的荧光弛豫时间时，对第一激光用频率f1的调制信号进行强度调制，且对第二激光用与频率f1不同的频率f2的调制信号进行强度调制，并发射出激光；在第一波段接收被激光照射后发出的测量对象物的荧光而得到第一荧光信号，在第二波段接收荧光而得到第二荧光信号；通过将第一荧光信号与频率f1的调制信号混合而生成第一荧光数据P1、通过将第二荧光信号与频率f2的调制信号混合而生成第二荧光数据P2；根据从第一荧光数据P1乘以第一常数的结果减去第二荧光数据P2乘以第二常数的结果所得到的荧光数据计算出荧光色素的荧光弛豫时间。
文档编号G01N21/64GK102272582SQ20108000385
公开日2011年12月7日 申请日期2010年1月4日 优先权日2009年1月9日
发明者土井恭二 申请人:三井造船株式会社