采用可检测蛋白质的细胞测定法的制作方法

专利名称：采用可检测蛋白质的细胞测定法的制作方法
采用可检测蛋白质的细胞测定法1.交叉引用本申请要求2009年4月24日提交的美国临时申请号61/172，680的权益，通过提及而将其公开内容完整收入本文。
2.发明领域本文中所提供的主题涉及检测蛋白质修饰领域，包括筛选和鉴定调控牵涉各种细胞过程的蛋白质的活性的化合物的方法。3.发明概述本文中提供了可用于例如测定牵涉细胞过程的蛋白质的活性的测定法。在一些实施方案中，使用核酸标签，且特别地通过检测核酸标签的存在来评估蛋白质的活性。例如， 可以使用此类测定法来研究测试化合物作为蛋白质活性的调控剂(modulator)，例如抑制齐U、激动剂和拮抗剂的效果。如此，在一方面，本文中提供了一种检测通过感兴趣的细胞过程修饰的蛋白质的方法，包括下列步骤(a)使包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质与以下接触 (i)抗体，其结合已经通过所述感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白；和(ii)核酸寡聚物，其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列；并(b)检测与可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物的存在，所述可检测蛋白质也被所述抗体结合；其中步骤(b)的结合的核酸寡聚物的存在指示通过所述感兴趣的细胞过程修饰的蛋白质的存在。在一些实施方案中，在步骤 (a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触前使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。在一些实施方案中，在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触后使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。在一些实施方案中，在步骤(a)中使所述可检测蛋白质与所述抗体和所述核酸寡聚物同时接触。在一些实施方案中，所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、 甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、 异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化(sumoylation)、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中，细胞过程是磷酸化。在一些实施方案中，所述靶蛋白是激酶底物。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。在一些实施方案中，所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(small chain variable fragment，scFv) 0在一些实施方案中，核酸相互作用基序是DNA结合域。在一些实施方案中，DNA结合域是NF- κ B DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、Iac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA 结合域、Lex-A DNA 结合域、0paque-2 (0paque-2) DNA 结合域或 TGAla DNA 结合域。在具体的实施方案中，核酸相互作用基序包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6中所描述的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。在另一方面，本文中提供了一种鉴定调控细胞过程的测试化合物的方法，其中所述细胞过程修饰靶蛋白，所述方法包括下列步骤(a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触，其中所述可检测蛋白质包含所述靶蛋白和核酸相互作用基序； (b)使所述可检测蛋白质与以下接触(i)抗体，其特异性结合已经由于所述细胞过程而修饰过的所述靶蛋白；和(ii)核酸寡聚物，其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列； 并(c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物的量，所述可检测蛋白质也被所述抗体结合；其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加或减少指示所述测试化合物调控所述细胞过程。在一些实施方案中，相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(C)的结合的核酸寡聚物量的增加指示所述测试化合物使所述细胞过程激动(agonize the cellular process)。在一些实施方案中，相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的减少指示所述测试化合物抑制所述细胞过程。在一些实施方案中，步骤(a)包括使包含可检测蛋白质的细胞与测试化合物接触。在一些实施方案中，所述细胞瞬时表达所述可检测蛋白质。在一些实施方案中，所述细胞稳定表达所述可检测蛋白质。在一些实施方案中，所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、 甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、 异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中，细胞过程是磷酸化。在一些实施方案中，所述靶蛋白是激酶底物。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。在一些实施方案中，所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、 转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，核酸相互作用基序是DNA结合域。在一些实施方案中，DNA结合域是NF- κ B DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、Iac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、0paque_2 DNA结合域或TGAla DNA结合域。在具体的实施方案中，核酸相互作用基序包含SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中所描述的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。在一些实施方案中，所述激酶底物是Mekl，其中所述抗体特异性结合磷酸化的 Mekl，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与Braf抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内，相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，与Braf抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少，由此指示Braf抑制剂抑制Braf激酶活性，例如抑制MEKl的磷酸化。在一些实施方案中，所述Braf抑制剂选自BAY-43-9006、PLX-4720、Chir-265。在一些实施方案中，所述激酶底物是Aktl，且所述抗体结合磷酸化的Akt。在一些实施方案中，所述抗体结合Ser473或Thr308处磷酸化的Akt 1。在一些实施方案中，所述抗体结合Thr308处磷酸化的Akt 1。在一些实施方案中，所述抗体结合Ser473处磷酸化的 Aktl0在一些实施方案中，所述激酶底物是FRAPl或PDPK1，其中所述抗体分别特异性结合磷酸化的FRAPl或磷酸化的PDPK1，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PIK3CA抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内，相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，与PIK3CA抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少，由此指示PIK3CA抑制剂抑制PIK3CA激酶活性，例如分别抑制FRAPl或PDPKl的磷酸化。在一些实施方案中，PIK3CA 抑制剂选自 PI103、ZSTK-474、渥曼青霉素(wortmannin)和 PIK-93。在一些实施方案中，所述激酶底物是AKT1，其中所述抗体特异性结合磷酸化的 AKT1，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PDPKl、FRAP1或mTOR抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内，相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，与PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少，由此指示PDPK1、FRAP1或mTOR 抑制剂抑制PDPKl、FRAP1或mTOR激酶活性，例如抑制AKTl的磷酸化。在一些实施方案中， PDPKl抑制剂是BX-795。在一些实施方案中，所述激酶底物是F0X01，且所述抗体特异性结合磷酸化的 F0X01。在一些实施方案中，所述抗体结合Thr24处磷酸化的F0X01。在一些实施方案中，步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与AKTl抑制剂而非测试化合物接触。在一些实施方案中， Aktl 抑制剂是 GSK-690693。在一些实施方案中，本文中所提供的方法包括使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与至少两个浓度的测试化合物接触，并计算所述测试化合物的IC5(I。在一些实施方案中，所述核酸寡聚物包含(a)作为PCR扩增序列的第一核酸序列， 和(b)结合所述核酸相互作用基序的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列对于所述第二核酸序列而言是异源的。在一些实施方案中，本文中所提供的方法包括qPCR扩增与所述可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物。在一些实施方案中，所述核酸寡聚物是放射性标记的、荧光标记的或生物素化的。在本文中所提供的方法的一些实施方案中，所述抗体是固定于固体支持物上的。
8在一些实施方案中，所述抗体是固定于多孔板上的。在又一方面，本文中提供了一种试剂盒，其包含包含可检测蛋白质的细胞，其中所述可检测蛋白质包含可以通过细胞过程修饰的靶蛋白、核酸相互作用基序；和包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列的核酸寡聚物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含结合已经通过所述感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白的抗体。在一些实施方案中，所述细胞过程是磷酸化，且所述经修饰的靶蛋白是磷酸化的靶蛋白。4.附图简述

图1提供了描绘细胞测定法的示意图，所述细胞测定法利用包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质、结合已经通过细胞过程修饰过的靶蛋白的抗体、和包含结合核酸相互作用基序的核酸序列的核酸寡聚物。图2提供了 PIK3CA信号传导途径的图。图3至图7提供了多种化合物的剂量响应曲线，其中χ-轴表示按nM计的化合物浓度，而y-轴表示通过qPCR产生的信号，其按探针等同单位(PEU)计。图3提供了自磷酸-Mekl结合测定法获得的BAY-43-9006、PLX-4720、Chir_265禾口 CI-1040的剂量响应曲线。图4提供了自磷酸-Akt (Ser473)结合测定法和磷酸-Akt (Thr308)结合测定法获得的？1103、251￥-474、8乂-795、渥曼青霉素和？11(93的剂量响应曲线。图5提供了在磷酸-Aktl (Ser473)测定法中的BX-795、TG-100-115、根赤壳菌素 (radicicol)和曲西立滨(triciribine)的剂量响应曲线。图6提供了在磷酸-Aktl (Thr308)测定法中的根赤壳菌素和曲西立滨的剂量响应曲线。图 7 提供了在 AKTl-磷酸-F0X0(T24)测定法中的 GSK-690693、PI103 和 BX-795 的剂量响应曲线。5.发明详述5. 1 术语如本文中所使用的，术语“靶蛋白”指可以由于细胞过程，诸如本文中所描述的那些细胞过程而修饰的任何感兴趣的蛋白质。在一些实施方案中，通过具有酶或催化活性的蛋白质修饰靶蛋白。如本文中所使用的，术语“细胞过程”和“感兴趣的细胞过程”可互换使用，指细胞中发生的任何导致对细胞蛋白质的修饰的事件。在一些实施方案中，细胞过程发生在活细胞经历的过程期间，例如在摄取、转运、受体结合、代谢、融合、生物化学应答、细胞脱离 (detachment)、细胞迁移、细胞生长、坏死和凋亡期间。在其它实施方案中，细胞过程发生在肿瘤发生、转化和/或转移期间。在一些实施方案中，细胞过程导致具有催化或酶活性的蛋白质对蛋白质，例如靶蛋白的修饰。在其它实施方案中，细胞过程导致酶促或非酶促蛋白质修饰。在某些实施方案中，酶促或非酶促蛋白质修饰是共价修饰。在其它实施方案中，细胞过程导致酶促非共价蛋白质修饰，包括但不限于蛋白水解、外消旋化或异构化。在其它实施方案中，细胞过程导致非共价修饰，诸如蛋白质同或异二聚化或牵涉配体、生长因子、激素、 细胞因子、变构调控剂、辅因子、辅酶和第二信使的其它结合事件。例示性细胞过程包括但不限于酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、 蛋白水解、外消旋化和异构化。如此，如本文中所使用的，通过细胞过程修饰的蛋白质是经历修饰的蛋白质，所述修饰包括但不限于由于细胞过程所致的酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。如本文中所使用的，术语“抗体”和“免疫球蛋白”或“Ig”可以互换使用。如本文中所使用的，“抗体”可以是任何类型(例如IgG, IgE, IgM, IgD, IgA和IgY)、任何类别 (例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)、或任何亚类(例如，IgG2a 和 IgG2b)的免疫球蛋白分子，或其任何抗原识别(或抗原结合)片段。抗体可以是单克隆或多克隆的， 并且可以是任何起源物种的，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、马、或人，或者可以是嵌合抗体。参见例如 Walker 等，Molec. Immunol. 1989 ；26 403-411 ；Morrision 等，Proc. Nat，1. Acad. Sci. 1984 ；81 6851 ；Neuberger 等，Nature 1984 ；312 :604。抗体可以是依照美国专利No. 4，474，893 (Reading)或美国专利No. 4，816，567 (Cabilly等)中所披露的方法来生成的重组单克隆抗体。抗体也可以通过依照美国专利NO.4，676，980(Segel等)中所披露的方法生成的特定抗体来化学构建。本发明的抗体包括但不限于合成的抗体、单克隆抗体、重组生成的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、 细胞内抗体(intrabody)、单链Fv(ScFv)(例如，包括单特异性、双特异性，等等)、驼源化 (camelized)抗体、Fab片段、F(ab，)2片段、二硫化物连接的Fv (sdFv)、抗独特型(抗-Id) 抗体、和任何上述物的表位结合片段。特别地，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有免疫特异性结合例如经修饰的感兴趣蛋白质的抗原结合位点的抗原结合域或分子。在某些实施方案中，抗体是IgG抗体，诸如单克隆IgG抗体。如本文中所使用的，术语“抗磷酸抗体”指特异性结合蛋白质抗原或表位，包括激酶抗原或表位的磷酸化形式(例如，包含磷酸酪氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸丝氨酸的表位)， 而不特异性结合蛋白质抗原或表位的非磷酸化形式的抗体和抗体片段。特异性结合抗原的抗体或片段可以与相关抗原有交叉反应性。在一个实施方案中，抗磷酸抗体是特异性结合激酶抗原，而不与其它抗原起交叉反应的抗体或抗体片段。可以例如通过免疫测定法、 BIAcore、或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定特异性结合激酶抗原的抗体或抗体片段。如使用实验技术，诸如RIA和ELISA测定，在抗体或抗体片段以比对任何交叉反应性抗原高的亲和力结合抗原时，其特异性结合抗原。典型地，特异性或选择性反应会是背景信号或噪音的至少两倍，且更典型地，是背景的超过10倍。在一个实施方案中，抗磷酸抗体是抗磷酸酪氨酸抗体(又称为“抗-pTyr”或“抗_py”)，其特异性结合蛋白质或酶的一个或多个磷酸化的酪氨酸残基，包括激酶的一个或多个磷酸化的酪氨酸残基。在一个实施方案中， 抗磷酸抗体是抗磷酸丝氨酸抗体(又称为“抗-pSer”或“抗_pS”)，其特异性结合蛋白质或酶的一个或多个磷酸化的丝氨酸残基，包括激酶的一个或多个磷酸化的丝氨酸残基。在一个实施方案中，抗磷酸抗体是抗磷酸苏氨酸抗体(又称为“抗-pThr”或“抗-pT”)，其特异性结合蛋白质或酶的一个或多个磷酸化的苏氨酸残基，包括激酶的一个或多个磷酸化的苏氨酸残基。在某些实施方案中，抗磷酸抗体免疫特异性结合激酶的一个或多个特定位置处的一个或多个磷酸化的酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基。在另一个具体实施方案中，抗磷酸抗体仅特异性结合蛋白质的一个磷酸化的氨基酸残基。
“化合物”或“测试化合物”指一种或多种有机化学化合物、无机化学化合物、合成的核酸、天然的核酸、合成的多肽、天然的多肽、肽片段和/或蛋白质。如本文中所使用的， 术语“化合物”或“测试化合物”还包括实验用小分子、得到FDA批准的小分子治疗剂、为抗体定向疗法开发的抗体和其它治疗剂。5. 2鉴定通过细胞过稈调控的蛋白质的方法本文中所提供的以下实施方案是例示性的，并且不是限制性的。本文中所公开的方法具有应用范围。本文中所提供的组合物和方法可以在体外和/或在体内使用。在一方面，本文中提供了一种检测通过感兴趣的细胞过程修饰的靶蛋白的方法， 包括下列步骤(a)使包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质与以下接触(i)抗体，其结合已经通过感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白；和(ii)核酸寡聚物，其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列；并(b)检测与所述可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物的存在，所述可检测蛋白质也被所述抗体结合；其中步骤(b)的核酸寡聚物的存在指示通过所述感兴趣的细胞过程修饰的靶蛋白的存在。在一些实施方案中，在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触前使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。在一些实施方案中，在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触后使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。在一些实施方案中，在步骤(a)中使所述可检测蛋白质与所述抗体和所述核酸寡聚物同时接触。在一些实施方案中，细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中，细胞过程是磷酸化。 在一些实施方案中，所述靶蛋白是激酶底物。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。在一些实施方案中，所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、 转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，核酸相互作用基序是DNA结合域。在一些实施方案中，DNA结合域是NF- κ B DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、Iac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、0paque_2 DNA结合域或TGAla DNA结合域。在具体的实施方案中，核酸相互作用基序包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6中所描述的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。在另一方面，本文中提供了一种鉴定调控细胞过程的测试化合物的方法，其中所述细胞过程修饰靶蛋白，所述方法包括下列步骤(a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触，其中所述可检测蛋白质包含所述靶蛋白和核酸相互作用基序； (b)使所述可检测蛋白质与以下接触(i)抗体，其特异性结合已经由于所述细胞过程而修
11饰过的所述靶蛋白；和(ii)核酸寡聚物，其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列； 并(C)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物量，所述可检测蛋白质也被所述抗体结合；其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加或减少指示所述测试化合物调控所述细胞过程。在一些实施方案中，相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(C)的结合的核酸寡聚物量的增加指示所述测试化合物使所述细胞过程激动。在一些实施方案中，相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(C) 的结合的核酸寡聚物量的减少指示所述测试化合物抑制所述细胞过程。在一些实施方案中，步骤(a)包括接触包含可检测蛋白质的细胞。在一些实施方案中，所述细胞瞬时表达所述可检测蛋白质。在一些实施方案中，所述细胞稳定表达所述可检测蛋白质。在一些实施方案中，所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、 甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、 异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中，所述细胞过程是磷酸化。在一些实施方案中，所述靶蛋白是激酶底物。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。在一些实施方案中，经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。在一些实施方案中，所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、 转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，核酸相互作用基序是DNA结合域。在一些实施方案中，DNA结合域是NF- κ B DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、Iac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、0paque_2 DNA结合域或TGAla DNA结合域。在具体的实施方案中，核酸相互作用基序包含SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中所描述的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。在一些实施方案中，所述激酶底物是Mekl，其中所述抗体特异性结合磷酸化的 Mekl，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与Braf抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内，相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，与Braf抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少，由此指示Braf抑制剂抑制Braf激酶活性，例如抑制MEKl的磷酸化。在一些实施方案中，所述Braf抑制剂选自BAY-43-9006、PLX-4720、Chir-265。在一些实施方案中，所述激酶底物是Aktl，且所述抗体结合磷酸化的Akt。在一些实施方案中，所述抗体结合Ser473或Thr308处磷酸化的Akt 1。在一些实施方案中，所述抗体结合Thr308处磷酸化的Akt 1。在一些实施方案中，所述抗体结合Ser473处磷酸化的Aktl0在一些实施方案中，所述激酶底物是FRAPl或PDPK1，其中所述抗体分别特异性结合磷酸化的FRAPl或磷酸化的PDPK1，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PIK3CA抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内，相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，与PIK3CA抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少，由此指示PIK3CA抑制剂抑制PIK3CA激酶活性，例如分别抑制FRAPl或PDPKl的磷酸化。在一些实施方案中，PIK3CA 抑制剂选自 PI103、ZSTK-474、渥曼青霉素(wortmannin)和 PIK-93。在一些实施方案中，所述激酶底物是AKT1，其中所述抗体特异性结合磷酸化的 AKT1，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PDPKl、FRAP1或mTOR抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内，相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，与PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少，由此指示PDPK1、FRAP1或mTOR 抑制剂抑制PDPKl、FRAP1或mTOR激酶活性，例如抑制AKTl的磷酸化。在一些实施方案中， PDPKl抑制剂是BX-795。在一些实施方案中，所述激酶底物是F0X01，且所述抗体特异性结合磷酸化的 F0X01。在一些实施方案中，所述抗体结合Thr24处磷酸化的F0X01。在一些实施方案中，步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与AKTl抑制剂而非测试化合物接触。在一些实施方案中， Aktl 抑制剂是 GSK-690693。在一些实施方案中，所述核酸寡聚物包含(a)作为PCR扩增序列的第一核酸序列， 和(b)结合所述核酸相互作用基序的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列对于所述第二核酸序列而言是异源的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括实施对照实验以测定测试化合物是否与特异性结合靶蛋白的经修饰形式的抗体竞争对靶蛋白的结合。在优选的实施方案中，使用本文中所提供的方法来鉴定不与特异性结合靶蛋白的经修饰形式的抗体竞争对靶蛋白的结合的测试化合物。在一些实施方案中，检测与可检测蛋白质结合的核酸寡聚物量的步骤包括qPCR 扩增与可检测蛋白质结合的核酸寡聚物。在一些实施方案中，所述核酸寡聚物是放射性标记的、荧光标记的或生物素化的。在一个实施方案中，经由细胞内部发生的细胞过程修饰靶蛋白。在另一个实施方案中，自细胞裂解物获得包含DNA结合域和靶蛋白的可检测蛋白质。在另一个实施方案中， 化学合成包含DNA结合域和靶蛋白的可检测蛋白质。在具体的实施方案中，在无细胞系统中修饰包含DNA结合域和靶蛋白的可检测蛋白质。在另一方面，本文中提供了鉴定调控酶活性的测试化合物的方法，其中所述酶活性修饰靶蛋白，所述方法包括下列步骤(a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触，其中所述可检测蛋白质包含靶蛋白和核酸相互作用基序；(b)使所述可检测蛋白质与以下接触(i)抗体，其特异性结合已经由于酶活性而修饰过的靶蛋白；和 ( )核酸寡聚物，其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列；并(c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物量，所述可检测蛋白质也被所述抗体结合；其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(C)的结合的核酸寡聚物量的增加或减少指示所述测试化合物调控酶活性。在另一方面，本文中提供了鉴定抑制酶活性的化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触，其中所述可检测蛋白质包含靶蛋白和核酸相互作用基序；(b)使所述可检测蛋白质与以下接触(i)抗体， 其特异性结合已经由于酶活性而修饰过的靶蛋白；和(ii)核酸寡聚物，其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列；并(c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物量，所述可检测蛋白质也被所述抗体结合；其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的减少指示所述测试化合物抑制酶活性。在一些实施方案中，酶活性选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、 磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中，酶活性是激酶活性。在一个具体的实施方案中，酶活性是磷酸化。在另一个实施方案中， 酶活性是磷酸酶活性。在另一个实施方案中，酶活性是甲基转移酶活性。在另一个实施方案中，酶活性是乙酰基转移酶活性。在又一方面，本文中提供了测量化合物针对酶的IC5tl的方法，所述方法包括下列步骤(a)在没有化合物的情况中制备至少一个样品，并在存在增加量的化合物的情况中制备多个样品，其中每个样品源自多个包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物，其中所述可检测蛋白质包含核酸相互作用基序和酶底物；(b)使可检测蛋白质与结合已经通过细胞过程修饰过的酶底物的抗体接触；(c)分开结合抗体的可检测蛋白质与未结合的可检测蛋白质和未结合的抗体；(d)使结合抗体的可检测蛋白质与结合核酸相互作用基序的核酸寡聚物接触；并(e)检测步骤(a)中制备的每个样品的结合的核酸寡聚物量；其中检出的结合的核酸寡聚物量是在没有化合物的情况中制备的样品中检出的结合的核酸寡聚物量的一半的化合物浓度是化合物针对酶的ic5(1。本文中所描述的任何方法可以以单重或多重形式运行。在一个例示性的多重形式中，同时对测试化合物筛选并测试其针对来自一组感兴趣的蛋白质的多种蛋白质(每种均牵涉感兴趣的细胞过程)的调控特性。在同时或序贯测定多种蛋白质的情况中，可以使用对于通过每种感兴趣的蛋白质修饰的蛋白质而言独特的核酸寡聚物来区别每种感兴趣的蛋白质的活性。5. 2.1可检测蛋白质在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质是靶蛋白与异源核酸相互作用基序间的嵌合融合物。在此类嵌合融合物中，可以以符合读码框的方式融合代表嵌合物的各一半的至少两种基因序列，将其克隆入合适的载体中，并在选定的宿主细胞中表达。或者，靶蛋白可以以其它方式与核酸相互作用基序合成连接(例如，使用多肽接头进行)。在某些实施方案中，靶蛋白在核酸相互作用基序(例如，DNA结合蛋白)的氨基端。在其它实施方案中，靶蛋白在核酸相互作用基序(例如，DNA结合蛋白)的羧基端。连接可以是直接或间接的。在某些实施方案中，靶蛋白和/或核酸相互作用基序(例如，DNA结合蛋白)保留野生型蛋白质的相应活性。在某些实施方案中，核酸相互作用基序和靶蛋白源自相同生物体，诸如人。5. 2. 1.1 靶蛋白如本文中所使用的，术语“靶蛋白”指可由于细胞过程，诸如那些在本文中所描述的细胞过程而修饰的任何感兴趣的蛋白质。在一些实施方案中，通过具有酶或催化活性的蛋白质修饰靶蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是激酶、转移酶、氧化还原酶、水解酶、连接酶、异构酶或裂合酶的底物。在一个实施方案中，靶蛋白是人多肽或蛋白质。在一些实施方案中，可以通过切割，通过添加或除去官能团或者通过经历异构化来修饰靶蛋白。在某些实施方案中，靶蛋白是具有转移酶活性的转移酶，诸如酰基转移酶、糖基转移酶、酰胺转移酶或硫转移酶的底物。在一些实施方案中，靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。在另一个实施方案中，靶蛋白是水解酶、肽酶、蛋白酶或磷酸酶的底物。在一些实施方案中，靶蛋白是激酶的底物。在一些实施方案中，靶蛋白是脂质激酶，诸如P13K家族脂质激酶(例如 mTOR)的底物。在一些实施方案中，靶蛋白是蛋白质激酶的底物(参见例如Manning(2002) Science 298:1912)。在一些实施方案中，靶蛋白是酪氨酸激酶，或丝氨酸/苏氨酸激酶的底物。在一些实施方案中，靶蛋白是人非受体酪氨酸激酶，例如作为ABL、ACK、CSK、MATK、 FAK、PYK2、FES、FRK、JAK、SRC-A, SRC-B, TEC、和/或SYK家族成员的非受体酪氨酸激酶的底物。在其它实施方案中，靶蛋白是人受体酪氨酸激酶，例如作为ALK、AXL、DDR、EGFR、 EPH、FGFR、INSR、MET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR、ROS, RYK, TIE、TRK, VEGFR、AATYK、禾口 / 或SURTK106家族成员的受体酪氨酸激酶的底物。在一些实施方案中，靶蛋白是PIK3CA、 FRAPl、PDPKl、AKTl、BRaf、或MEKl的底物。在具体的实施方案中，靶蛋白是组蛋白(例如， 组蛋白H3)。在具体的实施方案中，靶蛋白是促凋亡蛋白(例如，BAD)。在具体的实施方案中，靶蛋白是转录因子(例如，STAT5a、STAT6)。在具体的实施方案中，靶蛋白是细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白Bi)。在具体的实施方案中，靶蛋白是受体(例如，雄激素受体)。在某些实施方案中，靶蛋白是通过自磷酸化修饰的酶。在某些实施方案中，靶蛋白是通过自磷酸化修饰的激酶。自磷酸化的激酶的例子包括但不限于CSFlR、Kit、Axl、EGFR、 Flt3、AuroraA、Brk、Jak2、Jak3、Fak、Src 禾口 Tnk2。在某些实施方案中，靶蛋白是无催化活性的酶，其能够作为底物得到修饰，但不能影响下游激活。在具体的实施方案中，靶蛋白是能够得到磷酸化，但具有使激酶无活性的激酶域催化残基中的突变的激酶。在某些实施方案中，将编码可检测蛋白质的核酸克隆入质粒表达载体中，并瞬时转染入细胞系中，导致可检测蛋白质的瞬时表达。在某些实施方案中，将编码可检测蛋白质的核酸克隆入质粒表达载体中，并稳定转染入细胞系中，导致可检测蛋白质的稳定表达。在某些实施方案中，将编码可检测蛋白质的核酸克隆入组成型质粒表达载体中，并转染入细胞系中，导致可检测蛋白质的组成型表达。在具体的实施方案中，组成型表达在CMV启动子的控制下。在某些实施方案中，将编码可检测蛋白质的核酸克隆入诱导型质粒表达载体中， 并转染入细胞系中，导致可检测蛋白质的诱导型表达。在具体的实施方案中，诱导型表达在含有操纵基因位点的CMV启动子的控制下。在一个更具体的实施方案中，操纵基因位点是四环素操纵基因2位点。在又一个实施方案中，诱导型质粒表达载体是四环素调节性表达载体。
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5. 2. 1. 2核酸相互作用基序核酸相互作用基序，例如DNA结合域是本领域中已知的，并且表1中提供了适合于用于本文中所提供的方法的例示性序列。核酸相互作用基序可以包括转录因子(包括转录激活物和阻抑物)的DNA结合域。合适的DNA结合域的例子包括NF- κ B (真核)、cro阻抑物(λ噬菌体)、Iac阻抑物(酵母)、GAL4 (酵母)、GCN4 (酵母)、Lex-A (大肠杆菌)、 0paque-2 (玉米)和TGAla (烟草)。合适的DNA结合域还可以包括通过组合天然存在的和 /或经工程化改造的DNA结合基序的不同片段(piece)构建的合成的DNA结合域，诸如合成的锌指、亮氨酸拉链、翼状螺旋(winged helix)、螺旋-环-螺旋、同源域和POU域。在其它实施方案中，核酸相互作用基序可以是DNA-代谢酶，诸如DNA连接酶、DNA修复酶、限制酶或DNA甲基转移酶的全长、部分长度或功能性片段。DNA结合域的合适性可以取决于特定DNA结合域与其靶序列的结合时间。例如，在解离半衰期超过4小时的情况中认为NF-K B与其靶DNA序列形成强的结合。(参见Speight 等(2001) Chem. Biol. 8 :951_965)。在某些实施方案中，核酸相互作用基序存在于串联重复中以容许顺式二聚化。在另一个具体的实施方案中，NF- κ B基序存在于串联重复中以容许NF- κ B顺式二聚化。5. 2. 1. 3生成可检测蛋白质的方法如本文中所讨论的，可检测蛋白质包含与核酸相互作用基序连接的靶蛋白，并且如果靶蛋白是膜蛋白，那么任选地可以包含信号肽。可以使用本领域技术人员公知的多种方法例如重组或合成方法之任一种来生成本文中所提供的可检测蛋白质。在一方面，可以使用标准的重组DNA技术来生成可检测蛋白质。例如，可以在任何合适的细胞，例如细菌或哺乳动物细胞中表达在表达载体，例如质粒载体中的包含以符合读码框的方式与核酸相互作用基序的编码序列连接的可检测蛋白质的编码序列，例如靶蛋白的编码序列的多核苷酸。在某些实施方案中，使用细胞来表达单一可检测蛋白质。在其它实施方案中，将细胞工程化改造成表达大于一种形式的可检测蛋白质，例如，工程化改造成表达包含第一靶蛋白的可检测蛋白质，而且还表达包含另一靶蛋白的可检测蛋白质。在某些实施方案中，在靶蛋白和核酸相互作用基序的编码序列外，编码序列进一步包含信号肽的氨基酸序列。信号肽是将新合成的蛋白质指引入内质网(ER)中以变为溶酶体蛋白质、分泌性蛋白质或跨越质膜的膜蛋白的短氨基酸序列。在一个实施方案中，在靶蛋白是溶酶体蛋白质、分泌性蛋白质或膜蛋白的情况中，采用信号肽来将靶蛋白指引到其最终目的地。信号肽的位置可以在不干扰靶蛋白、核酸相互作用基序的表达或活性的任何位置中放置。例如，可以将信号肽的编码序列放置在靶蛋白编码序列的上游(5’ )或下游 (3’)，使得信号肽分别在表达的可检测蛋白质中的靶蛋白的氨基或羧基端。同样地，可以将信号肽的编码序列放置在核酸相互作用基序的编码序列的上游(5’ )或下游(3’)，使得信号肽分别在表达的可检测蛋白质中的核酸相互作用基序的氨基或羧基端。在某些实施方案中，信号肽是存在于靶蛋白序列内的内部信号序列。在一个实施方案中，融合蛋白从氨基至羧基端包含信号肽、靶蛋白、任选的接头序列和核酸相互作用基序。在具体的实施方案中， 信号肽存在于可检测蛋白质的氨基末端。在具体的实施方案中，可检测蛋白质从氨基至羧基端包含信号肽、靶蛋白、和核酸相互作用基序。在具体的实施方案中，可检测蛋白质包含从氨基至羧基端的信号肽、靶蛋白、和核酸相互作用基序，其中靶蛋白是受体。在具体的实施方案中，接头序列存在于靶蛋白与核酸相互作用基序之间。在某些实施方案中，接头序列长10-20个氨基酸。在某些实施方案中，接头序列长16、17或18个氨基酸。在其它实施方案中，接头序列是柔性接头。在又一个实施方案中，接头序列是可以由蛋白酶识别的酶切割位点。在此类实施方案中，蛋白酶可以自核酸基序切割出靶蛋白。此类切割位点的非限制性例子是由烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶识别并切割的序列。在某些实施方案中，可检测蛋白质包含与核酸相互作用基序的氨基端连接的靶蛋白。在此类实施方案中，相应地安排可检测蛋白质的编码序列。如此，在一个实施方案中， 将靶蛋白的编码序列放置得与核酸相互作用基序的编码序列符合读码框，从而靶蛋白的羧基端(carboxy-most)氨基酸残基在表达的可检测蛋白质中与核酸相互作用基序的氨基端 (amino-most)氨基端残基相邻。在一个备选的实施方案中，将靶蛋白的编码序列放置得与氨基酸接头序列的编码序列符合读码框，其继而放置得与核酸相互作用基序的编码序列符合读码框。在此类实施方案中，靶蛋白的氨基酸序列还与核酸相互作用基序的氨基端连接， 但是经由接头序列连接。同样地，在某些实施方案中，可检测蛋白质包含与核酸相互作用基序的羧基端连接的靶蛋白。在此类实施方案中，相应地安排可检测蛋白质的编码序列。如此，在一个实施方案中，将核酸相互作用基序的编码序列放置得与靶蛋白的编码序列符合读码框，从而核酸相互作用基序的羧基端氨基酸残基在表达的可检测蛋白质中与靶蛋白的氨基端氨基酸残基相邻。在一个备选的实施方案中，将核酸相互作用基序的编码序列放置得与氨基酸接头序列的编码序列符合读码框，其继而放置得与靶蛋白的编码序列符合读码框。在此类实施方案中，靶蛋白的氨基酸序列还与核酸相互作用基序的羧基端连接，但是经由接头序列连接。用于构建表达载体及在包含表达载体的细胞中表达基因的技术是本领域中公知的。参见例如 Sambrook 等，2001，Molecular Cloning—A Laboratory Manual，第 3 版， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,及 Ausubel 等编，目前版本， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY。可用于在表达载体中使用的启动子包括但不限于阿拉伯糖启动子、金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP pol III启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(诸如人立即早期CMV启动子)、 和组成型CMV启动子。诱导型启动子在实施本文中所描述的方法中也得到应用，诸如含有 tet-开启或tet-关闭系统，例如T-RExTM系统(Invitrogen产品目录编号K1020-02)中 Wtet响应元件(TRE)的启动子，可以通过添加某些金属盐上调的金属硫蛋白启动子和雷帕霉素诱导型启动子(Rivera 等，1996，Nature Med, 2 (9) 1028-1032 ；Ye 等，2000，Science 283:88-91 ；Sawyer T K 等，2002，Mini Rev Med Chem. 2 (5) :475_88)。大量适合于在实施本发明中使用的可调节载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且许多是商品化的。表达载体应当含有与表达可检测蛋白质的细胞相容的表达和复制信号。可用于编码可检测蛋白质的构建体的表达载体包括病毒载体诸如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒、质粒载体、粘粒，等等。对于将表达载体转染入哺乳动物细胞中，病毒和质粒载体是优选的。例如，表达载体pcDNAl(Invitrogen，San Diego, CA)(其中表达控制序列包含CMV启动子)提供良好的对此类细胞的转染和表达率。还可以例如使用化学合成法，或合成和重组法的组合来生成可检测蛋白质。例如， 可以使用本领域技术人员公知的标准多肽合成技术来合成生成可检测蛋白质。或者，可以纯化或者使用例如诸如那些本文中所描述的技术来重组表达可检测蛋白质的部分，并可以使用合成技术来连接各部分以生成完整的可检测蛋白质。在将可检测蛋白质的各部分表达或纯化，然后连接的实施方案中，连接可以是经由共价连接，例如肽键，或非共价连接，并且可以是直接的或者经由接头模块，例如，连接靶蛋白与核酸相互作用基序的接头模块。可以利用多种连接之任一种，包括但不限于醚、酯、硫醚、硫酯、酰胺、酰亚胺、二硫化物、肽、或其它连接。连接也可以是经由多种官能团之任一种，例如硫氢基(-S)、羧酸 (COOH)或游离氨(-NH2)基。熟练技术人员可以常规地选择合适的连接、任选的接头、及基于例如可检测蛋白质的元件，例如核酸相互作用基序和/或靶蛋白的物理和化学特性来连接可检测蛋白质的各部分的方法。在利用接头的实施方案中，接头可以直接连接可检测蛋白质的各部分，例如核酸相互作用基序和/或靶蛋白多肽。在其它实施方案中，接头自身可以包含两种或更多种结合以连接可检测蛋白质的各部分，例如核酸相互作用基序和靶蛋白的分子。例如，连接可以是经由附接于例如核酸相互作用基序的生物素分子和附接于靶蛋白多肽的链霉亲合素。 例示性的接头包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头、取代的碳接头、不饱和的碳接头、芳香族碳接头、肽接头，等等。在使用接头来连接核酸相互作用基序与靶蛋白多肽的实施方案中，可以通过本领域技术人员已知的不受限制的任何手段或方法来将接头附接于核酸相互作用基序和/或靶蛋白多肽。此外，可以在适当时将要连接的可检测蛋白质的各部分，例如核酸相互作用基序和靶蛋白衍生化以便于与可检测蛋白质的另一部分，或与接头的连接。可以例如通过附接一种或多种合适的衍生物，诸如那些可获自Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois的衍生物来实现此类衍生化。或者，衍生化可以牵涉化学处理要连接的可检测蛋白质的一个或多个部分，例如核酸相互作用基序和/或靶蛋白。例如，熟练技术人员可以在蛋白质上常规地生成游离的硫氢基基团以提供用于生成二硫化物、硫醚、硫酯等连接的反应性模块。参见例如美国专利No. 4，659，839。可以使用本文中所描述的任何连接方法以便以各种构型连接可检测蛋白质的各部分，例如核酸相互作用基序和靶蛋白。例如，可以将核酸相互作用基序的羧基端与靶蛋白多肽的氨基端直接或间接连接。在一些实施方案中，可以将靶蛋白的羧基端与核酸相互作用基序的氨基端直接或间接连接。在其它实施方案中，可以将核酸相互作用基序的氨基端与靶蛋白的氨基端直接或间接连接。在其它实施方案中，可以将核酸相互作用基序的羧基端与靶蛋白的羧基端直接或间接连接。如上文所讨论的，如本文中所使用的，与氨基端或羧基端“连接”并不必然意味着与多肽的氨基端或羧基端氨基酸的直接连接，而是也可以经由接头，例如一个或多个残基，例如2、3、4、5、10、15、20、25、或更多个氨基酸残基的氨基酸序列。注意可以利用经由上文所描述的方法生成的任何可检测蛋白质作为本文中所描述的方法的一部分。5. 2. 2 抗体用于本文中所提供的方法和试剂盒的抗体包括但不限于多克隆抗体、合成抗体、 单克隆抗体、重组生成的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、 小鼠抗体、山羊抗体、兔抗体、嵌合抗体、细胞内抗体、单链FV(SCFV)(例如，包括单特异性、 双特异性，等等)、驼源化抗体、Fab片段、F(ab’ )2片段、二硫化物连接的Fv(SdFv)、抗独特型(抗-id)抗体、和任何上述物的表位结合片段。在具体的实施方案中，用于本文中所提供的方法和试剂盒的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分。本文中所提供的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 和 IgY)、类别(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。可以使用的抗体包括免疫球蛋白的变体和衍生物，包括但不限于保留特异性结合表位的能力的片段。优选的片段包括Fab片段(含有抗原结合域，并且包含通过二硫键桥接的轻链和部分重链的抗体片段)；Fab’(含有单一抗原结合域的抗体片段，其包含Fab和重链中到铰链区的额外部分)；F(ab’)2 (两个通过重链铰链区中的链间二硫键连接的Fab’ 分子；Fab’分子可以针对相同或不同表位)；双特异性Fab (具有两个抗原结合域的Fab分子，每个所述抗原结合域可以针对不同表位)；包含可变区的单链Fab链，又称为sFv(通过10-25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单一轻链和重链的可变、抗原结合决定区)；二硫化物连接的Fv、或dsFv(通过二硫键连接在一起的抗体的单一轻链和重链的可变、抗原结合决定区)；驼源化的VH(抗体的单一重链的可变、抗原结合决定区，其中VH界面的一些氨基酸是那些存在于天然存在的骆驼抗体的重链中的)；双特异性sFv (具有两个抗原结合域的sFv或dsFv分子，每个所述抗原结合域可以针对不同表位)；双抗体(在第一 sFv的 VH域与第二 sFv的VL域装配及第一 sFv的VL域与第二 sFv的VH域装配时形成的二聚化 sFv ；双抗体的两个抗原结合区可以针对相同或不同表位)；和三抗体(三聚化sFv，其以与双抗体相似的方式形成，但是其中在单一复合物中创建三个抗原结合域；三个抗原结合域可以针对相同或不同表位)。作为免疫球蛋白衍生物的抗体还包括抗体结合位点的一个或多个CDR序列。在存在两个或更多个CDR序列时可以在支架上将CDR序列连接在一起。在某些实施方案中，要在本发明中使用的抗体包含单链Fv( “scFv”)。scFv是包含抗体的VH 和VL域的抗体片段，其中这些域存在于单一多肽链中。一般地，scFv多肽进一步包含VH 和VL域间的多肽接头，其使scFv能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述，参见 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编 Springer-Verlag, New York,第 269 页-第 315 页(1994)。用于本文中所提供的方法和试剂盒的抗体可以来自任何动物起源，包括鸟和哺乳动物(例如，人、鼠、猴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、或鸡)。在本文中所提供的方法和试剂盒的某些实施方案中，本发明的抗体是人或人源化的单克隆抗体。如本文中所使用的， “人，，抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，而且包括自人免疫球蛋白文库或者自表达来自人基因的抗体的小鼠分离的抗体。在某些实施方案中，特异性结合已经通过细胞过程修饰过的靶蛋白的抗体不结合未修饰形式的靶蛋白或者不与未修饰形式的靶蛋白起交叉反应。对特定的蛋白质修饰，例如对特定的经修饰的残基具有特异性的抗体是本领域中公知的。如此，可以在本文中所提供的方法中使用对蛋白质修饰具有特异性的本领域中已知的任何抗体，所述蛋白质修饰包括但不限于酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO 化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一些实施方案中，用于本文中的方法的抗体是抗磷酸抗体。在另一个实施方案中，用于本文中的方法的抗体是抗甲基抗体。在另一个实施方案中，用于本文中的方法的抗体是抗乙酰基抗体。在靶蛋白是组蛋白H3的具体实施方案中，特异性结合经修饰形式的组蛋白H3的有用的抗体包括但不限于抗乙酰基组蛋白H3(Lys5) (Epitomics, Novus Biologicals)； 抗乙酰基组蛋白 H3(Lysl2) (Novus Biologicals)；抗乙酰基组蛋白 H3 (BioVision, EMD Biosciences)；抗乙酰基组蛋白 H3 (Lys9) (Active Motif, USBIO, Novus Biological)；抗乙酰基组蛋白 H3(Lysl4)，抗乙酰基组蛋白 H3 (Lysl8) (Active Motif，USBIO，Epitmoics)； 抗乙酰基组蛋白H3(Lys24) (Santa Cruz Biotechnology)；抗乙酰基组蛋白H3 (Lys23)，抗乙酰基组蛋白H3(Lys27)，抗乙酰基组蛋白H3 (Lys56) (Active Motif), Epitomics)；抗乙酉先基组蛋白 H3 (Lys9/Lysl4) (Cell Signaling Technology, Santa Cruz Biotechnology)； 抗乙酰基组蛋白 H3 (Lys9/Lysl8) (USBIO)；抗-泛甲基组蛋白 H3 (Lys9) (Cell Signaling Technology, Active Motif, USBIO)；抗-单甲基组蛋白 H3 (Lys9)、抗-单甲基组蛋白H3(Lys56)、抗-单甲基组蛋白H3(Lys79) (Active Motif)；抗-磷酸单甲基组蛋白 H3(Lys4) (Cell Signaling Technology)；抗-二甲基组蛋白 H3 (Lys4)、抗-二甲基组蛋白 H3(Lys9)、组蛋白 H3(Lys27)、抗-二甲基组蛋白 H3(Lys79) (Cell Signaling Technology, Active Motif, USBIO)；抗-二甲基组蛋白 H3 (Lys80) (Santa Cruz Biotechnology)； 抗-二甲基组蛋白 H3 (Lys56)，(Cell Signaling Technology, Active Motif) ； (Cell Signaling Technology)；抗-二甲基组蛋白 H3 (Lys36)，(Active Motif)；抗-三甲基组蛋白H3(Lys9)、抗-三甲基组蛋白H3(Lys27) (Active Motif)；抗-三甲基组蛋白H3 (Lys4) (Epitomics)；抗-磷酸(Thr80)抗-三甲基(Thr79)组蛋白 H3 (USBIO)；抗-磷酸(Thr3) 抗-甲基(Lys4)组蛋白H3 (Lifespan Biosciences)；抗-乙酰基(Lys9)抗-磷酸 (SerlO)组蛋白 H3 (USBIO)；抗-乙酰基(Lysl5)抗-磷酸(Serll)组蛋白 H3 (Santa Cruz Biotechnology)；和抗-磷酸组蛋白 H3 (Ser28) (Santa Cruz Biotechnology)。在靶蛋白是细胞周期蛋白Bl的具体实施方案中，特异性结合经修饰形式的细胞周期蛋白Bl的有用的抗体包括但不限于抗-磷酸细胞周期蛋白Bl(Serl26) (Rockland, Meridian Life Science)；和抗-磷酸细胞周期蛋白 Bl (Ser 133) (Cell Signaling Technology)。在靶蛋白是BAD的具体实施方案中，特异性结合经修饰形式的BAD的有用的抗体包括但不限于抗-磷酸 BAD(Ser 112) (Immuno-Biological Laboratories, Assay Designs, Cell Signaling Technology, IMGENEX, MBL International)BAD (Ser 136) (Immuno-Biological Laboratories, Assay Designs)；禾口抗-憐酸 BAD (Ser 155) (Immuno-Biological Laboratories, IMGENEX)。在靶蛋白是STAT5A的具体实施方案中，特异性结合经修饰形式的STAT5A的有用的抗体包括但不限于抗-磷酸 STAT5(Tyr694) (Rockland, ECM Biosciences, CellSignaling Technology, Abgent, Immuno-Biological Laboratories, USBIO, LifeSpan Biosciences, MBL International, ；RayBiotech, Biotrend, IMGENEX, AnaSpec,Abeam, EMD Biosciences)；抗-磷酸 STAT5 (Tyr695/Tyr699) (RayBiotech)；抗-磷酸 STAT5A(Ser 127/ Ser 128)；抗-磷酸 STAT5A (Ser 780) (Abgent)；抗-磷酸 STAT5A (Ser 780) (IMGENEX)；和抗 _ 磷酸 STAT5A/B。在靶蛋白是STAT6的具体实施方案中，特异性结合经修饰形式的STAT6的有用的抗体包括但不限于抗-磷酸 STAT6(Thr641) (Cell Signaling Technology, R&D Systems, Biotrend, MBL International, RayBiotech, IMGENEX, Biovision, Millipore, EMD Biosciences)；和抗-磷酸 STAT6 (Thr645) (IMGENEX, Abeam)。用于检测蛋白质修饰的其它抗体包括抗-法呢基抗体(Sigma)和抗_0_糖化抗体 (Millipore， Acris Antibodies GmbH， GeneTex, Fitgerald Industries Internationl)。 可以制备识别并结合特定蛋白质修饰的定制单克隆或多克隆抗体。在一些实施方案中，使用固相测定法形式来实施测定法。在本文中所提供的方法和试剂盒的具体实施方案中，将抗体固定于固体支持物上。如本文中所使用的，“固体支持物”是(不限于)抗体可以直接或间接结合(例如，经由其它结合配偶中间体，诸如其它抗体，蛋白A或蛋白G)，或者抗体可以包埋在其中(例如，经由受体或通道)的任何柱(或柱材料)、珠、试管、微量滴定皿、颗粒(例如，磁、琼脂糖或Si^pharose珠)、微芯片(例如，玻璃、纤维玻璃、胶乳、硅、硅_玻璃、或金芯片)、或膜(例如，脂质体或囊泡的膜)、塑料材料 (例如，聚苯乙烯或聚氯乙烯)，或传感器芯片(例如，那些与BIAcore系统一起使用的)。 在具体的实施方案中，经由将蛋白G固定于固体支持物上来间接固定抗体。可以使用任何标准规程，例如通过抗体的生物素化，接着使用固定化的链霉亲合素(例如，固定于磁珠或柱上的链霉亲合素)来捕捉生物素化的抗体，从而“捕获”测定法中使用的抗体。结合抗体(和核酸寡聚物，其结合可检测蛋白质)的靶蛋白仍会结合固体支持物，而可以将未结合的结合试剂(例如，靶蛋白和核酸寡聚物)洗掉。在捕获结合的靶蛋白后，可以例如使用与核酸寡聚物杂交的引物通过实施PCR反应来常规地检测已经经由结合可检测蛋白质的核酸相互作用基序而结合靶物的核酸寡聚物。在某些实施方案中，使用标准的定量方法(例如，使用Perkin-Elmer的Taq Man)来实施PCR反应。在一些实施方案中，固体支持物保留多种感兴趣的蛋白质-核酸寡聚物复合物，在该情况中，可以鉴定分离集合的个别成员，诸如经由扩增例如一组中对于特定的感兴趣的蛋白质特异性的每种独特的核酸寡聚物来进行。在某些实施方案中，抗体结合的固体支持物是磁珠。在某些实施方案中，抗体是固定到经链霉亲合素包被的珠(例如，Invitrogen的Dynabeads M280)上的生物素化的抗体。在某些实施方案中，生物素化的抗体是用于捕捉一抗的二抗，所述一抗继而用于识别并结合经修饰的靶蛋白。在某些实施方案中，将抗体固定到蛋白G珠(Invitrogen 的Dynabeads 蛋白G)上。在某些实施方案中，将抗体固定到蛋白A柱(Invitrogen的 Dynabeads 蛋白A)上。在一些实施方案中，通过被固定于固体表面(例如，Dynabeads M-280 绵羊抗-小鼠 IgG (Invitrogen) ；Dynabeads M-280 绵羊抗-兔 IgG (Invitrogen)) 上的二抗结合来固定抗体。在某些实施方案中，在期望抗体-靶蛋白复合物的洗脱的情况中，例如对于核酸寡聚物的PCR检测，可以使用商品化洗脱缓冲液来实施蛋白质复合物的洗脱。在某些实施方案中，在使用蛋白G珠来固定抗体-靶蛋白复合物的情况中，可以使用苯基磷酸酯或者使用商品化的低PH缓冲液来实施洗脱。在某些实施方案中，固定的抗体，例如一抗或二抗含有能够化学或酶促切割的可切割接头。在一个实施方案中，可切割接头能够通过膦或双硫醇介导的还原来切割。在一个具体的实施方案中，膦是三-(2-羧乙基)膦(TCEP)。在某些实施方案中，在具有多个孔的板，诸如多孔板或多域多孔板的孔中固定抗体。多孔测定板的使用容许平行加工并分析分布于平板的多个孔中的多个样品。多孔测定板(又称为微量板或微量滴定板)可以采用多种形式、大小和形状(例如，96-、384_、 1536-、或9600-孔板；圆-或平-底多孔板)。本文中所提供的方法在以标准化的板形式实施时可以利用用于贮存和移动这些板的可容易获得的设备及用于将液体快速分配至板中或从板中移出的可容易获得的设备(例如，多孔移液器，洗板仪，等)。可以在本文中所提供的方法中使用的例示性多孔板形式包括那些存在于96孔板(12x8阵列的孔)、384孔板(24x16阵列的孔)和1536孔板(48x32阵列的孔)上的。可以在本文中所提供的方法中使用的其它形式包括但不限于单孔或多孔板，其包含多个域。5. 2. 3核酸寡聚物如本文中所使用的，核酸寡聚物结合靶蛋白的核酸相互作用基序。在某些实施方案中，核酸寡聚物包含(a)第一核酸序列，其是具有报告物功能的PCR扩增序列(“或扩增子”)，和(b)第二核酸序列，其结合具有蛋白质捕捉或“加标签”功能的核酸相互作用基序。 在具体的实施方案中，第一核酸序列对于第二核酸序列而言是异源的，即正常情况下不会发现与第二核酸序列连续。可以经由例如DNA-蛋白质复合物形成通过核酸寡聚物将包含靶蛋白和核酸相互作用基序，诸如DNA-结合蛋白的可检测蛋白质捕获或“加标签”。在一个实施方案中，核酸寡聚物包含与DNA结合蛋白(例如，NFkB, cro阻抑物、 GAL4、GCN4、LexA, 0paque-2和TGAla)可特异性识别的靶DNA序列连接的扩增子。在另一个实施方案中，核酸寡聚物包含与转录因子的DNA结合域的关联(Cognate)DNA序列连接的扩增子。在一个实施方案中，第二核酸序列包含天然存在的或合成的DNA结合蛋白的识别序列。在具体的实施方案中，包含PCR扩增序列的第一核酸序列与包含核酸相互作用基序的第二核酸分开且不同。在此类实施方案中，核酸寡聚物能够结合或以其它方式连接具有特异性识别核酸寡聚物的DNA结合构件的感兴趣的蛋白质。然后，可以使用例如定量 PCR(qPCR)来检测和/或量化核酸寡聚物，或者可以将核酸寡聚物进行PCR扩增，并通过质谱术来检测。在一些实施方案中，在PCR扩增步骤期间采用第二报告物功能。在一个具体的实施方案中，在PCR扩增步骤期间，核酸寡聚物经历引物延伸步骤，此时第二报告物功能诸如荧光标签被附接于核酸寡聚物。在一个实施方案中，通过qPCR来检测和/或量化核酸寡聚物。通过qPCR进行的核酸寡聚物检测具有的优点不仅在于是可靠的定量检测法，还在于是高度灵敏的且具有高度选择性的检测法。由于qPCR检测法的高度灵敏性质，此方法实现对非常少量的靶蛋白的检出，而且降低对稀缺且昂贵的测定成分，诸如重组蛋白的需要。由于qPCR检测法的高特异性性质，qPCR还实现对复杂的异质混合物中特定DNA序列的检测，而且消除对通常对蛋白质样品进行以改善或增强蛋白质检测的任何种类的纯化步骤的需要。可扩增序列以序列特异性方式与或能够与PCR引物杂交。在某些实施方案中，核酸寡聚物包含多个扩增子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个扩增子。在一些实施方案中，多个扩增子是单一扩增子的串联重复。在某些实施方案中，扩增子可通过定量 PCR扩增，所述定量PCR容许量化通过此类核酸寡聚物加标签的蛋白质。在一个具体的扩增方法中，PCR序列的扩增包括在标准的PCR反应混合物(一般地，具有终浓度IOmM Tris-HCl (pH8. 3 于 25°C )、l_4mM MgCl2、0. I-ImM dNTP 的混合物)中组合含有 PCR 扩增模板的核酸、PCR引物和qPCR探针，并首先在热启动(Hot Start)条件(例如，加热至95°C达 5分钟)下处理样品以使非特异性退火或错配最小化，接着是变性步骤(例如，95°C持续45 秒)，接着是退火步骤(55°C持续1分钟)，并且接着是延伸步骤(72°C持续1分钟)，变性、 退火和延伸的连续步骤有多达40轮，以完成qPCR信号的扩增。在一个实施方案中，核酸寡聚物的长度是约50-约100、约50-约200、约50-约 300、约 50-约 400、约 50-约 500、约 100-约 200、约 100-约 300、约 100-约 400、约 100-约 500、约 200-约 300、约 200-约 400、约 200-约 500、约 300-约 400、约 300-约 500、或约 400-约500个核苷酸的长度。如本文中所使用的，报告物功能指容许核酸寡聚物显现或者以其它方式检出或量化，并且因此容许捕获的或“加标签的”蛋白质间接显现或以其它方式检出或量化的核酸寡聚物的特征。在某些实施方案中，通过基于核酸的读出，包括但不限于PCR、qPCR (Applied Biosystems Inc. /ABI, BioTrove)、DNA 微阵列(Affymetrix 的GeneChip )、珠测定法 (Illumina 的 BeadArray Technology, Luminex 的 xMAP technology)、DNA 毛细管阵歹[J 或毛细管电泳(Applied Biosystems Inc. /ABI, Beckman Coulter 的 GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System)、纳米技术(Nanostring 's nCounterTM Analysis System)、 DNA 测序(454，Illumina 的 Solexa，Life Technology 的 SOLiDTM System Sequencing, Applied Biosciences Inc. /ABI)及通过质谱术(Sequenom , BioTrove)来检测核酸寡聚物的报告物功能。在某些实施方案中，核酸寡聚物的报告物功能来自核酸寡聚物的放射性标记、荧光标记或生物素化。核酸寡聚物可以是单链或双链DNA、单链或双链RNA、DNA-RNA杂合物、 RNA-RNA杂合物，或其天然的或合成的衍生物、类似物及片段。在一些实施方案中，核酸寡聚物是DNA，且可以例如通过任何标准的酶反应，诸如切口转译，或者通过用经32P、125I或生物素标记的三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的末端标记来将报告物功能标记物导入DNA，或者标记物可以作为插入剂导入。存在着许多商品化的并且可以用于标记核酸寡聚物的荧光或发光基团。可以用于标记核酸寡聚物的荧光标记物的一些例子是荧光素、罗丹明和香豆素及其商业衍生物诸如德克萨斯红(Texas Red) 和Alexa Fluor 。发光基团的例子是镧系元素复合物和发光纳米颗粒。在一个实施方案中，核酸寡聚物最初没有报告物功能，但是在核酸检测步骤前添加报告物功能。表1中显示了例示性的核酸寡聚物和核酸相互作用基序对。DNA结合蛋白可以包括例如转录因子的DNA结合域，包括转录激活物和阻抑物。合适的DNA结合域的例子包括 NF-k B(真核)、cro阻抑物(λ噬菌体)、Iac阻抑物(大肠杆菌)、GAL4(酵母)、GCN4(酵母)、Lex-A (大肠杆菌)、0paque-2 (玉米)和TGAla (烟草)。DNA结合域的合适性还可以取决于特定DNA结合域与其靶序列的结合时间。例如，在解离半衰期超过4小时的情况中认为 NF-κ B 与其靶 DNA 序列形成强结合。(参见 Speight 等(2001) Chem. Biol. 8 :951_965)。
23合适的DNA结合域还包括通过组合天然存在的和/或经工程化改造的DNA结合基序的不同片段构建的合成的DNA结合域，诸如合成的锌指、亮氨酸拉链、翼状螺旋、螺旋-环-螺旋、 同源域和POU域。可以经由DNA结合域对核酸寡聚物的某些结合识别序列的识别来将可检测蛋白质捕获或“加标签”。在本发明的另一个实施方案中，核酸相互作用基序可以是本文中所描述的DNA-代谢酶，诸如DNA连接酶、DNA修复酶、限制酶或DNA甲基转移酶的全长、 部分长度或功能性片段。表1 例示性的核酸寡聚物、核酸相互作用基序和核酸相互作用基序识别序列
权利要求
1.一种检测通过感兴趣的细胞过程修饰的蛋白质的方法，包括下列步骤a)使包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质与以下接触i)抗体，其结合已经通过所述感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白；和 )核酸寡聚物，其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列；并b)检测与所述可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物的存在，所述可检测蛋白质也被所述抗体结合；其中步骤(b)的所述核酸寡聚物的存在指示通过所述感兴趣的细胞过程修饰的蛋白质的存在。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触前使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。
3.权利要求1的方法，其中在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触后使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。
4.权利要求1的方法，其中在步骤(a)中使所述可检测蛋白质与所述抗体和所述核酸寡聚物同时接触。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化(sumoylation)、蛋白水解、外消旋化和异构化。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞过程是磷酸化。
7.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白是激酶底物。
8.权利要求7的方法，其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸抗体。
9.权利要求7的方法，其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的， 且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。
10.权利要求7的方法，其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的， 且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。
11.权利要求7的方法，其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的， 且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。
12.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。
13.权利要求1的方法，其中所述核酸相互作用基序是DNA结合域。
14.权利要求1的方法，其中所述DNA结合域是NF-κ B DNA结合域、cro阻抑物DNA 结合域、Iac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、 0paque-2 DNA结合域或TGAla DNA结合域。
15.权利要求1的方法，其中所述核酸相互作用基序包含SEQID NO :5或SEQ ID NO: 6中所描述的氨基酸序列。
16.权利要求1的方法，其中所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。
17.一种鉴定调控细胞过程的测试化合物的方法，其中所述细胞过程修饰靶蛋白，所述方法包括下列步骤a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触，其中所述可检测蛋白质包含所述靶蛋白和核酸相互作用基序；b)使所述可检测蛋白质与以下接触i)抗体，其特异性结合已经由于所述细胞过程而修饰过的所述靶蛋白；和 )核酸寡聚物，其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列；并c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物的量，所述可检测蛋白质也被所述抗体结合；其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加或减少指示所述测试化合物调控所述细胞过程。
18.权利要求17的方法，其中在步骤(b)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触前使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。
19.权利要求17的方法，其中在步骤(b)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触后使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。
20.权利要求17的方法，其中在步骤(b)中使所述可检测蛋白质与所述抗体和所述核酸寡聚物同时接触。
21.权利要求17的方法，其中步骤(a)包括接触包含所述可检测蛋白质的细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述细胞瞬时表达所述可检测蛋白质。
23.权利要求21的方法，其中所述细胞稳定表达所述可检测蛋白质。
24.权利要求21的方法，其中所述细胞组成型表达所述可检测蛋白质。
25.权利要求21的方法，其中所述细胞诱导性表达所述可检测蛋白质。
26.权利要求17的方法，所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、 甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、 异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。
27.权利要求17的方法，其中所述细胞过程是磷酸化。
28.权利要求27的方法，其中所述靶蛋白是激酶底物。
29.权利要求观的方法，其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。
30.权利要求观的方法，其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。
31.权利要求观的方法，其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的，且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。
32.权利要求17的方法，其中所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。
33.权利要求17的方法，其中所述核酸相互作用基序是DNA结合域。
34.权利要求17的方法，其中所述DNA结合域是NF-κ B DNA结合域、cro阻抑物DNA 结合域、Iac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4DNA结合域、Lex-A DNA结合域、 0paque-2 DNA结合域或TGAla DNA结合域。
35.权利要求17的方法，其中所述核酸相互作用基序包含SEQID NO :5或SEQ ID NO:6中所描述的氨基酸序列。
36.权利要求17的方法，其中所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。
37.权利要求28的方法，其中所述激酶底物是Mekl，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与Braf抑制剂而不是测试化合物接触。
38.权利要求37的方法，其中所述Braf抑制剂选自BAY-43-9006、PLX-4720、 Chir-265。
39.权利要求28的方法，其中所述激酶底物是Aktl，且所述抗体结合磷酸化的Akt。
40.权利要求39的方法，其中所述抗体结合Ser473或Thr308处磷酸化的Aktl。
41.权利要求40的方法，其中所述抗体结合Thr308处磷酸化的Aktl。
42.权利要求40的方法，其中所述抗体结合Ser473处磷酸化的Aktl。
43.权利要求28的方法，其中所述激酶底物是FRAPl或PDPKl，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PIK3CA抑制剂而不是测试化合物接触。
44.权利要求43的方法，其中所述PIK3CA抑制剂选自PI103、ZSTK-474、渥曼青霉素和 PIK-93。
45.权利要求28的方法，其中所述激酶底物是AKT1，且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂而不是测试化合物接触。
46.权利要求45的方法，其中所述PDPKl抑制剂是BX-795。
47.权利要求28的方法，其中所述激酶底物是F0X01，且所述抗体结合磷酸化的F0X01。
48.权利要求47的方法，其中所述抗体结合Thr24处磷酸化的F0X01。
49.权利要求28的方法，其中步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品，由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与AKTl抑制剂而不是测试化合物接触。
50.权利要求49的方法，其中所述Aktl抑制剂是GSK-690693。
51.权利要求17的方法，其进一步包括使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与至少两个浓度的测试化合物接触，并计算所述测试化合物的IC5(I。
52.权利要求17的方法，其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加指示所述测试化合物使所述细胞过程激动。
53.权利要求17的方法，其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量，在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的减少指示所述测试化合物抑制所述细胞过程。
54.权利要求1-53中任一项的方法，其中所述核酸寡聚物包含(a)作为PCR扩增序列的第一核酸序列，和(b)结合所述核酸相互作用基序的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列对于所述第二核酸序列而言是异源的。
55.权利要求1-54中任一项的方法，其进一步包括qPCR扩增与所述可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物。
56.权利要求1-55中任一项的方法，其中所述核酸寡聚物是放射性标记的、荧光标记的或生物素化的。
57.权利要求1-56中任一项的方法，其中所述抗体是固定于多孔板上的。
58.一种试剂盒，其包含a)包含可检测蛋白质的细胞，其中所述可检测蛋白质包含通过细胞过程修饰的蛋白质和核酸相互作用基序；和b)包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列的核酸寡聚物。
59.权利要求58的试剂盒，其进一步包含c)结合已经通过所述感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白的抗体。
60.权利要求58的试剂盒，其中所述细胞过程是磷酸化。
全文摘要
本文中提供了可用于例如测定牵涉细胞过程的蛋白质的活性的测定法。在一些实施方案中，使用核酸标签，且特别地通过检测核酸标签的存在来评估蛋白质的活性。例如，可以使用此类测定法来研究测试化合物作为蛋白质活性的调控剂，例如抑制剂、激动剂和拮抗剂的效果。
文档编号G01N33/532GK102459642SQ201080028519
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月23日 优先权日2009年4月24日
发明者D.K.特雷伯, L.M.沃迪卡, W.G.刘易斯 申请人:迪斯卡沃雷克斯公司