复合系统的制作方法

专利名称：复合系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于形成基于SNARE复合体的分子支架的复合系统(complexingsystem)。
背景技术：
真核细胞中，囊泡(vesicle)与膜在被称为囊泡融合的过程中融合。例如，囊泡能够与细胞质膜或其它细胞区室(例如内体或溶酶体)融合。研究最深入的囊泡融合的形式是在神经元细胞中突触囊泡与突触前膜的对接，以释放神经递质来引起神经冲动在突触后神经兀(post-synaptic neuron)中的传递。囊泡融合的过程是由SNARE蛋白(SNAREs)介导的，它们是一个由60多个酵母和哺乳动物细胞中的成员组成的巨大的蛋白超家族。SNARE蛋白较小，丰度较高，且多为膜结合蛋白。尽管它们在结构和大小上非常多变，但它们在胞浆结构域(cytosolic domain)中都具有被称为SNARE基序的片段，SNARE基序能够组装成被称为SNARE复合体的紧凑的四螺旋束。据称，SNARE基序具有大约60-70个氨基酸的长度(Jahn R和Scheller RH)，但这并没有很明确地界定。SNARE复合体有时由三种蛋白组成定位在细胞膜上的突触融合蛋白(syntaxin)和SNAP-25 ;以及锚定在囊泡膜上的小突触泡蛋白(synaptobrevin,也称为囊泡相关膜蛋白或VAMP)。在神经元胞吐作用中，突触融合蛋白和小突触泡蛋白都通过它们的C端结构域锚定在它们各自的细胞膜上，然而SNAP-25通过多个与半胱氨酸连接的棕榈酰链被连接到质膜上。核心SNARE复合体是一种四-α-螺旋束，其中一个α -螺旋是由突触融合蛋白贡献的，一个α -螺旋是由小突触泡蛋白贡献的，而另外两个α -螺旋则是由SNAP-25贡献的。已发现此SNARE复合体是非常稳定的。囊泡融合中涉及的分子机制的示意性展示如图I所
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发明内容
发明人发现，SNARE复合体和它的形成能用于多种用途。因此，本发明的基础是一种复合系统，该复合系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物(homolog)的多肽螺旋；和一个或多个附着在所述多肽螺旋上的货物部分(cargo moieties)；其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体。 在本发明的各个方面，可以将进一步的限制用于上述复合系统。本发明还涉及使用上述复合系统生产稳定的SNARE复合体的方法，以及上述复合系统和得到的稳定的SNARE复合体的用途。
具体实施例方式以下描述说明了本发明的多种不同的实施方式。但是，对本领域技术人员而言显而易见的是，只要是基于上文所述的复合系统的，几乎所有描述的限定、优选的特征及变化都适用于本发明的其他实施方式。根据本发明的一个方面，提供了用于形成分子支架的复合系统，该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋； 一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个附着在所述多肽螺旋上的货物部分；其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，并且其中，至少两个所述多肽螺旋的长度小于50个氨基酸。根据本发明的另一方面，该复合系统未必具有至少两个长度小于50个氨基酸的多肽螺旋。本发明允许由不同的功能单元形成的稳定的复合体的可控组装。具有稳定的复合体的优势在于它可以在相对严格的条件下使用，而没有复合体解离的风险。这意味着，一个或多个货物部分所附着的一个或多个所述螺旋仍将是复合体的一部分，确保了一个或多个货物部分不从该复合体的其余部分上解离。如上所述，该复合系统基于稳定的SNARE复合体的形成。因此，在一定程度上，只要它们能够形成稳定的SNARE复合体，本发明的这四个多肽螺旋可以具有任意的序列。在神经元中，所述SNARE复合体由以下蛋白形成SNAP_25 ;突触融合蛋白；和小突触泡蛋白。这些蛋白，以及其他的SNARE蛋白，含有SNARE基序或SNARE结构域，它们是参与SNATE复合体形成的蛋白的组成部分。这些SNARE结构域或基序是装配在一起以形成SNARE复合体的螺旋。一般来说，只有部分SNARE蛋白而非整个SNARE蛋白参与SNARE复合体的形成。例如，突触融合蛋白具有C-末端跨膜结构域、SNARE结构域和N-末端调节结构域，也被称为头部结构域。显然，只有SNARE结构域参与SNARE复合体的形成。术语“SNARE基序”和“SNARE结构域”是本领域技术人员公知的。此外，各种不同的SNARE蛋白的SNARE基序和SNARE结构域也是本领域技术人员公知的(Jahn R andScheller RH(2006) ；Sieber et al. (2006) ;Besteiro(2006))。本发明的所述四个多肽螺旋基于形成SNARE复合体的SNARE蛋白(即SNAP蛋白；突触融合蛋白；和小突触泡蛋白或其同系物)的SNARE结构域或基序。因此，在一种实施方式中，该复合系统包括两个衍生自SNAP蛋白的SNARE基序的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的SNARE基序的多肽螺旋；和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的SNARE基序的多肽螺旋，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体。本发明的螺旋没有必要与SNARE蛋白的SNARE基序或结构域一样长。只要它与本发明的其它螺旋复合时仍能形成稳定的SNARE复合体，它的长度可以短于SNARE蛋白的SNARE基序或结构域。作为两个多肽螺旋的来源的所述SNAP蛋白可以为任何能够形成部分SNARE复合体的SNAP蛋白。本领域技术人员知道能够形成部分SNARE复合体的各种SNAP蛋白。例如，所述 SNAP 蛋白可以为 SNAP-25A、SNAP-25B、SNAP_23(也被称为 syndet)或 SNAP-29。优选地，所述SNAP蛋白不为a -SNAP。优选地，所述SNAP蛋白是SNAP-25，即SNAP-25A或SNAP-25B。SNAP蛋白含有两个SNARE基序。因此，所述两个多肽螺旋可以衍生自特定的SNAP蛋白中的两个SNARE基序。或者，所述两个多肽螺旋也可以衍生自不同的SNAP蛋白。优选地，它们衍生自同一 SNAP蛋白。 作为多肽螺旋的来源的所述突触融合蛋白可以是任何能够形成部分SNARE复合体的突触融合蛋白。本领域技术人员知道能够形成部分SNARE复合体的各种突触融合蛋白。例如，所述突触融合蛋白可以选自突触融合蛋白lA(syntaxinlA)、突触融合蛋白lB(syntaxinlB)、突触融合蛋白2(syntaxin2,也称为上皮形成素)、突触融合蛋白3(syntaxin3)和突触融合蛋白4 (syntaxin4)、突触融合蛋白5 (syntaxin5)、突触融合蛋白6(syntaxin6)、突触融合蛋白7 (syntaxin7)、突触融合蛋白8(syntaxin8)、突触融合蛋白lO(syntaxinlO)、突触融合蛋白11 (syntaxinll)、突触融合蛋白13 (syntaxinl3)、突触融合蛋白17(syntaxinl7)或突触融合蛋白18 (syntaxinl8)。优选地，所述突触融合蛋白为突触融合蛋白lA(syntaxinlA)或突触融合蛋白3 (syntaxin3)。作为多肽螺旋的来源的所述小突触泡蛋白或其同系物可以为任何能够形成部分SNARE复合体的小突触泡蛋白或同系物。本领域技术人员知道能够形成部分SNARE复合体的各种小突触泡蛋白和同系物。小突触泡蛋白是囊泡相关膜蛋白(VAMP)家族的成员。已知其他的VAMP蛋白能够形成SNARE复合体，并且因此可以适合于提供能够作为多肽螺旋的来源的基础。在一种实施方式中，小突触泡蛋白的同系物是能够形成部分SNARE复合体的VAMP蛋白。这样的VAMP蛋白是本领域技术人员公知的。所述小突触泡蛋白或其同系物可以选自小突触泡蛋白I (synaptobrevinl)、小突触泡蛋白2 (synaptobrevin2)、小突触泡蛋白3 (synaptobrevin3,也称小细胞小泡蛋白)和小突触泡蛋白7 (synaptobrevin7,也称ΤΙ-VAMP)。优选地，所述多肽螺旋来自于小突触泡蛋白。优选地，所述小突触泡蛋白为小突触泡蛋白I (synaptobrevinl)、小突触泡蛋白2 (synaptobrevin2)或小突触泡蛋白3 (synaptobrevin3)。作为SNARE蛋白的起源的生物体可以为利用SNARE复合体的任何合适的生物体。例如，该蛋白可以起源于哺乳动物，如人类、灵长类和啮齿类；鱼；和无脊椎动物，如蝇(flies) ο可选地，所述SNARE蛋白可以衍生自酵母(Rossi G et al. (1997))。作为SNARE蛋白的起源的生物体可以取决于所述复合系统的用途。例如，对于医疗应用，所述SNARE蛋白优选起源于人类。本发明的所述四个多肽螺旋衍生自形成SNARE复合体的SNARE蛋白。所述形成SNARE复合体的SNARE蛋白的SNARE基序或结构域的螺旋的长度通常为约60-70个氨基酸。如上所述，本发明的所述四个多肽螺旋均衍生自所述SNARE蛋白的SNARE基序或SNARE结构域。术语“衍生自”是指所述多肽螺旋的序列基本上与所述SNARE结构域/基序的序列或与它的部分序列相同，以便于能够形成稳定的SNARE复合体。优选地，所述多肽螺旋的序列与选择的SNARE结构域/基序或它的部分应该具有至少约80%的序列同一性。更优选地，所述序列同一性应该是至少约85%，更进一步优选为至少约90%。在一种实施方式中，所述序列同源性可以为至少约95%，至少约98%或甚至为100%。然而，在一些实施方式中，所述多肽螺旋的序列优选与选择的SNARE结构域/基序或它的部分的序列不同。就蛋白表达、蛋白纯化或下游的应用而言这可能是有益的。例如，不作为限制地，这可以包括在序列的任意一端添加组氨酸残基以便于纯化，或加入额外的赖氨酸或半胱氨酸残基，用于该肽与表面或货物的功能连接。两个SNAP衍生的螺旋可以包括选自SEQ ID NOs. 1、2、5、6、24、41、48、49、50、51、64和65所示的序列。突触融合蛋白衍生的螺旋可以包括选自SEQ ID NOs. 3、7、9、25、32、33、34、35、36、37、38、46、47、60、61、62 和 66 所示的序列。
衍生自小突触泡蛋白或其同系物的螺旋可以包括选自SEQ ID NOs. 4、8、27、28、29、30、31、42、43、44、45、52、53、67、68 和 69 所示的序列。进一步地，衍生自SNARE蛋白的螺旋可以由上面的序列组成。此外，本发明的螺旋可以包括选自SEQ ID NOs. 1-9,12_15和18_69所示的序列或由选自于SEQ ID NOs. 1-9，12-15和18-69的序列组成。每个多肽螺旋应该足够长，以便它可以与其他螺旋相互作用，形成稳定的SNARE复合体。实际上，这意味着多肽螺旋必须衍生自SNARE基序/结构域的足够长的部分，以便形成稳定的SNARE复合体。测试多肽螺旋是否足够长以便形成稳定的SNARE复合体是比较简单且完全在本领域技术人员能力范围内的。这可以通过以下方法完成使所述多肽螺旋与其他三个多肽螺旋复合，然后查看在不利条件下得到的SNARE复合体是否解离。不利条件是指那些通常会导致蛋白复合体和蛋白质相互作用的解离的条件。这些条件对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，这些不利的条件可以是将复合体暴露在强的表面活性剂或破坏性的去垢剂下。在一种实施方式中，可以在变性SDS浓度(>0.02%)下，通过SDS-PAGE来测试SNARE复合体，以确定它是否稳定。如果复合体在凝胶中被SDS解离，使其分离为它的各组成部分，则SNARE复合体可能不太稳定。然而，如果在SDS-PAGE凝胶中移动时，SNARE复合体不解离，通过例如用考马斯染色进行检测时仍作为独立的整体，可以认为它是稳定的。因此，在一种实施方式中，如果用SDS时不解离，则认为该SNARE复合体是稳定的。优选地，当使用的是含有约2% SDS的SDS-PAGE凝胶上样缓冲液时，该SNARE复合体是稳定的。更优选地，当使用的是含有约O. I % SDS的SDS-PAGE凝胶时，该SNARE复合体是稳定的。这可以用含有约O. 1% SDS的SDS-PAGE凝胶来完成。或者，SNARE复合体的稳定性可通过玻璃珠pull-down验证。如果该复合系统的一种组分能够以化学计量的方式沉降与其相互作用的全部分子，则该SNARE复合体可以被认为是稳定的。玻璃珠pull-down是本领域技术人员公知的技术((Rickman C. etal. (2004))。测量蛋白质相互作用的表面等离子体共振技术也可以应用于此，并且，这是本领域技术人员公知的技术((KarlSSOn&Falt(1997))。当利用表面等离子体共振技术时，如果没有观察到由表面等离子体共振信号降低所证明的解离，则该SNARE复合体可以被认为是稳定的。另一种确定SNARE复合体是否稳定的方法是确定该复合体的解离常数。这是一个螺旋从该复合体中解离的解离常数。稳定的SNARE复合体的解离常数应小于10_7M。在某些实施方式中，所述稳定的SNARE复合体的解离常数可能会小于10_8M，10_9M，IO^10M, 10_nM，IO-12M, IO-13M, IO-14M或10_15M。根据该复合系统应用的用途，其具有不同的解离常数可能是有益的。因此，在一些实施方式中，解离常数可能为10_7M至10_nM或10_7M至ΙΟ,Μ。或者，所述解离常数可能与抗体解离常数(6-10Χ I(T8M)相当。
也可以通过与复蛋白(complexin)的结合来评价SNARE复合体的形成,所述复蛋白与完全形成的SNARE复合体结合(Hu et al. (2002))。在一种实施方式中，本发明的所述多肽螺旋的长度至少为约25个氨基酸。在溶液中使用这种螺旋可形成SNARE复合体。然而，他们未必是SDS耐受的。优选的是，本发明的所述多肽螺旋具有至少约30或约35个氨基酸的长度。更优选的是，本发明的所述多肽螺旋具有至少约40个氨基酸的长度。使用这样的多肽螺旋形成的SNARE复合体一般是SDS耐受的。或者，所述多肽螺旋可以具有至少约45个氨基酸的长度在一种实施方式中，至少一个所述多肽螺旋的长度小于50个氨基酸。这样的好处是，这些长度小于50个氨基酸的多肽螺旋更容易人工生产。所述小于50个氨基酸的多肽螺旋可以是任何的多肽螺旋。优选地，至少有两个多肽螺旋的长度小于50个氨基酸。优选地，它们是衍生自突触融合蛋白和小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋。在可替代的实施方式中，三个或四个所述多肽螺旋的长度可能小于50个氨基酸。在这样的实施方式中，螺旋的任何组合的长度可以小于50个氨基酸。发明人出乎意料地发现每个SNARE蛋白的SNARE基序的最小的肽序列，都足以形成高亲和力的稳定的四螺旋束的SNARE复合体。这对于肽的易于生产是有好处的。此外，每个最小的序列可以携带保留功能的货物。若所述多肽螺旋中的两个的长度小于50个氨基酸，它们优选是衍生自长度小于50个氨基酸的突触融合蛋白和小突触泡蛋白或其同系物的螺旋。本发明的所述四个多肽螺旋的长度可能几乎相同或不同。例如，在一种实施方式中，它们的长度可能都是约45个氨基酸。或者，所述多肽螺旋的长度可能不同。在本发明的一种实施方式中，衍生自突触融合蛋白的多肽和/或衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽，可能还含有膜附着序列，以使所述SNARE复合体固定在膜上或脂双层上。这些膜附着序列是本领域技术人员公知的。例如，突触融合蛋白和小突触泡蛋白的天然序列含有跨膜部分，可允许蛋白附着到囊泡膜和细胞膜上(Kasai and Akagawa (2001)and Laage et al. (2000))。因此,在一种实施方式中，衍生自突触融合蛋白的所述多肽螺旋还可以含有衍生自突触融合蛋白跨膜结构域的膜附着序列，以使多肽螺旋固定在膜上或脂双层上。同样，衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋可以进一步含有衍生自小突触泡蛋白或其同系物跨膜结构域的膜附着序列，以使多肽螺旋固定在膜上或脂双层上。在通常会导致蛋白复合体和蛋白质相互作用的解离的不利条件下，稳定的SNARE复合体不会解离。这可以通过以下方法测定，例如，用SDS-PAGE,玻璃珠pull-down,固定蛋白的表面等离子体共振，解离常数或复蛋白结合。上面有更详细的讨论。由于对SNARE复合体的研究很深入，本领域技术人员公知的是，本领域技术人员能够确定特定蛋白是否适用于本发明，以及如何操作这些蛋白和它们的序列，以生产本发明的多肽螺旋，以使它们能够形成稳定的SNARE复合体。所述一个或多个货物部分可以是本领域技术人员想要附着到多肽螺旋上的任何部分。所述一个或多个货物部分优选附着在所述复合系统中的螺旋的末端。所述货物部分可以选自小分子，含有小分子的聚合物，多肽，蛋白，核酸或其衍生物，以及粒子或纳米粒子。例如，所述货物部分可以是I、小分子或含有小分子的聚合物，如
-亲和标签，例如生物素；-治疗的，例如毒素或药物；
-进一步/下游交联、聚合以及进一步衍生的反应基团，例如氨基，羧基，巯基，胍基，酚基，硫醚基，咪唑基，吲哚基等；-适于进一步修饰的自发性反应基团，例如用于与SH交联的马来酰亚胺或其衍生物，或其他任何适于交联的化学基团；-直接附着在表面的分子，如用于附着到金属表面的含巯基分子；-成像试剂，例如用于紫外光谱，可见光光谱，红外光谱，拉曼光谱，核磁共振，MRI，PET, X射线或其他成像的荧光部分或可吸收部分；-生物相关的配体，例如用于受体结合/靶向；-生物相关的底物，例如磷酸化或其他的PTM位点；-生物相关的分子，例如脂质或碳水化合物；-保护基团或分子，例如聚乙二醇；-金属螯合化合物；2、多肽或蛋白，如-结合肽，激素、毒素等；-含有功能位点的多肽或蛋白，如蛋白酶消化位点；-靶向功能的肽，例如不同细胞器靶向的，核靶向的(用于转染)，细胞内靶向的(用于药物递送)等；-肽亲和标签，例如Flag, Myc, VSV, HA, 6XHis, 8Xhis, poly-His 等；-能够形成蛋白质相互作用的多肽或蛋白，例如H)Z，SH2/3；-抗体，抗体片段，抗体类似物，基于RNA的适配子或基于肽的适配子，或其他亲和试剂(蛋白质的(proteinous)或非蛋白质的)；-酶，例如用于研究，诊断(一些应用中所述复合系统可以用来固定酶)和治疗用途，用于核苷酸(包括启动子)的合成或扩增，聚合酶，限制性内切酶，或其他修饰酶；3、核酸或衍生物，例如-用于检测，固定，杂交，启动合成，合成和扩增，标记，信号检测和信号放大，转录和翻译的DNA，RNA或PNA ；4、粒子或纳米粒子，例如-铁磁颗粒或纳米粒子(用于分离);-树状聚体(用于标记)；-金属粒子或纳米粒子，例如用于染色或标记的金或银；-半导体粒子或纳米粒子，例如用于标记和检测的量子点；-聚合物微米粒子或纳米粒子,例如树脂,凝胶等。-碳纳米管或纳米线在一种实施方式中，多个货物部分可附着到所述多肽螺旋的末端。可以附着到所述多肽螺旋末端的货物部分的数目将取决于所述螺旋具有多少自由末端。例如，当复合系统包括四个独立的多肽螺旋时，该螺旋将有八个自由末端(每个螺旋的每个末端具有一个)。因此，可以将货物部分附着到8个自由末端的每一个上。这意味着，1，2，3，4，5，6，7或8个货物部分可以附着到该螺旋的自由末端。一些螺旋没有自由末端，例如，如果两个螺旋连接在一起或一个螺旋附着于基质，自由末端的数量就减少了。这将减少能够附着到螺旋末端的货物部分的数目。在一种实施方式中，两个或两个以上的货物部分可附着到螺旋的末端。在一种具体实施方式
中，第一货物部分附着到第一螺旋的末端上，第二货物部分附着到第二螺旋的末端上。在这样的实施方式中，所述第一货物部分和第二货物部分不应一起附着在同一螺旋或含有螺旋的组分上。他们应该附着到单独的螺旋或含有螺旋的组分上。例如，两个货物部分可附着到两个单独的螺旋上。当衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接时(在后面详细描述)，所述第一货物部分和第二货物部分不应都附着到这个双螺旋的组分上。取而代之的是，第一货物部分附着到所述小突触泡蛋白/突触融合蛋白融合蛋白上，第二货物部分可附着到衍生自S NAP蛋白的一个螺旋上。当所述复合系统的四个多肽螺旋连接在一起形成两个含有螺旋的组分时(稍后将详细描述)，所述第一货物部分应该附着到第一含螺旋的组分上，而所述第二货物部分应附着到第二含螺旋的组分上。在一种实施方式中，所述第一货物部分是酶部分或成像部分。在另一种实施方式中，所述第二货物部分是使复合系统靶向特定靶标的配体，例如，特定类型的细胞或特定的受体。优选地，在同一实施方式中，所述第一货物部分是酶部分或成像部分，所述第二货物部分是使复合系统靶向特定靶标的配体，例如，特定类型的细胞或特定的受体。酶试剂或成像试剂可以是任何合适的试剂。成像试剂可以是任何能够附着到螺旋上并使所述螺旋的位置成像的试剂，例如，GFP荧光标签，荧光标记肽，以及磁共振造影剂。所述酶试剂可以是任何酶或其功能部分。在一种实施方式中，所述酶试剂或成像试剂是酶试剂。在一种特定实施方式中，所述酶试剂含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分。肉毒杆菌毒素的轻链的功能是作为肽链内切酶。因此，肉毒杆菌毒素的轻链的功能部分是保留了所述肽链内切酶的活性的那个部分。优选地，所述酶试剂含有肉毒杆菌毒素的轻链。肉毒杆菌毒素的轻链可以来自任何的肉毒杆菌毒素。肉毒杆菌毒素有七种不同的类型，为A，B，C，D，E，F和G。优选地，所述轻链来自肉毒杆菌毒素A或E，更优选地，所述轻链来自肉毒杆菌毒素A。优选地，所述酶试剂含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分。所述肉毒杆菌毒素的重链的易位部分允许与它相关的轻链从囊泡释放到细胞的细胞溶胶中。本领域技术人员会很容易了解术语“肉毒杆菌毒素的重链的易位部分”(也被称为易位结构域)的含义。所述肉毒杆菌毒素的重链的易位部分可以来自任何肉毒杆菌毒素。优选地，所述易位部分来自肉毒杆菌毒素A或E，更优选地，来自肉毒杆菌毒素A。所述轻链或其功能部分和所述易位部分可以来自相同或不同的肉毒杆菌毒素。优选地，所述轻链或其功能部分和所述易位部分来自同一肉毒杆菌毒素。所述轻链或其功能部分以及易位部分可以以任何合适的方式连接。优选地，它们通过二硫键连接，正如在天然发生的肉毒杆菌毒素中的那样。如果肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分是通过氨基酸链之间的肽键连接的，优选地，在肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分和肉毒杆菌毒素的重链的易位部分之间的氨基酸序列存在切割位点(nickingsite)，该切割位点可被蛋白酶识别，以引起两部分之间的氨基酸序列的断裂。在一种实施方式中，所述切割位点是凝血酶位点，其可被凝血酶切割。肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分和肉毒杆菌毒素的重链的易位部分可附着到衍生自SNAP蛋白的一个多肽螺旋上。
肉毒杆菌毒素的轻链的序列可以具有如SEQ ID NO. 70所示的序列。肉毒杆菌毒素的重链的易位部分的序列可以具有如SEQ ID NO. 71所示的序列。当所述货物部分是配体时，它可以是任何使复合系统靶向特定靶标的合适的配体，例如，特定类型的细胞或特定的受体。这样的配体是本领域技术人员公知的。例如，该配体可能能够结合细胞表面受体。这些配体可以包括神经肽如P物质，神经肽Y和VIP，生长因子如NGF和BDNF，以及激素如垂体激素(如促肾上腺皮质激素ACTH，促甲状腺激素TSH，泌乳素PRL，生长激素GH，内啡肽，FSH, LH，催产素，抗利尿激素ADH和AVP)，促性腺激素释放激素GNRH和CGRP。在一种特定的实施方式中，所述配体是生长抑素肽(somatostatinpeptide)或允许生长抑素肽结合到生长抑素受体的生长抑素肽的功能部分。在其他实施方式中，所述配体可能是P物质肽(substance P peptide)或能够使P物质肽结合到神经激肽受体的P物质肽的功能部分，或者，所述配体是AVP肽或能够使AVP肽结合到AVP受体上的AVP肽的功能部分。在一可选择实施方式中，所述配体可以是肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。所述肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分负责神经元神经节苷脂的识别，并与突触囊泡受体(synaptic vesicle receptor)结合，SV2C,使毒素内吞进入细胞。术语“肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分”(也被称为受体结合域)很容易被本领域技术人员理解。所述受体结合部分可以来自任何肉毒杆菌毒素。优选地，所述受体结合部分来自肉毒杆菌毒素A或E，更优选地，所述受体结合部分来自肉毒杆菌毒素A。在一种实施方式中，所述肉毒杆菌毒素的重链的受体结合域附着在衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋上。所述肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分的序列可以具有如SEQ ID NO. 72所示的序列。本发明还提供了上述复合体用于治疗和/或诊断。治疗和/或诊断的确切性质将取决于配体和酶试剂/成像试剂的一致性。在一种实施方式中，其中，第一货物部分附着到第一螺旋的末端且第二货物部分附着到第二螺旋的末端，所述第一货物部分是含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分和肉毒杆菌毒素的重链的易位部分的酶试剂，且所述第二货物部分是配体，该配体是肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。在可选择的实施方式中，所述第一货物部分是含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分和肉毒杆菌毒素的重链的易位部分的酶试剂，第二货物部分是配体，该配体是生长抑素肽或其功能部分。—个或多个货物部分可直接或通过连接器(linker)连接到螺旋的末端。合适的连接器是本领域技术人员公知的。例如可以通过化学方法完成，或者如果所述货物部分是蛋白或多肽，可以通过重组方法完成。所述货物部分也可通过连接器来连接。这些连接器为本领域技术人员所熟知。在形成SNARE复合体之前，四个多肽螺旋应是四个单独的螺旋，不以任何方式连接在一起。在一个实施方式中，所述螺旋中的两个可连接在一起，这样所述复合系统包括三个独立的组分(以下简称三组分系统)。只要这两个螺旋能够组装进同一稳定的SNARE复合体中，这两个螺旋可以通过任何合适的方式连接在一起。所述两个螺旋可以通过重组的方式或化学偶合连接在一起。所述两个螺旋也可以通过连接器连接在一起。术语“连接”是指螺旋的线性连接(这与发生在类似于“扣紧(zippering) ”的平行定位中的螺旋的结合是截然相反的)。两个螺旋连接在一起有助于简化复合系统。任何两个螺旋可能被连接在一起。在一个实施方式中，衍生自SNAP蛋白的两个多肽螺旋连接在一起。这样做的好处是，可以使用全长SNAP蛋白，例如，全长的SNAP-25蛋白，所述全长SNAP蛋白在蛋白中含有两个多肽SNARE螺旋。或者，衍生自突触融合蛋白的螺旋多肽可与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接。在另一种实施方式中，所述螺旋中的两个连接在一起，同时所述螺旋中的另外两个也连接在一起。这将产生包括两个独立组 分的复合系统(以下简称双组分系统)，并进一步简化了系统。这两套螺旋可以通过任何合适的方式连接在一起，只要它们仍然可以形成稳定的SNARE复合体。例如，这两套螺旋可通过重组的方式或化学偶合连接在一起。一套或两套螺旋可以通过连接器连接在一起。任何螺旋的组合可连接在一起形成两套螺旋。优选地，衍生自SNAP蛋白的两个多肽螺旋连接在一起，衍生自突触融合蛋白和小突触泡蛋白或同系物的螺旋也连接在一起。这允许使用像SNAP-25 —样的全长的SNAP蛋白。在可选择的双组分系统中，所述螺旋中的三个可以连接在一起。只要它们仍然可以与第四个螺旋形成稳定的SNARE复合体，这三个螺旋可以通过任何合适的方式连接在一起。例如，这三个螺旋可通过重组的方式或化学偶合连接在一起。这三个螺旋也可以通过其中两个螺旋间的连接器或所有的三个螺旋间的连接器连接。任何三个螺旋都可以连接在一起。优选地，衍生自SNAP蛋白的两个多肽螺旋与第三个螺旋，即衍生自突触融合蛋白的螺旋或衍生自小突触泡蛋白或其同系物的螺旋，连接在一起。在一个特定实施方式中，衍生自SNAP蛋白的两个多肽螺旋与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接在一起。在一个可选择的实施方式中，衍生自SNAP蛋白的两个多肽螺旋与衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋连接在一起。在一个实施方式中，货物部分附着到第四个单独的螺旋上，例如，当衍生自SNAP蛋白的两个多肽螺旋与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接在一起时，附着到突触融合蛋白上。对于本领域技术人员来说，这些双组分系统是二元试剂(binary reagents),可应用于类似抗体-抗原相互作用的亲和应用上。例如，FLAG表位可以附着到目标蛋白，并被其同源抗体所识别，如同可将突触融合蛋白衍生的标签添加到目标蛋白上，并被SNAP25的三螺旋构建体和小突触泡蛋白螺旋所识别。三螺旋SNARE构建体和单独的SNARE标签之间的相互作用的亲和力可能允许蛋白的固定，或对于其他应用是可逆的。三螺旋构建体的生产比抗体更便宜，因此，这是有利的。据悉，突触融合蛋白3的头部结构域保护其SNARE基序以避免进行SNARE的组装，但某些去垢剂和/或脂质可以“开启”突触融合蛋白用于SNARE的组装(Darios andDavletov(2006) ；Rickman and Davletov(2005))。因此,在一种实施方式中，突触融合蛋白衍生的螺旋具有附着其上的突触融合蛋白的头部结构域，该系统还包括去垢剂，优选是温和的去垢剂，如辛基批喃葡萄糖苷(octylglucopyranoside)以开启突触融合蛋白分子，以便形成稳定的SNARE复合体。这可以控制突触融合蛋白SNARE的基序，由此实现对SNARE复合体形成的调控。此外，该系统可以进一步包括去垢剂，无论突触融合蛋白3的头部结构域是否附着到衍生自突触融合蛋白的多肽上。发明人发现本发明中去垢剂的存在有助于促进SNARE复合体的组装。优选地，所述去垢剂是温和的去垢剂。有些组装体在不存在去垢剂时发生，但去垢剂的存在促使SNARE复合体更有效地组装。优选地，所述去垢剂的浓度高于临界胶束浓度(CMC)，这是去垢剂开始形成胶束的浓度。优选地，所述去垢剂具有7-12个碳原子长的碳链。优选地，所述去垢剂不是Triton X-100或Thesit。合适的去垢剂可以选自由MEGA 8，C-HEGA 10，CHEGA 11，HEGA 9，庚基吡喃葡萄糖苷，辛基吡喃葡萄糖苷，壬基吡喃葡萄糖苷，zwittergent 3-08, zwittergent 3-10,和 zwittergent 3-12 组成的组。优选地，所述去垢剂是辛基吡喃葡萄糖苷。包括去垢剂，具体为温和去垢剂的该系统的优势是，它允许控制和加快SNARE复合体的组装。去垢剂的存在也可以帮助优先形成SNARE复合体，因为其他的蛋白质相互作用被该去垢剂破坏了。在一个实施方式中，所述螺旋中的一个可被固定在基质上。优选地，该螺旋固定在基质上。该螺旋可以以任何合适的方式固定，这些方式为本领域技术人员熟知。该螺旋可通过连接器固定。所述基质可以是任何适合固定螺旋的基质。例如，该基质可能是表面，基体，珠子，量子点，树脂，玻璃，金属，聚合物，显微镜载玻片，阵列或纳米管如碳纳米管。在一实施方式中，该螺旋被固定在其上未附着货物部分的基质上。在另一个实施方式中，所述复合系统可以进一步包括衍生自复蛋白的多肽螺旋。所述衍生出多肽螺旋的复蛋白可以是任何能够结合SNARE复合体的复蛋白蛋白。本领域技术人员知道能够与SNARE复合体结合的各种复蛋白蛋白。例如，所述复蛋白蛋白可以选自哺乳动物的复蛋白I或复蛋白2的同工型。衍生自复蛋白蛋白的螺旋的其他优选特点和属性(如大小)与其他螺旋相同。衍生自复蛋白的螺旋可以选择性的携带一个或两个货物部分。由于复蛋白部分只与已形成的SNARE复合体结合，它也可以用于特异性地纯化组装的复合体。衍生自复蛋白的螺旋可含有如SEQ ID NO. 63所示的序列。所述衍生自复蛋白的螺旋可以由这个序列组成。本发明的一种可选择的实施方式涉及SNARE复合体，其中，衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接。在此实施方式中，提供了一个用于形成分子支架的复合系统，该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个附着在所述多肽螺旋上的货物部分；其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，并且其中，衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接。本发明的该实施方式涉及上面所描述的三组分系统，其中，衍生自突触融合蛋白 的多肽螺旋与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接。对本领域技术人员显而易见的是，几乎所有的上述说明书描述的关于含有长度小于50个氨基酸的螺旋的复合系统的限定和优选的特征，都等同适用于含有衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋和与其连接的衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋的上述系统中。例如，在这个系统中，衍生自SNAP蛋白的两个螺旋也可能如上所述连接在一起，以生成双组分系统。本领域技术人员应该领会到，两个螺旋的长度不需要小于50个氨基酸。本发明的另一实施方式，涉及以上所述的两个双组分系统，提供了一个用于形成分子支架的复合系统，该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋； 一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个附着在所述多肽螺旋上的货物部分；其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，并且其中，所述多肽螺旋连接在一起，以形成两个含有螺旋的组分。如上所述，所述双组分系统可通过两种方式形成。首先，所述螺旋中的两个可以连接在一起，所述螺旋中的另外两个可以连接在一起，以形成两个组分，每一组分包括2个螺旋。或者，所述螺旋中的三个可以连接在一起，得到含有三个螺旋的组分，可以与剩下的单独的螺旋形成SNARE复合体。几乎所有对上述含有长度小于50个氨基酸的螺旋的复合系统的描述，都同样适用于上述含有两个组分的系统。哪部分适用于双组分系统对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，所述双组分系统不需要具有两个长度都小于50个氨基酸的螺旋。在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于形成包括两个货物部分的二元复合物(binary compound)的复合系统,该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分与第一螺旋连接，第二货物部分与第二单独的螺旋连接，并且其中，所述SNARE复合体的形成导致了所述二元复合物的形成。词语“二元复合物”，是指由两个独立的部分(货物部分)组成的复合物，当两部分结合时，该复合物能够行使其功能。该复合物的功能将取决于复合物的两个独立的部分的功能或鉴定。优选地，第一货物部分具有第一功能，且第二货物部分具有第二功能。如上所述，第一货物部分可能具有酶功能或成像功能，第二货物部分可能具有靶向功能。这使该复合物靶向到特定位置，在这个位置上，酶部分或成像部分能够行使其功能。在一个实施方式中，所述二元复合物可能是由不同单元形成的多肽。所述多肽可能是由不同单元形成的毒素。合适的毒素是肉毒杆菌毒素，白喉毒素，破伤风毒素和蓖麻毒素。适合在本发明的系统中使用的肽和毒素对本领域技术人员来说是显而易见的。例如所述肉毒杆菌毒素由三个不同的部分组成受体结合部分；易位部分；和酶部分。因此，酶部分和易位部分可以形成一个部分(货物部分)，而受体结合部分可以形成第二个部分(货物部分)，当它们被复合系统聚集在一起时，功能型肉毒杆菌毒素便形成了。同样，蓖麻毒素，破伤风毒素和白喉毒素可分为两个部分，这样，当它们聚集在一起时便形成了功能型毒素。在一种实施方式中，所述第一货物部分具有第一功能，且所述第二货物部分具有第二功能，当它们聚集在一起时，形成功能齐全的肽，如毒素。由不同单元形成的并且能以上面描述的方式应用的肽的选择，在本领域技术人员的能力范围之内。例如，US2009/0035822描述了功能蛋白由独立部分的形成。白喉毒素，破伤风毒素和蓖麻毒素，能用于治疗，例如，治疗肿瘤疾病。因此，涉及这些多肽的复合系统可用于肿瘤疾病的治疗。它们还可以被用于治疗的方法，包括将含有复合系统的有效量的组合物给药至受试者。本发明还提供了一种形成SNARE复合体以形成含有两个货物部分的二元复合物的方法，该方法包括将两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，以及一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋结合在一起，以形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分附着到第一螺旋，且第二货物部分附着到第二单独的螺旋，并且其中，所述SNARE复合体的形成导致了所述二元复合物的形成。
在另一具体实施方式
中，本发明提供了一种用于形成肉毒杆菌毒素的复合系统，该复合系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；和 一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分附着到第一螺旋，且第二货物部分附着到第二单独的螺旋，并且其中，所述第一货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分，且所述第二货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。本发明的该实施方式涉及SNARE复合体组装的具体应用，其中，肉毒杆菌毒素可以以单独的部分生产，从而避免制造过程中的与完整毒素相关的任何风险。利用SNARE复合体的形成可使这两部分连接起来，以形成功能型的肉毒杆菌毒素。本发明还提供上面所描述的复合系统的应用。进一步地，本发明提供上面所描述的该复合系统在治疗中的应用，也提供在治疗通过抑制神经突触而缓解的疾病或状况中的应用。本领域技术人员会充分了解疾病及通过抑制神经突触所缓解的疾病或状况，因为肉毒杆菌毒素A多年来已经被广泛用于医疗和美容中(见，例如，Jankovic (2004). JNeurol Neurosurg Psychiatry 75951-957)。具体地，有些通过抑制神经突触所缓解的疾病或状况选自以下组成的组过度出汗(excessive sweating),过度流涎(excessivesalivation),肌张力失常(dystonias),胃肠疾病，泌尿疾病，面肌疫挛(facialspasms),斜视，大脑性瘫痪，口吃，慢性紧张性头痛(chronic tension headaches),hyperlacrymation，多汗症(hyperhidrosis,)，咽下缩肌疫挛(spasms of the inferiorconstrictor of the pharynx),疫挛性膀胱(spastic bladder),疼痛(pain)，偏头痛，以及美容(如减少皱纹，抬头纹(brow furrow)等)本发明还提供一种治疗方法，该方法包括将有效量的上述复合系统给药至受试者。本发明还提供了一个形成SNARE复合体以形成肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括将两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋结合在一起，由此形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分附着到第一螺旋，且第二货物部分附着到第二单独的螺旋，其中，所述第一货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分，且第二货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。该方法会导致肉毒杆菌毒素的两个部分聚集在一起，从而产生全功能的肉毒杆菌毒素。此外，本发明提供用于形成肉毒杆菌毒素的组分，该组分包括衍生自SNAP蛋白、突触融合蛋白、小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，该多肽螺旋附着到含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分的货物部分上。本发明也提供用于形成肉毒杆菌毒素的组分，该组分包括衍生自SNAP蛋白、突触融合蛋白、小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，该多肽螺旋附着到含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分的货物部分上。此外，本发明提供了上述组分的应用，以及试剂盒，该试剂盒包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分附着到第一螺旋，且第二货物部分附着到第二单独的螺旋，并且其中，所述第一货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分，且所述第二货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。本领域技术人员可以领会的是，以上所描述的与肉毒杆菌毒素相关的实施方式可包括进一步的限制，并且本文其他地方描述的与本发明其他方面和实施方式相关的限制也同样适用于这些肉毒杆菌毒素的实施方式。在一个与去垢剂相关的具体实施方式
中，本发明提供了一种用于形成分子支架的复合系统，该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，并且其中，所述SNARE复合体在去垢剂的存在下形成。上述与复合系统相关的各种特征和限制，同样适用于本发明的该实施方式。此前，已被证明的是，花生四烯酸允许SNARE复合体在Muncl8的存在下形成(Rickman C and Davletov B (2005)) Munc 18被认为是SNARE复合体形成的负调节因子。发明人出乎意料地发现，不存在MunclS时，去垢剂可允许更好的SNARE复合体的形成。优选地，存在去垢剂的系统中，该系统不包括Muncl8蛋白。该系统是无Muncl8系统。本发明还提供了在无MunclS时，去垢剂用于促进SNARE复合体组装的用途。优选地，所述去垢剂是温和的去垢剂。优选地，所述去垢剂是合成的去垢剂。在一种实施方式中，所述去垢剂具有7-12个碳原子长度的碳链。以上所述的所有本发明的实施方式都涉及复合系统，其中，单一稳定的SNARE复合体由一个或多个附着到该SNARE复合体上的货物部分生成。这在很多应用中都是有用的，例如，诊断。该系统还可以应用于标记蛋白的亲和纯化的标签，蛋白或细胞的固定，或鉴定标记的蛋白(ELISA，Western blot)。基质上货物的固定在诊断和基因芯片方面有用处。对本领域技术人员来说，SNARE复合体的稳定性对于微流体(microfluidics)或连续流(continuous flow)应用中货物的固定具有特别的用处,这是显而易见的。进一步的应用介绍如下溶液应用-重组亲和试剂的组装,包括组合组装,聚寡聚(poly-oligomerisation),同源寡聚(homo-oligomerisation)和异质寡聚(hetero-oIigomerisation)；-功能性货物的靶向输送，例如，药物递送(药物为小分子，核酸，蛋白)。例如，用于靶向组装和货物的内在化信号；
-蛋白分子和分子复合体的标签和标记，所述分子复合体包括蛋白分子，细胞，组织，器官和含有蛋白分子的生物体；-用于二元复合物的组装，例如功能性蛋白，酶，因子，辅因子(以及任何其他的功能性蛋白)，FRET标签，二元无机化合物和小分子，二元有机化合物；-蛋白结构的自组装，和含蛋白(如孢子)的更复杂组装，-蛋白在自组装结构的表面上的组装后固定。固体表面应用-阵列，表面固定；-免疫检测(如ELISA)的孔板表面修饰和蛋白的固定；-BIAcore和其他SPR(表面等离子体共振)仪器,表面修饰和蛋白的固定；-QCM(石英晶体微天平)的仪器表面修饰和蛋白的固定；-MALDI质谱的板表面修饰和蛋白的固定；-微流体(microfluidic)仪器的表面修饰和蛋白的固定；-毛细管电泳的表面修饰和蛋白的固定；-层析柱和固定介质(如珠子)的表面修饰和蛋白的固定；-扫描探针显微镜表面和针的修饰以及蛋白的固定；-微热量测定仪和纳热量测定仪传感器的表面修饰和蛋白的固定；-微粒子和纳米粒子的表面修饰；-固体表面(如镀金玻片)，薄膜，线(如纳米线)和纳米管的表面修饰。其他应用-纳米生物技术，例如将表面与基于可生物降解蛋白的自组装“胶合剂(glue) ” “粘结(gluing) ” 在一起；-基于蛋白的纤维和聚合物；-组织支架和组织工程。此外，本发明提供上述复合系统的任何实施方式的应用，具体地，在上述任何应用中的应用。例如，本发明提供了复合系统在诊断中的应用，如阵列，检测器(assay)，微流体设备，SPR仪,石英晶体微天平仪,质谱仪(mass spectrometer),电泳仪,层析柱,扫描探针显微镜，或热量测定仪(calorimetry instrument)。例如,所述复合系统可用于阵列中以将抗体固定在基质上。
在一种实施方式中，本发明提供了一个其上固定有稳定的SNARE复合体的仪器，所述SNARE复合体包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和
一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分，其中，所述仪器选自阵列设备，检测设备，微流体设备，SPR仪，石英晶体微天平仪器，质谱仪，电泳仪，层析柱，扫描探针显微镜，和热量测定仪。本发明还提供了一种形成携带一个或多个货物部分的SNARE复合体的方法，该方法包括将两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋结合在一起，以形成稳定的SNARE复合体，其中，一个或多个货物部分与所述多肽螺旋附着，并且其中(i)衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接；(ii)所述多肽螺旋连接在一起，以形成两个含螺旋的组分；或者(iii)至少有两个多肽螺旋的长度小于50个氨基酸。有关本发明的系统的以上描述和限制，也同样适用于上述方法。本发明还提供了一个组分，该组分含有与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接的、衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，并且其中，两个连接的螺旋能够形成稳定的SNARE复合体的一部分。在一种实施方式中，所述两个螺旋连接在一起以使它们可以组装进同一稳定的SNARE复合体。或者，所述两个螺旋可能被连接在一起，以使它们不能组装进同一稳定的SNARE复合体。在这种替代的实施方式中，这两个螺旋应可以组装进不同的稳定的SNARE复合体。本发明的两个螺旋组分含有衍生自突触融合蛋白的螺旋和衍生自小突触泡蛋白或其同系物的螺旋，其可具有以下序列中的其中之一所示的序列SEQ ID NO. 12,13，14 和 73。突触融合蛋白3(1-260)/小突触泡蛋白2(1-84)(突触融合蛋白具有头部结构域和连接器)-SEQ ID NO. 12突触融合蛋白3(195-253)/小突触泡蛋白2 (1_84)(突触融合蛋白没有头部结构域，但有连接器)-SEQ ID NO. 13突触融合蛋白3(1-253)/小突触泡蛋白2 (29_84)(突触融合蛋白有头部结构域，但没有连接器)-SEQ ID NO. 14突触融合蛋白3(195-253)/小突触泡蛋白2 (29_84)(突触融合蛋白无头部结构域，也没有连接器)_SEQ ID NO. 73本发明的所述两个螺旋组分含有衍生自突触融合蛋白的螺旋和衍生自小突触泡蛋白或其同系物的螺旋，其可能由上述序列之一构成。所述两个螺旋组分可以进一步含有一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分。本发明还提供一个组分，该组分含有两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，以及一个要么衍生自小突触泡蛋白的多肽螺旋，要么衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，其中，这三个螺旋连接在一起以形成三 螺旋组分，并且其中，这三个连接的螺旋能够形成稳定的SNARE复合体的一部分。在一种实施方式中，这三个螺旋衍生自小突触泡蛋白。在另一实施方式中，这三个螺旋连接在一起，使它们能够组装进同一稳定的SNARE复合体。含有SNAP-25螺旋和衍生自小突触泡蛋白或其同系物的螺旋的本发明的三螺旋组分可具有SEQ ID NO. 15。进一步地，该三螺旋组分可由该序列组成。或者，这三个螺旋可以连接在一起，使两个SNAP螺旋可以组装进同一稳定的SNARE复合体，但第三个螺旋不能组装到与两个SNAP螺旋相同的稳定的SNARE复合体上。在这种可选择的实施方式中，所述第三个螺旋应该能够组装到与两个SNAP螺旋不同的稳定的SNARE复合体上。这个三螺旋组分可进一步含有一个或多个与所述多肽附着的货物部分。此外，本发明提供了上述组分的应用，例如，形成稳定的SNARE复合体用于形成分子支架。本发明还进一步提供了一个试剂盒，该试剂盒包括含有与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接的、衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋的组分，并且其中，两个连接的螺旋能够形成稳定的SNARE复合体的一部分。该试剂盒可进一步包含两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，其可与突触融合蛋白/小突触泡蛋白衍生的螺旋形成稳定的SNARE复合体。这两个SNAP螺旋可连接在一起。在一可选择的实施方式中，本发明提供了一个试剂盒，该试剂盒包括含有两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，和一个要么衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，要么衍生自小突触泡蛋白的多肽螺旋的组分，其中，这三个螺旋结构连接在一起，形成三螺旋组分，并且其中，这三个连接的螺旋能够形成稳定的SNARE复合体的一部分。该试剂盒可进一步包括衍生自第四SNARE蛋白的单独的多肽螺旋。所以，如果三螺旋组分含有两个SNAP衍生的螺旋和一个小突触泡蛋白或其同系物衍生的螺旋，该试剂盒可进一步包括单独的衍生自突触融合蛋白的多肽，其可与连接的SNAP/小突触泡蛋白衍生的螺旋形成稳定的SNARE复合体。或者，如果这个三螺旋组分含有两个SNAP衍生的螺旋和一个突触融合蛋白衍生的螺旋，该试剂盒可进一步包括单独的衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其可与连接的SNAP/突触融合蛋白衍生的螺旋形成稳定的SNARE复合体。本发明的试剂盒可进一步包括可与此试剂盒一起应用的合适的试剂。该试剂盒的所述螺旋和SNARE复合体的进一步特征如上所述。所述复合系统也可以用来形成SNARE复合体的多聚体。这是很多的SNARE复合体连接在一起。在一个实施方式中，两个螺旋以这样的方式连接在一起以使它们在同一复合体中不能形成稳定的SNARE复合体。然而，这两个螺旋应该以这样一种方式连接在一起以使它们每个在不同的SNARE复合体中都能形成稳定的SNARE复合体。这可以通过直接将螺旋连接在一起来实现，无需任何类型的连接器，以使这两个螺旋在同一 SNARE复合体中不能采取正确的构象。相反，在这样双螺旋连接构建体中的每个螺旋能够与三个其他多肽螺旋复合，以形成两个稳定的SNARE复合体。这两个螺旋可以任何合适的方式连接在一起，例如，通过重组的手段或化学偶合。举一个双组分系统为例，在该双组分系统中，两个衍生自SNAP蛋白的螺旋连接在一起，且衍生自突触融合蛋白和小突触泡蛋白的两个螺旋以限制性的方式连接在一起使它们不能组装进同一 SNARE复合体中。从突触融合蛋白-小突触泡蛋白融合蛋白开始，SNAP融合蛋白将与突触融合蛋白复合。来自其他突触融合蛋白-小突触泡蛋白融合蛋白的小突触泡蛋白将与SNAP-突触融合蛋白的复合体相结合形成四-螺旋SNARE复合体。该复合体将具有从其伸出的突触融合蛋白螺旋和小突触泡蛋白螺旋，来自突触融合蛋白-小突触泡蛋白融合蛋白中的一个。这些单独的螺旋突起是进一步形成多个SNARE复合体的基础。因此，SNARE复合体的多聚体形成了。在上面的例子中，所述SNAP螺旋没有连接在一起。此外，在此系统中任何两个螺旋都可以连接在一起工作，只要它们都不能组装进同一复合体中形成稳定的SNARE复合体。
本发明还提供了通过上述系统生产的多聚体。或者，可通过控制系统的反应条件来形成多聚体。该系统的两个螺旋必须结连接在一起。这可以通过任何合适的方式。这两个螺旋并不需要限于上述例子中的任何方式，虽然需要的话它们可以利用那些方式。该系统还包括单独的衍生自同一 SNARE蛋白的螺旋，作为两个连接在一起的螺旋之一。例如，在含有突触融合蛋白-小突触泡蛋白融合蛋白的系统中，该系统可进一步含有单独的突触融合蛋白螺旋。为了生产多聚体，所述单独的突触融合蛋白螺旋溶解到溶液中。如上面所讨论的那样，这个单独的螺旋在溶液中可以是游离或固定在基质上的。两个衍生自SNAP蛋白的螺旋(可能连接或可能未连接)加入到溶液中。这些螺旋与突触融合蛋白的螺旋结合以形成突触融合蛋白-SNAP三螺旋复合体。在此之后，突触融合蛋白-小突触泡蛋白融合蛋白被添加到该溶液中。来自此融合蛋白的小突触泡蛋白螺旋结合到三螺旋复合体上以形成稳定的SNARE复合体，同时突触融合蛋白螺旋将保持未结合并将从SNARE复合体中伸出。通过重复上述相同的步骤，这一突触融合蛋白突起可以被进一步用来形成SNARE复合体，从而产生多聚体。由于上述系统需要螺旋以特定顺序添加，确保在特定步骤后没有多余的分子是需要的。这可以通过例如固定单独的突触融合蛋白螺旋和在每次结合步骤后进行洗涤来实现。本发明还提供了通过上述系统产生的多聚体。此外，本发明提供了含有连接在一起的多个稳定的SNARE复合体的多聚体，其中，每个SNARE复合体包括 两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，来自SNARE复合体的螺旋与来自另一个SNARE复合体的螺旋连接，以将SNARE复合体连接在一起，并且其中，一个或多个货物部分附着在所述多肽螺旋上。本发明的所述多聚体可以是线性的。如果它是线性的，每个SNARE复合体的两端将被附着另外两个SNARE复合体，以形成类似一串珠子的长的线性链。因此，SNARE复合体中的两个螺旋将与两个不同的SNARE复合体的螺旋附着。显然，在链的末端的SNARE复合体只通过一个多肽螺旋与另外的一个SNARE复合体附着。或者，所述多聚体可以是分支的。这可以通过例如以任何顺序将小突触泡蛋白衍生的螺旋与两个突触融合蛋白衍生的螺旋连接。这个三连接构建体中的小突触泡蛋白衍生的螺旋将附着到突触融合蛋白/SNAP衍生的三螺旋中间体上，以形成具有两个未被结合的突触融合蛋白衍生的螺旋的SNARE复合体。当加入SNAP衍生的螺旋时(例如SNAP-25)，两个连接的突触融合蛋白/SNAP-25中间体将形成。加入“正常”的小突触泡蛋白-突触融合蛋白(双螺旋)衍生的构建体，两个连接的SNARE复合体将形成，具有两个突出的突触融合蛋白衍生的螺旋。这将产生两个分支用于进一步的生长。因此，连接3个螺旋允许分支存在(与用于线性聚合的两个连接螺旋不同)。因此，如果多聚体是分支的，多聚体内的SNARE复合体将附着到三个其他的SNARE复合体上，以形成分支点，而不是如线性链的附着到两个其他的SNARE复合体上。在分支点上的SNARE复合体的三个螺旋将附着在三个不同的SNARE复合体的螺旋上该多聚体可具有附着到螺旋任何一个末端上的货物部分。该多聚体可具有多个附着到多聚体的螺旋的末端上的货物部分。在一种实施方式中，该多聚体可在每个SNARE复合体上具有货物部分。该多聚体可具有与每个SNARE复合体附着的多个货物部分。如果该多聚体具有多个货物部分，它们可以相同或不同。通过在每次洗涤步骤后提供携带不同货物的SNARE结构域，可以控制多个货物的加入和有序排列。本发明还提供了生产多聚体的方法，该方法包括以下步骤I)提供衍生自第一 SNARE螺旋的第一多肽螺旋；2)将第二多肽螺旋和第三多肽螺旋与第一多肽螺旋结合，以形成三螺旋中间体复合体，其中，第二多肽螺旋和第三多肽螺旋衍生自第二 SNARE螺旋和第三SNARE螺旋；3)将第四多肽螺旋与三螺旋束结合，以形成稳定的SNARE复合体，其中，所述第四多肽螺旋衍生自第四SNARE螺旋，并且其中，所述第四多肽螺旋与衍生自第一 SNARE螺旋的第五多肽螺旋连接；并且4)重复步骤2)和3)，以形成多聚体，其中，一个或多个货物部分与所述多肽螺旋附着。上述有关复合系统，多聚体和各种限制的描述也适用于上述方法。步骤2)和3)可根据需要多次重复，以生产所需长度的多聚体。上面的方法涉及第一，第二，第三和第四SNARE螺旋。如上所述，SNARE复合体由四个螺旋形成。其中的两个螺旋是由SNAP蛋白提供的，一个是由突触融合蛋白提供的，一个是由小突触泡蛋白或其同系物提供的。因此，在上述方法中，没有特定的顺序，这四个螺旋是第一，第二，第三和第四SNARE螺旋。这是因为只要这四个螺旋用于SNARE复合体，具体螺旋的同一性并不重要。可选地，如上所述，所述SNARE复合体也可以结合复蛋白。在一种实施方式中，所述第一螺旋是突触融合蛋白衍生的螺旋；所述第二螺旋是SNAP衍生的螺旋；所述第三螺旋是SNAP衍生的螺旋；所述第四螺旋是小突触泡蛋白衍生的螺旋；以及所述第五螺旋是突触融合蛋白衍生的螺旋。鉴于在SNARE复合体中四个螺旋可以以任何顺序使用的事实，所述第五多肽螺旋不需要与所述第一多肽螺旋衍生于相同的SNARE螺旋。同样，当第二，第三，第四，第五，第六等形成时，重复作为此方法的步骤的多聚体中的SNARE复合体，第二，第三和第四多肽螺旋不需要与第一 SNARE复合体中的第二，第三，第四多肽螺旋衍生自相同的SNARE螺旋。唯一的要求是，所有四个的SNARE螺旋代表每个SNARE复合体，以形成稳定的SNARE复合体的形式。由于上述方法涉及多步骤的过程，与只要它们形成稳定的SNARE复合体的第一个步骤相比，允许在随后的重复步骤中引入不同的多肽螺旋的可能性。例如，在第一个循环步骤中，衍生自SNAP蛋白的一个多肽螺旋可能是全长的SNAP-25螺旋，而在第二个循环步骤中，这个多肽螺旋可能是45个氨基酸长度的SNAP-25螺旋。重要的方面是，两个多肽螺旋都衍生自相同的SNARE螺旋(例如，特定的SNAP螺旋)，使所有四个的SNARE螺旋代表SNARE复合体。 由于一个或多个货物部分附着所述多肽螺旋，所以得到的多聚体也具有附着其上的货物部分。这可以通过在应用到此方法之前将货物部分附着到所述多肽螺旋上来完成。优选地，所述货物部分附着到所述多肽螺旋的末端。可以将大量的货物部分引入到所述多聚体中。这可以通过将货物部分附着到大量的多肽螺旋上来完成，然后利用上述方法将所述多肽螺旋合并到多聚体中。所述货物部分可以相同或不同。 为了使该方法更简单，优选地，在重复步骤中，保持第一，第二，第三和第四SNARE螺旋的同一性。因此，举例来说，如果在产生第一 SNARE复合体的第一循环步骤中，第一SNARE螺旋是突触融合蛋白，第二和第三SNARE螺旋来自SNAP蛋白，且第四SNARE螺旋是小突触泡蛋白或其同系物，那么，在随后进一步产生SNARE复合体的循环步骤中，第一 SNARE螺旋总是突触融合蛋白，第二个和第三个SNARE螺旋总是来自SNAP蛋白，并且第四SNARE螺旋总是小突触泡蛋白或其同系物。此外，优选地，在重复步骤中，保持第二，第三，第四和第五多肽螺旋的同一性。因此，举例来说，如果在产生第一 SNARE复合体的第一循环步骤中，第二和第三SNARE螺旋来自SNAP蛋白，第四SNARE螺旋来自小突触泡蛋白SNARE螺旋，第五多肽螺旋来自突触融合蛋白，在随后进一步产生SNARE复合体的循环步骤中，第五多肽螺旋(在下一个SNARE复合体中形成第一螺旋)始终是突触融合蛋白，第二和第三SNARE螺旋总是来自SNAP-25，并且第四SNARE螺旋始终是小突触泡蛋白SNARE螺旋。在一种实施方式中，所述第二和第三多肽螺旋连接在一起，这样它们可以组装进同一 SNARE复合体。优选地，所述第二和第三多肽螺旋是全长的SNAP蛋白，如SNAP-25。如果在所有随后的步骤中，所述多肽螺旋的同一性相同，并且，所述第二和第三多肽螺旋连接在一起，那么，仅仅使用两种构建模块(building blocks)就能使得多聚体快速形成。在另一个实施方式中，所述第一多肽螺旋固定在基质上。合适的基质已为本领域技术人员熟知，并且已在上文进行过讨论。该方法还可以进一步包括在每次结合步骤后进行洗涤，以去除未结合的螺旋。这将确保这些未结合的螺旋在后续步骤中不干扰多聚体的形成。优选地，在洗涤步骤之前，通过该方法形成的多聚体被固定。该方法可被修饰，以将分支引入到多聚体中。为了做到这一点，衍生自第一 SNARE螺旋的第六多肽螺旋与第二，第三，第四或第五多肽螺旋中的一个连接，以提供另一个稳定的SNARE复合可形成于其上的螺旋。在一个实施方式中，所述第六多肽螺旋与第二或第三多肽螺旋连接。在另一种实施方式中，所述第六多肽螺旋与第四或第五多肽螺旋连接。这使得两个其他的SNARE复合体源于特定的SNARE复合体，从而在多聚体中引入分支。这可以通过例如，将小突触泡蛋白衍生的螺旋以任何顺序与两个突触融合蛋白衍生的螺旋连接来实现，如上所述。或者，突触融合蛋白螺旋可以与SNAP-25(作为第二和第三螺旋)连接，以起始第二 SNARE复合体从起始SNARE复合体处的形成，意味着，起始SNARE复合体将被整体附着到另外的三个SNARE复合体上，以形成分支点。此外，通过进一步引入与所述SNARE复合体的其他螺旋连接的螺旋(除第六螺旋以外，)可以在特定SNARE复合体上引入多个分支。例如，小突触泡蛋白衍生的螺旋可以以任何顺序与三个或更多个突触融合蛋白衍生的螺旋连接。或者，两个或两个以上的突触融合蛋白衍生的螺旋可以与SNAP-25(即第二和第三螺旋)连接，以起始第三，第四等的形成。来自起始SNARE复合体的SNARE复合体，是指起始SNARE复合体将整体附着到四个或更多其它的SNARE复合体，以形成多个分支点。
在一个特定的点和整个多聚体上都可以按需要引入分支。本发明还提供按上面的方法生产的多聚体。上面描述的多聚体在大量的应用中都非常有用，例如，诊断，和如下应用中溶液应用-重组亲和试剂的组装，包括组合组装，聚寡聚，同源寡聚和异质寡聚；-功能性货物的靶向输送，例如，药物递送(药物为小分子，核酸，蛋白)。例如，用于靶向组装和货物的内在化信号；-蛋白分子和分子复合体的标签和标记，所述分子复合体包括蛋白分子，细胞，组织，器官和含有蛋白分子的生物体；-用于多聚化合物的组装，例如功能性蛋白，酶，因子，辅因子(以及任何其他的功能蛋白)，FRET标签，多聚无机化合物和小分子、多聚有机化合物；-蛋白质结构的自组装，和含蛋白(如孢子)的更复杂组装，-蛋白在自组装结构的表面上的组装后固定。固体表面应用-阵列，表面固定；-免疫检测(如ELISA)的孔板表面修饰和蛋白的固定；-BIAcore和其他SPR(表面等离子体共振)仪器，表面修饰和蛋白的固定；-QCM的仪器表面修饰和蛋白的固定；-MALDI质谱的板表面修饰和蛋白的固定；-微流体仪器的表面修饰和蛋白的固定；-毛细管电泳的表面修饰和蛋白的固定；-层析柱和固定的介质(如珠子)的表面修饰和蛋白的固定；-扫描探针显微镜表面和针的修饰以及蛋白的固定；-微热量测定仪和纳热量测定仪传感器的表面修饰和蛋白的固定；-微粒子和纳米粒子的表面修饰；-固体表面(如镀金玻片)，薄膜，线(如纳米线)和纳米管的表面修饰。其他应用-纳米生物技术，例如将表面与基于可生物降解蛋白的自组装“胶合剂”“粘结”在一起;-基于蛋白的纤维和聚合物；-组织支架和组织工程。现在，仅以举例的方式对本发明进行详细描述，参考图片如下
图I是在神经递质释放时促使囊泡融合的分子机制的示意图。核心SNARE复合体是由4个由小突触泡蛋白，突触融合蛋白和SNAP-25提供的α-螺旋形成的。突触结合蛋白(synaptotagmin)作为I丐传感器，以及密切调控囊泡融合过程中SNARE的快速移动(zipping)。图2是多功能单元以不可逆和位点特异的方式连接成束或线性多聚体的示意图。箭头代表连接支架；几何图形代表功能单元。图3A展示的是由长度至少为80个氨基酸的四个多肽构成的四螺旋SNARE束(Sutton et al. ，1998)。图3B展示的是为40和45个氨基酸多肽设计的SNARE基序。阴影是疏水层，中央层用深灰色强调。图4是SDS-PAGE凝胶电泳图，展示的是45个氨基酸的多肽能够形成不可逆的SNARE复合体(A组)，而40个氨基酸的肽则不能(B组)。简单说来，发明人称这种组装体为TetriCS (四螺旋组合支架)。图5是图表，显示链霉亲和素可以以高特异性的方式结合45个氨基酸的Tetrics肽，该肽要么附着到谷胱甘肽珠，要么附着到镍珠。图6是含有全长的SNAP-25分子(1_206位氨基酸)的三组分SNARE束的示意图，其具有两个SNARE螺旋和单独的突触融合蛋白，以及小突触泡蛋白SNARE螺旋。图7是SDS-PAGE凝胶电泳图，展示的是40个氨基酸(A组)和45个氨基酸(B组)多肽都可以与SNAP25B组装，这表明在三组分系统中，40个氨基酸长度的多肽足够与全长的SNAP-25不可逆地结合。图8是图表，该图展示了珠子上只有GST-SNAP-25的对照反应表现出微不足道的结合，而40个氨基酸的分别携带Myc标签和S标签的突触融合蛋白和小突触泡蛋白多肽加入后，导致了三组分复合体的形成，正如被抗-Myc抗体和S-蛋白与谷胱甘肽珠的强大的结合所证明的那样。图9是传感图，展示的是40个氨基酸的突触融合蛋白和小突触泡蛋白多肽与固定的SNAP25B结合。抗myc抗体(Myc)与突触融合蛋白_myc表位结合,但可以被O. 1%的SDS洗脱。结合的突触融合蛋白/小突触泡蛋白多肽不能通过SDS分离。

图10是含有SNAP-25分子的双组分SNARE束的示意图，其具有两个SNARE螺旋和突触融合蛋白/小突触泡蛋白的融合蛋白。图11是示意图，其显示了大鼠突触融合蛋白IA SNARE基序(195-254位氨基酸)与大鼠小突触泡蛋白2SNARE基序(25-84位氨基酸)的连接，如灰色箭头所示。图12是SDS-PAGE凝胶电泳图，展示的是突触融合蛋白3_小突触泡蛋白2融合蛋白和大鼠SNAP-25B快速组装成不可逆的复合体。
图13是示意图，展示的是大鼠突触融合蛋白3的头部结构域和SNARE基序(1_260位氨基酸)借助氨基酸的短支链(stretch)与大鼠小突触泡蛋白2的1_84序列融合。图14A是SDS-PAGE凝胶电泳图，展示的是辛基吡喃葡萄糖苷能够“开启”突触融合蛋白3分子，以允许双组分组装体的形成。图14B是SDS-PAGE凝胶电泳图，展示的是辛基吡喃葡萄糖苷去垢剂的浓度在CMC(临界胶束浓度，该去垢剂的CMC为O. 6% )以上时，辛基吡喃葡萄糖苷去垢剂可促进紧密的SNARE复合体的组装。一些组装确实可在无去垢剂的情况下发生，但有效的组装需要去垢剂辛基吡喃葡萄糖苷“开启”突触融合蛋白3分子以允许双组分组装体的形成。图15是表面等离子体共振传感图，展示的是突触融合蛋白-小突触泡蛋白融合蛋白㈩的结合，以及突触融合蛋白/小突触泡蛋白融合蛋白与固定在CM5芯片上的SNAP-25之间的组装的独特的耐受性。使用2M氯化钠(I)，pH 2. 5的甘氨酸(2)，1% SDS (3)，O. IM氢氧化钠(4)，O. IM磷酸(5)洗涤，不能破坏二元捕获试剂。注意，步骤(3)重复两次。图16A是含有三螺旋分子(黑)和第四螺旋(灰)的双组分SNARE束的示意图。图16B是SDS-PAGE凝胶电泳图，显示的是40个氨基酸和45个氨基酸的突触融合蛋白IA肽可以与由SNAP-25B和小突触泡蛋白 2构成的三-螺旋融合蛋白(SNAP-25B (22-206)/Syb2 (1-84))组装体，表明在双组分系统中，长度为40个氨基酸的肽足够用于不可逆的SNARE复合体的形成。注意，在SDS凝胶中，SDS耐受复合体比三-螺旋蛋白的迁移速度快，可能是由于其紧凑的结构。图17是SDS-PAGE凝胶电泳图，显示的是GST_SNAP_25可以以高度特异性的方式与携带突触融合蛋白3/小突触泡蛋白2融合蛋白的琼脂糖珠结合。注意，突触融合蛋白3/小突触泡蛋白2融合蛋白共价连接到BrCN琼脂糖珠，因此不会被洗脱下来，这在SDS PAGE凝胶中是可观察到的。泳道I为使用zwitergent 3_08得到的细菌提取物。泳道2为用携带突触融合蛋白3/小突触泡蛋白2融合蛋白的珠子纯化的GST-SNAP-25。图18是超分子器件的示意图，该超分子器件的形式为由SNARE蛋白组成的无限长度的强线性多聚体。图19是使用SNARE蛋白形成长的线性多聚体的方法示意图。图20 (A)考马斯染色的凝胶显示出突触融合蛋白3-小突触泡蛋白2融合蛋白和与珠子结合的SNAP-25的数量均逐步增加。注意，当用于附着到珠子上的GST-突触融合蛋白3的数量保持不变时，则结合的SNAP-25和突触融合蛋白3-小突触泡蛋白2融合蛋白的数量逐步增加。为了显示结合材料的数量，将样品煮沸以破坏组装体的SDS耐受特性。(B)如A所述，但是，在SDS-PAGE前样品不煮沸。注意，SDS耐受性聚合物的分子量的增加与额外的聚合步骤成线性相关。图21是SNARE蛋白形成的分支多聚体的示意图。图22是由突触融合蛋白3残基(1-253)直接融合到小突触泡蛋白2残基(29_84)构造形成的融合构建体(无连接器)的示意图。图23是SDS-PAGE凝胶电泳图，展示的是SNARE束在溶液中通过简单的混合可以是多聚化的(multimerised)。图24展示的是，SNARE标签允许He-介导的量子点(quantum dots)传递到突触末梢。a图示意性显示的是LcHN部分与BoNT/A的He部分的SNARE连接。单个亚基如在结构模型中所示(改编自Lacy等，1998)。b图示意性显示的是SNARE标签图，用于连接链霉未和素包覆的量子点与肉毒杆菌毒素SV2C-结合部分(He)。生物素(星)-突触融合蛋白肽(蓝色)允许量子点具有SNARE标签，然而He融合到小突触泡蛋白SNARE基序上(紫色)。SNAP25(绿色和红色)，允许量子点与He连接。c图为考马斯染色的SDS凝胶图，呈现的是=Hc-小突触泡蛋白，SNAP25和生物素化的突触融合蛋白3多肽不可逆地组装为SDS耐受复合体。d图，Hc-SNARE-Q-dots呈现的是突触的结合，正如通过培养的海马神经元的轴突延伸的突触囊泡标记物突触小泡蛋白(synaptophysin)的免疫染色所证明的。在组装过程中SNAP25的缺失阻止Q-dots靶向突触终端。图25展示的是=SNARE标签允许独立的部分BoNT/A逐步组装成单分子实体。a图显示二硫键的位置，以及LcHN和BoNT/A的He部分的SNARE标签。b图，带有SNAP25标签的LcHN，可以纯化和用50mM的二硫苏糖醇(DTT)处理后分解成Lc和HN-SNAP25。考马斯染色的SDS凝胶。c图，带有SNAP25标签的LcHN，可以与小突触泡蛋白标记的He连接，加入突触融合蛋白3肽，如通过考马斯染色和荧光成像SDS凝胶所证明的。图26展示的是=SNARE-连接的肉毒杆菌毒素显示出突触的定位和分裂其内突触(intrasynaptic)祀标。a图，突光标记的LcHN-SNARE-Hc与海马神经元的轴突延伸结合。抗突触小泡蛋白抗体的免疫染色突显了培养的海马神经元的突触前末梢。b图，免疫印迹显示，内突触SNAP25以与天然的BoNT/A相似的方式被组装好的神经毒素分裂。图27呈现的是SNARE-连接的肉毒杆菌神经毒素抑制神经递质的释放。a图，对离体大鼠脑突触末梢(突触小体，synaptosomes)释放的谷氨酸盐(glutamate)的突光测量表明，LcHN SNARE-Hc和BoNT/A之间有类似的抑制程度。在毒素与突触小体孵育I小时后，获得谷氨酸盐实时释放图(上图)和剂量依赖图(下图，用35mM氯化钾和2mM氯化钙刺激15分钟后进行评估)。b图，在与突触小体孵育I小时后，单独的SNARE-标记的神经毒素部分不能阻断谷氨酸盐的释放，如15分钟的刺激后所评估的。c图，图表显示小鼠横隔膜(diaphragm)被 LcHN-SNARE-Hc 等长收缩(siometric contractions)的剂量依赖性抑制。误差线代表SEM，η = 3。图28呈现的是突触融合蛋白3(195-253)标记的LcHn，而He是由小突触泡蛋白(25-84)标记的。两个肉毒杆菌部分在SNAP-25存在时混合，毒素的形成在考马斯染色的SDS凝胶上是可视的。图29展示的是与来自A组(panel A)的LcHnSyx3_SNAP25-小突触泡蛋白He孵育I小时后评估的大鼠脑突触小体的谷氨酸盐释放的阻止量。图30展示的是，在海马神经元上应用来自A组的毒素LcHnSyx3-SNAP25-小突触泡蛋白HcA后，用抗-SNAP-25抗体借助免疫印迹法对催化部分Lc的内神经元(intraneuronal)靶标的分裂进行评估。重组毒素具有与天然的肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)相似的切割SNAP-25的活性。注意，在此神经元的检测中，LcHnSyx3-SNAP25-小突触泡蛋白HcA比LcHnSyx3-SNAP25-小突触泡蛋白HcD更有效率。图31 呈现的是，用生长抑素肽(somatotostatin peptide)AC-RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKL SELDDRADAL-AHX-AHX-AGCKNFFffKTFTSC-OH 对小突触泡蛋白的 40 个氨基酸基序的SNARE标记,允许生长抑素-量子点的生成。链霉未和素包覆的量子点与生物素化的突触融合蛋白肽孵育后，然后与生长抑素-小突触泡蛋白和SNAP-25混合。组装好的生长抑素-Q-dots-应用于培养的海马神经元,且它们进入神经胞体(neuronal soma)的过程借助于Q-dots的荧光和标记大量内神经元蛋白的抗SNAP-25抗体的复染是可视化的。图32展现的是用生长抑素肽对小突触泡蛋白的40个氨基酸基序的SNARE标记，在与LcHn突触融合蛋白3和SNAP-25混合后，允许功能性生长抑素-肉毒杆菌构建体的形成。在应用重组的毒素20小时后，LcHn突触融合蛋白3-SNAP25-小突触泡蛋白生长抑素(SS-LcHN)的活性可通过在培养的海马神经元中SNAP-25的分裂来评估。
图33是SDS凝胶电泳图，呈现的是用具有N-末端截短的SNARE基序形成稳定的SDS耐受复合体。图34是SDS凝胶电泳图，呈现的是用具有C-末端截短的SNARE基序形成稳定的SDS耐受复合体。图35是SDS凝 胶电泳图，呈现的是用突触融合蛋白SNARE肽形成稳定的SDS耐受复合体，其中，所述肽的内部的蛋氨酸已被非氧化的正亮氨酸取代。图36是多个SDS凝胶电泳图，呈现的是用各种不同的SNARE肽形成稳定的SDS耐受复合体。图37是SDS凝胶电泳图，呈现的是用三个缩短的SNARE肽形成稳定的SDS耐受复合体。图38是SDS凝胶电泳图，呈现的是用三个缩短的SNARE肽形成稳定的SDS耐受复合体。图39是SDS凝胶电泳图，呈现的是用三个缩短的SNARE肽形成稳定的SDS耐受复合体。图40是SDS凝胶电泳图，呈现的是当神经肽与一个SNARE肽复合时，稳定SDS耐受复合体的形成。图41是SDS凝胶电泳图，呈现的是当精氨酸/血管升压素肽(AVP)与突触融合蛋白肽的N-末端或C-末端复合时，稳定SDS耐受复合体的形成。图42是SDS凝胶电泳图，呈现的是用含少于40个氨基酸的SNARE肽形成稳定复合体。图43是SDS凝胶电泳图，呈现的是蛋白与SNARE肽的基于顺丁烯二酰亚胺的交联。图44是图表，呈现的是TMB(3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)基质在650nm处的吸光度。图45呈现的是发光膜的一部分。实施例介绍由SNARE衍生的多肽组成的束或线型的支架用于功能单元的可控的、不可逆的、非化学连接。发明人已经开发出一种通过简单混合连接功能或结构单元的方法。更好的定义是，纳米大小的功能超分子体系结构通过自组装提供在生命生物科学，药学，纳米技术中进行程序工程的方法。特别地，本发明涉及用于多功能单元以不可逆的和位点特异的方式进行可控连接得到如图2所示的束或线性多聚体的未满足的需求。这项新技术的核心在于用于连接蛋白结构域(实际上是任何可以想到的化学实体)的SNARE蛋白的独特性质的挖掘。在自然界中，这些蛋白借助于由突触融合蛋白，SNAP-25和小突触泡蛋白(也称为VAMP-囊泡相关膜蛋白)组成的三元复合体以促使囊泡与细胞质膜的融合。这个SNARE复合体是个4-螺旋卷曲螺旋(coiled-coil)束，包括两个衍生自SNAP-25的螺旋，一个衍生自突触融合蛋白的螺旋和一个衍生自小突触泡蛋白的螺旋(图3);每个螺旋的长度为约60-70个氨基酸(Jahn and Scheller (2006)) 0这个四螺旋束异常稳定，甚至在SDS中，直接显示了 SNARE组装的不可逆性(Hu，Ket al.，2002)。已有多种策略用于配体和其他功能基团的二聚，寡聚，多聚。其中，小肽(<5kDa)的化学交联(Pillai et al. , 2006 ;Tweedle, 2006),转谷氨酰胺酶催化的异二聚(Tanakaet al. ,2004)和生物素化的配体与四聚的链霉亲和素的结合(Leisner et al.，2008)代表了功能单元连接的几个例子。此外，卷曲螺旋作为寡聚反应的设计模板，在广泛的应用包括蛋白质工程，生物技术，生物材料，基础研究和医学中引起了相当大的兴趣(Engel andKammerer, 2000 ;0' Shea et al. , 1993 ；Scherr et al. ,2007)。可用的寡聚反应结构域的例子为含有33个残基的GCN4的亮氨酸拉链，其形成平行的卷曲螺旋二聚体和46个残基 的同源五聚体的卷曲螺旋COMPcc (Engel and Kammerer, 2000)。各种应用中，卷曲螺旋的选择取决于几个特点卷曲螺旋多肽的长度，它的溶解度，它们允许同源或异质寡聚的能力；以及卷曲螺旋的强度，即正常和不利条件下承受解离的能力。SNARE卷曲螺旋束独有的性质如异质-四聚和SNARE组装的不可逆特性还没有被考虑挖掘。使用SNARE束的核心理念，涉及到生产诊断/治疗/生物技术蛋白的方法，其必须携带不同货物部分的组合(荧光，放射性，免疫，化学，亲和等)。发明人提出，用工程多肽，基于突触融合蛋白、SNAP-25和小突触泡蛋白，用于生产明确定义的有组织的、能够由完全不同的独立的部分自组装的、异质四聚的超分子体系结构。发明人首先定义用于四组分束和三组分束的最小核；第二，发明人描述了用于不可逆结合的双组分捕获系统；以及，第三，发明人表明了 SNARE束生产线性多聚体的有用性。实施例I:四组分束发明人表明缩短的SNARE螺旋可用于功能单位组装为四组分束。使用缩短的SNARE螺旋对于化学实体通过合成路径附着到SNARE多肽来说是必不可少的。目前，对于约50个氨基酸来说，多肽合成是有效可靠且经济可行的。因此，如果SNARE螺旋是缩短的，并允许进一步使肽序列或其他化学实体附着，这将是有利的。据悉，单一的SNARE基序的缩短，可导致不可逆的SNARE组装的中断(Hao et al.，1997)。发明人还发现(I)所有的螺旋截短到45个氨基酸的多肽时仍然允许稳定的四螺旋复合体的存在，和(2)各种功能基团可以添加到这些多肽的任何一端。这使得在用于各种用途的束中，多价复合体的制造变得简单，包括亲和试剂和试剂盒，或多价疗法(配体阵列或受体多聚(multimerisation)的展示是所希望的)。4个不同的螺旋的自由末端可以通过合成或重组的方式，在理想的空间组合中，用于高达8个不同的实体的附着。为简单起见，发明人将不可逆的异质寡聚蛋白复合体称为四螺旋组合支架(TetriCS)。发明人合成了含有40或45个氨基酸的TetriCS肽。40 个氨基酸(aa)具有生物素的大鼠SNAP25A1螺旋I (28_67位氨基酸)STRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLDRVEEGMNHI GSGGG-生物素(SEQ ID NO. I)(黑体表示40个氨基酸的SNARE序列)；具有6-组氨酸标签的大鼠SNAP25A螺旋2(149-188位氨基酸)NLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSN
GSGGGHHHHHH(SEQ ID NO. 2)
(黑体表示40个氨基酸的SNARE序列)；具有6-组氨酸标签和半胱氨酸的大鼠突触融合蛋白IA (201-240位氨基酸):EIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHA
GSGGGHHHHHHC(SEQ ID NO. 3)
(黑体表示40个氨基酸的突触融合蛋白序列)；用于单克隆抗体识别的具有S-标签表位的大鼠小突触泡蛋白-2 (31-70位氨基酸)RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADAL
GSKETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO. 4)(黑体表示40个氨基酸的SNARE序列)。发明人平行测试了 45个氨基酸长度的TetriCS肽具有生物素的大鼠SNAP25A螺旋I (28-72位氨基酸)生物素
-STRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLDRVEEGMNHINQDMK
C (SEQ ID NO. 5)(黑体表示45个氨基酸的SNARE序列)； 具有半胱氨酸和6-组氨酸标签的大鼠SNAP25A螺旋2 (149-193位氨基酸)C N E M D E NLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRID GGHHHHHH(SEQ ID. NO. 6)(黑体表示45个氨基酸的SNARE序列)；具有N-末端抗体表位和半胱氨酸的大鼠突触融合蛋白1A(201_245位氨基酸)AC AEDA EIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVEC (SEQ ID NO. 7)(黑体表示45个氨基酸的SNARE序列)；具有用于抗体识别的N-末端抗体表位的大鼠小突触泡蛋白2 (31-75位氨基酸)MSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNR RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGAS (SEQ ID NO. 8)(黑体表示45个氨基酸的SNARE序列)。在20°C下孵育40或45个氨基酸的肽60分钟，且利用SDS-PAGE分析它们的组装。图4显示,45个氨基酸的Tetrics肽能够形成不可逆的SNARE复合体(A组)，而40个氨基酸的肽不能(B组)。组装体的功能通过pull-down实验进行了测试。发明人使用带有GST标签的小突触泡蛋白(45个氨基酸的SNARE序列，细菌中重组产生)，化学连接生物素的SNAP-25的螺旋I和6-组氨酸标签连接的SNAP-25的螺旋2作为功能单元。发明人测试了荧光链霉亲和素的结合(用于生物素的结合)之后的TetriCS组装体与谷胱甘肽珠(用于GST结合)或镍珠(用于结合6-组氨酸标签)的结合。图5示出了链霉亲和素可以以高度特异性的方式与45个氨基酸的要么附着在谷胱甘肽珠上要么附着在镍珠上的TetriCS结合。这些结果表明，45个氨基酸的TetriCS肽可用于附着各种功能基团而不影响其功能特性。由于四个Tetrics肽有8个自由末端，它可以附着8个不同的基团。因此，TetriCS允许功能超分子器件的发展，定义为结构性组织和功能性组合的系统，由合适设计的分子组分构建，执行给定的功能(Lehn,2007)。实施例2:三组分束当附着的基团少于8个时，具有简化的TetriCS组装体是有用的。事实上，可以利用已携带2个SNARE螺旋的全长SNAP-25分子(1-206位氨基酸)(见图6)。因此，发明人测试了如上所述的40和45个氨基酸的大鼠突触融合蛋白IA和小突触泡蛋白2肽是否能够与全长的大鼠SNAP-25B组装成不可逆的复合体。图7示出了 40个氨基酸(A组)和45个氨基酸的肽(B组)能够与SNAP25B组装，表明在三组分系统中，40个氨基酸长度的肽足够与全长SNAP-25不可逆的结合。发明人测试了 40个氨基酸的Tetrics组装体的功能,该Tetrics组装体含有(i)全长的大鼠SNAP25B (1-206位氨基酸)中84，85，90，92位的半胱氨酸被代替为丙氨酸，已知这对SNAP-25表达和纯化是有帮助的(Fasshauer et al.，1999)。(ii)合成的突触融合蛋白-myc肽(黑体表示40个氨基酸的突触融合蛋白序列)EIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHA-GSGEQKLISEEDLC(SEQ ID NO. 9)(iii)合成的小突触泡蛋白-S-标签肽(黑体表示40个氨基酸的小突触泡蛋白序列)RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADAL
-GSKETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO. 4)将GST融合的SNAP-25与谷胱甘肽珠结合后，通过组装好的三组分TetriCS与荧光抗-Myc抗体和荧光S-蛋白(图8)结合的能力对组装体的功能进行了测试。在珠子上仅有GST-SNAP-25的对照反应显示出微不足道的结合，而另外40个氨基酸的突触融合蛋白和小突触泡蛋白肽的加入导致了三组分TetriCS的形成，如同通过抗-Myc抗体和S-蛋白质与谷胱甘肽珠的强大的结合所证明的一样。发明人总结出40个氨基酸的合成肽允许不同的标签在单独的不可逆的复合体中组装。三组分系统代表了一套2个短的多肽和SNAP-25分子的自组装，允许简单的6通路多功能的蛋白标记。接下来发明人利用表面等离子体共振技术，测试了 40个氨基酸的三组分TetriCS能够承受不利条件的能力。发明人将带有GST标签的SNAP-25B化学性地附着到BiacoreCM5芯片上，随后结合40个氨基酸的突触融合蛋白和小突触泡蛋白肽，然后结合抗体。图9示出了肽的结合是稳定的并允许抗myc抗体附着到芯片的表面。O. 1%的SDS的加入将抗体从固定的SNAP-25上去除了，但不能去除肽。实施例3 :双组分束 发明人还将不可逆的SNARE组装体简化为双组分系统。基于双组分亲和力的工具是所有基础研究的基础，并且在药物和诊断试剂的发展中是无价的(Uhlen，2008)。应用范围包括亲和层析，微阵列技术，基于微孔板的扫描和许多生物技术方法。成功产生这些应用的主要因素依赖于，蛋白的坚固的、不可逆的，或者在固体表面或者在三维矩阵的确定方位上的固定。最近的一些评论强调了现有的固定技术的一些缺点(Kohn, 2009 ;Tomizaki etal.，2005)。例如，在化学蛋白偶合的情况下，可以实现不可逆的表面固定，但产品可能是由于定位问题和化学修饰处 于非功能状态。相反，可以使用各种标签(GST，His-标签，抗-myc和其他抗体识别的表位)将蛋白以位点选择的方式附着到相应的表面(谷胱甘肽包覆的，金属包覆的，抗体包覆的)，但在所有这些情况中，固定都不是永久的(所有存在的肽亲和标签将分离)和/或非常昂贵的(基于抗体亲和表面)。显然，理想的固定技术应该允许靶标蛋白不可逆的偶合和位点特异性的定位，并且，此外，应比目前的基于抗体的方法便宜很多。个别地，如果它们与不可逆结合的多肽一起表达，则在功能方向的两个蛋白的不可逆连接将是可能的。对于双组分系统，发明人使用了从头设计的突触融合蛋白/小突触泡蛋白融合蛋白，连同双螺旋SNAP-25 (见图10)。在第一实施方式中，发明人将大鼠突触融合蛋白IA SNARE基序(195-254位氨基酸)与大鼠小突触泡蛋白2的SNARE基序(25-84位氨基酸)连接在一起，如图11所示。突触融合蛋白和小突触泡蛋白序列之间短的氨基酸支链(GILDSMGRLELKL(SEQ ID NO. 10)，小箭头)源于杂合质粒中的多聚克隆位点。发明人纯化了融合蛋白，但发现它具有借助于突触融合蛋白I的基序聚集的倾向，阻止带有SNAP-25的SNARE复合体的形成。下一步，发明人制得了大鼠的突触融合蛋白3和小突触泡蛋白2融合蛋白。在此想法中，发明人通过短的氨基酸支链将大鼠突触融合蛋白3的SNARE基序(195-253位氨基酸)与小突触泡蛋白2的序列1_84融合。突触融合蛋白和小突触泡蛋白序列之间短的氨基酸支链(GILDSMGRLELKL)源于杂合质粒中的多克隆位点，其允许突触融合蛋白3和小突触泡蛋白2之间插入功能单位。当与大鼠的SNAP-25B混合后，突触融合蛋白3和小突触泡蛋白2融合蛋白迅速组装成不可逆的如图12所示的复合体。在下一个设想中，发明人借助于短的氨基酸支链将突触融合蛋白3(1-260位氨基酸)的SNARE基序和头部结构域与大鼠小突触泡蛋白2的序列1-84融合(见图13)。突触融合蛋白和小突触泡蛋白序列之间短的氨基酸短支链(GILDSMGRLELKL (如SEQ ID NO. 10))源于杂合质粒中的多个克隆位点，其允许在突触融合蛋白3和小突触泡蛋白2之间插入功能单位。据悉，突触融合蛋白3的头部结构域保护其SNARE基序不进行SNARE组装，但某些脂质能够“开启”用于SNARE的组装的突触融合蛋白(Darios and Davletov, 2006 ；Rickmanand Davletov, 2005) 0发明人未发表的工作表明，称为辛基吡喃葡萄糖苷的温和去垢剂也可以“开启”突触融合蛋白3分子。因此，发明人可以控制突触融合蛋白的SNARE基序，并以规范的方式形成SNARE复合体。图14A呈现的是在SDS凝胶中测试的这些可控的双组分组装体的一个例子。发明人还发现，其他去垢剂或者类似的脂质化合物具有相同的效果，如MEGA 8，C-HEGA 10，C-HEGA 11，HEGA 9，庚基吡喃葡萄糖苷，辛基吡喃葡萄糖苷，壬基吡喃葡萄糖苷，zwittergent 3-08, zwittergent 3-10 和 zwittergent 3-12。表面等离子体共振实验证明了这双组分组装体对各种干扰剂具有高度的耐受力(图 15)。作为一种替代的双组分系统，发明人生产了具有一个小标签的二元亲和试剂，其中，短的突触融合蛋白螺旋(< 5kDa)可以不可逆地结合到图16A中示意性代表的从头设计的三螺旋SNARE融合蛋白(约27-3IkDa)。在此设想中，发明人将两个SNAP-25SNARE螺旋(22-206位氨基酸)与小突触泡蛋白2的序列1-84的SNARE基序融合。SNAP-25和小突触泡蛋白序列之间的连接器GSGSEQKLISEEDLG(SEQ ID NO. 11)带有myc标签表位。当与突触融合蛋白40或45个氨基酸的肽混合时，如前面所述，所述三螺旋融合蛋白迅速组装成如图16B所示的不可逆转的复合体。这些双组分系统是目前亲和标签的有用替代物(Terpe. 2003)。在二元捕获系统中的标签可以在细菌中表达，并很容易地以位点特异性的方式添加到任何用于重组生产的蛋白中，这是与生物素/链霉亲和素不同的，或与亲和系统高度类似的(生物素不能作为蛋白的一部分表达)。由于二元亲和试剂的不可逆特性，从高度稀释的溶液中快速捕获目前是可能的，目前没有其他的系统存在。必要时，二元系统中的任何标签可以通过化学方法连接到珠子，芯片，微阵列板的表面，并通过化学或重组引入的官能团进行修饰。 以使用双组分系统用于细菌提取物中蛋白的纯化为例，发明人首先将含大鼠突触融合蛋白3 (195-253位氨基酸)的SNARE基序的双螺旋融合蛋白固定到BrCN琼脂糖珠上，所述大鼠突触融合蛋白3借助于短的氨基酸支链与大鼠的小突触泡蛋白2的序列的1-84融合(如上所述)。发明人还将称为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的酶与SNAP-25B融合，并在大肠杆菌中表达后来的融合蛋白。随后，使用2%的称为zwittergent 3_08的去垢剂破坏细菌膜，细菌的提取物被置于含有突触融合蛋白3/小突触泡蛋白2融合蛋白的琼脂糖珠上。洗涤后，通过SDS-PAGE和考马斯染色分析珠子。图17示出了 GST-SNAP-25可以以高度特异的方式与携带突触融合蛋白3/小突触泡蛋白2融合蛋白的琼脂糖珠结合。实施例4 :可控的线性聚合反应除了以捆绑的方式附着多个基团以外，SNARE蛋白也提供了生产先进的超分子器件的可能性，该超分子器件为无限长的强线性多聚体的形式，如图18所示。在这个方向，发明人的组装代表了一种独特的方法，其中，生物材料是由分子组装成的分子，以生产新型线性超分子体系结构(概述可能的应用(Hinman et al. ,2000;Lehn, 2007 ；Ryadnov and ffoolfson, 2003 ；Zhang,2003)) 在这种情况下，发明人将如上所述的突触融合蛋白3-小突触泡蛋白2融合蛋白用于双组分系统(大鼠突触融合蛋白3 (1-260位氨基酸)通过短的氨基酸支链与大鼠小突触泡蛋白2的序列1-84融合)。然而，发明人使用带有单独的具有头部结构域的突触融合蛋白3多肽(与GST融合的1-260位氨基酸)的固体支撑，而非在溶液中混合SNAP-25和突触融合蛋白3-小突触泡蛋白2融合蛋白，以启动聚合反应。发明人首先通过GST标签将GST-突触融合蛋白3分子单独固定在谷胱甘肽珠上。然后，发明人添加SNAP25B分子(1-206位氨基酸)，以在O. 8%的辛基吡喃葡萄糖苷存在下，允许形成突触融合蛋白3/SNAP-25 二元复合体。洗涤珠子以除去未结合的SNAP-25后，发明人添加突触融合蛋白3-小突触泡蛋白2融合蛋白。根据需要多次反复添加2个构建模块的步骤。图19描述了这个过程。图20A呈现的是在上述过程中逐步增加突触融合蛋白3-小突触泡蛋白2融合蛋白和SNAP-25的量。虽然用于附着到珠子上的GST-突触融合蛋白3的量仍然保持不变，但是结合的SNAP-25和突触融合蛋白3-小突触泡蛋白2融合蛋白的量在逐步增加。为了显示结合材料的量，将样品煮沸以破坏组装的SDS耐受特性。图20B呈现的是SDS耐受聚合物的分子量的增加与额外的聚合步骤成线性关系，正如在SDS-PAGE前没有煮过的样品一样。由于上述过程中的每一步都是可控的，可以在聚合反应中的任何一步添加不同的SNAP-25或在所需位置上带有任何所需货物部分的突触融合蛋白3-小突触泡蛋白融合蛋白。SNAP-25和突触融合蛋白3-小突触泡蛋白代表用于不同分子结构的可控构造物的构建模块。应用范围包括制造功能化纤维，多配体微阵列，超分子酶组件，新的电子器件，和用于生物技术和医药的生物材料(Zhang，2003)。也可以在特定位点，在线性支架中形成支链，如图21所示，使用突触融合蛋白-小突触泡蛋白-突触融合蛋白或SNAP-25-突触融合蛋白的融合蛋白，如上所述。最后，发明人扩展了不在表面上而是通过在溶液中简单混合两个组分来制造线性聚合物的可能性。发明人利用突触融合蛋白3-小突触泡蛋白2融合蛋白的修改后的版本，其中，两个SNARE蛋白之间的连接区域被删 除了。这种融合构建体具有直接融合到小突触泡蛋白2残基(29-84)的突触融合蛋白3残基(1-253)。见图22。发明人将大鼠SNAP-25B(1_206位氨基酸)与融合蛋白混合，通过SDS-凝胶电泳对60分钟的反应进行了分析。图23呈现的是SNARE束可以在溶液中通过简单混合而多聚化。因此，上面所述的双组分系统还允许在溶液中聚合，提出了一种以线性方式连接1-4个蛋白功能域的方法。此外，基于蛋白的全部的SDS耐受的线性聚合物的制造，可用于生产生物降解纤维，其性质优于蜘蛛丝的多组分组装体或目前的卷曲螺旋纳米纤维。有关概述，请参阅 Hinman 等，2000 ;Ryadnov 和 Woolfson, 2003。在实施例1-4中使用的多肽的序列(具有相应图片的指示):3713(1-260)/^^2(1_84)(图13，14及20)(具有头部结构域和连接器的突触融合蛋白)-SEQ ID NO. 12Syx3 (195-253) /Syb2 (1-84)(图12及17)(没有头部结构域，但有连接器的突触融合蛋白)-SEQ ID NO. 13Syx3 (1-253)/Syb2 (29-84)(图22)(有头部结构域，但没有连接器的突触融合蛋白)-SEQ ID NO. 14SNAP-25B(20-206)/Syb2 (1-84)(图 16B)-SEQ ID NO. 15实施例5 :允许肉毒杆菌神经毒素分步进行装配的SNARE标签概要通过合适的结构单元可控连接的纳米尺寸的明确的功能超分子体系结构的产生能够为医药和应用技术提供新的前景。当前的连接策略往往依靠化学方法，该方法有局限性，并且不能充分利用重组技术。本文中，发明人使用三种SNARE蛋白，形成了稳定的四螺旋复合体，以促进细胞内膜的融合，与用于不可逆连接重组体和合成功能单元的通用标签类似。发明人指出，SNARE标签允许功能超分子药用毒素的分步生产，即肉毒杆菌神经毒素A，俗称为Β0Τ0Χ。受体结合域与小突触泡蛋白SNARE基序的融合允许SNAP25标记的肉毒杆菌神经毒素的活性部分递送至神经元。数据显示，SNARE标记的毒素能够分裂其内部神经元的分子靶点并抑制神经递质的释放。这些结果表明，SNARE四螺旋卷曲螺旋允许各种结构单元可控连接为功能纳米机器。介绍分子生物学和革命性科学的重组蛋白生产的到来。重组多肽，蛋白的功能片段和全酶目前广泛应用在医药，诊断，纳米技术和消费生物产业中。虽然重组技术明显成功，但蛋白的大小仍然是生产作为单一功能单元的越来越复杂的蛋白的障碍。据认为，在超分子单元中而不是在独立的蛋白中结合多个功能基团，将使我们克服这个瓶颈。显然，实现这样一个构建纳米工厂或纳米机器的目标，在很大程度上取决于我们按照要求和高精度地将各功能单元连接的能力。出人意料的是，目前在这个充满希望的领域里的努力仍然依赖于几十年前发明的连接技术生物素-链霉亲和素配对，抗体-表位识别，通过氨基和巯基的化学连接。这些方法往往由于重组蛋白化学修饰的需求或基于抗体技术的复杂性而受到限制。最近发展的“点击”化学解决了部分这些问题，但仍依赖于无机化合物，并且迄今没有实现成熟的超分子组装体与重组蛋白的连接。基于DNA自组装或寡聚多肽的替代方法在设计多功能重组组装体时也有其局限性。本文中，发明人扩展了在近二十年前发现的，使用SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着到蛋白受体)蛋白组装体的可能性，以实现重组多肽与功能单元的不可逆连接。
SNARE蛋白通过形成异质四螺旋卷曲螺旋来促使每个真核细胞内的细胞膜的融合。脑衍生的SNARE复合体由三种蛋白组成小突触泡蛋白，突触融合蛋白和SNAP25。而突触融合蛋白和小突触泡蛋白均可以贡献一个单一螺旋，SNAP25贡献了两个螺旋，以形成四聚体卷曲螺旋。四个SANRE基序携带8个特征性七残基重复序列(heptade repeat),具有55个氨基酸的长度。脑SNARE复合体表现出其对离液剂，强去垢剂，蛋白酶和高温抗性的特殊稳定性。发明人决定研究SNAREs与重组蛋白的融合是否将允许超分子实体的可控构建。作为多功能分子的例子，发明人关注被形容为“集识别，输送，展开，易位，复性和催化于一体的纳米机器”的肉毒杆菌神经毒素。由于其微量(浓度为IpM)原位注射就能够导致很长的神经肌肉麻痹,A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A) (Montecucco，C. et al. (2009))的医学重要性已被证明了。BoNT/A是由三个主要单元构成的150kDa的蛋白50kDa的催化部分(轻链，Lc)，其中通过二硫键与被称为重链的连接，所述重链相应地由N-末端50kDa的易位部分(HN)和C-末端50kDa的部分(He)组成，后者负责对神经元神经节苷脂和突触囊泡受体 SV2C 的识别(Mahrhold,S. et al. (2006)&Dong,M. et al. (2006))。在 X 射线模型中，这三个主要单元可以被识别为独立的结构单元(改编自Lacy et al. (1998)，图24a)。当突触细胞溶质蛋白水解其内神经元靶标SNAP25时，所述催化部分，以高度特异性，导致神经递质的长期受阻(Schiavo,G. et al. (1993)&Blasi, J. et al. (1993))。BoNT/A 介导的9个氨基酸从SNAP25C-末端的移除，并未损害SNARE组装体与突触融合蛋白和小突触泡蛋白的稳定性(Hayashi, T. et al. (1994))。结果发明人首先将SV2结合部分(He)与小突触泡蛋白融合(图24b)并测试这种融合是否可以输送量子点(Q-dots)到神经元末端。He-小突触泡蛋白融合蛋白能够与SNAP25和生物素(用于结合链霉亲和素包覆的Q-dots)标记的52个氨基酸的突触融合蛋白3肽形成SNARE复合体。我们选择使用突触融合蛋白3基序而不是突触融合蛋白I,因为后者有同源寡聚(homooligomerise)的倾向。图24c呈现的是在SNAP25存在时，He-小突触泡蛋白融合蛋白甚至能够与修饰的突触融合蛋白3基序形成不可逆的(SDS耐受)SNARE复合体。在SNAP25存在时，将具有预结合的生物素化的突触融合蛋白肽的Q-dots与He-小突触泡蛋白孵育，并输送Q-dots到突触融合蛋白末端，这是在来自小鼠海马神经元的培养物中进行评估的。携带Hc-SNARE的Q-dots聚集在突触联系(synaptic contact)上，正如用囊泡蛋白小突触泡蛋白染色所证实的一样(图24d)。这表明，BoNT/A的靶标部分仍然能够识别其突触受体，并能够在与SNARE标签重组融合后输送大的货物部分。 下一步，发明人准备了酶部分、移位部分和SNAP25的融合(图25a)。我们在酶部分(Lc)和移位部分(HN)之间引入了凝血酶切割位点以方便切割，在分离的过程中，这两个部分仍然通过二硫键保持在一起。LcHN-SNAP25融合蛋白成功地在大肠杆菌中表达，可以被纯化以达到同质性。当用二硫苏糖醇处理时，这种融合蛋白分成两个部分，呈现出二硫键的关键功能(图25b)。然后我们检测了 SNARE标签是否允许LcHN和He部分组装成单一的实体。图25c显示了两个重组融合蛋白的结合，存在而非缺乏突触融合蛋白肽，导致在60分钟内，新的分子实体LcHN-SNARE-HC的出现，如被SDS凝胶证明的那样。为了帮助重组的BoNT/A靶标的可视化，我们采用了荧光标记的突触融合蛋白肽，并且LcHN-SNARE-Hc的确可以作为荧光蛋白被观察到(图25c)。当LcHN-SNARE-Hc用于培养的海马神经元时，荧光分子与囊泡标记物小突触泡蛋白局域化的重要程度，表明其与BoNT/A的天然靶标相结合(图26a)。重要的是，抗SNAP25抗体处理的神经元的免疫印迹证明，SNAP25经历与用天然的BoNT/A分子处理神经元同样的分裂(图26b)。这表明，酶部分被成功地释放到神经细胞质中，接着LcHN-SNARE-Hc进入到突触囊泡。为了测试LcHN-SNARE-Hc释放神经递质的效果，我们使用了 96孔谷氨酸盐释放法，可以同时比较多种因素(Darios, F et al. (2009))。图27a显示，LcHN-SNARE-Hc可以抑制钙离子依赖和KCl依赖的谷氨酸盐从分离的脑神经末端的的释放，与天然BoNT/A具有相同的剂量依赖。从中央突触末端释放的谷氨酸盐的抑制程度与之前得到的数值有很好的一致性(McMahon，H. T. et al. (1992))，并表明不是所有的中央突触均携带BoNT/A的SV2C受体(Dong，M. et al. (2006))。重要的是，不存在导致失活分子的连接突触融合蛋白肽的情况下，将SNARE标记的LcHN和He混合，确认了在连接重组部分与功能实体中，完整的SNARE组装是关键因素(图27b)。用二硫苏糖醇处理LcHN-SNARE-Hc使组装的毒素灭活，表明了 Lc和HN之间的二硫键的功能(图27b)。最后，我们测试了 LcHN-SNARE-Hc麻痹肌肉的能力。我们采用不同浓度的组装的毒素处理离体的小鼠膈肌，并测试膈神经的麻痹反应。确定振幅减少到初始值的50%所需的时间(半麻痹时间)。图27c呈现的是亚纳摩尔(subnanomolar)浓度(190pM)下,72分钟内，LcHN-SNARE-Hc麻痹膈肌的情况。不存在连接的突触融合蛋白肽时，没有观察到麻痹(数据未显示)。在这里，发明人证实SNARE标签允许药用毒素BoNT/A分步进行组装，BoNT/A俗称Β0Τ0Χ(Davletov，B et al. (2005))。虽然LcHN-SNARE-Hc阻断神经肌肉接头的效率小于天然的BoNT/A(MahrhoId，S et al. (2006))，这可以通过在长的神经肌肉接头内延伸毒素到不同活跃区的能力的降低来解释，或者通过由于在隔膜肌肉的大体积的突触前末梢导致效率的损害来解释。然而，在神经元间的突触联系的情况中，我们在LcHN-SNARE-Hc和天然的神经毒素之间观察到类似的效率。这些优选的对神经元间的突触联系而非神经肌肉接头的效果对于避免肌肉麻痹副作用的疼痛抑制治疗的发展是有利的。我们观察到很多可能的结果，在此列出一些。首先，目前，在细菌中以安全的方式表达活性的多组件的药用菌毒素是可能的。事实上，我们使用“锁定”肽允许额外的安全特征。也有可能利用SNARE标签的He部分来递送成像试剂以及通过用SNARE类似物标记的未来疗法(Binz，T et al. (2009))。另外，生产抗肉毒杆菌血清时，寡聚He部分可能用于激发更强的免疫应答(Webb，R. P. etal. (2007))。LcHN部分的SNARE标签也将允许将BoNT/A的活性部分容易地再靶向到特定的神经内分泌细胞中(Dolly，J. O. et al. (2009))。在这里，人们可以通过制造相应的SNARE标签的配体来靶向神经肽或生长因子受体。这种SNARE标签可以让以寻找最有利的组合为目的的各种功能单元更方便的组合混合，以特定的沉默的神经元亚群(Foster，K. A. (2009))。虽然发明人使用BoNT/A作为复杂的“纳米机器”的例子，但是明确的是，SNARE标签能够以高度可控的方式用于构建，许多其他的超分子组装体。通过可控的合适的构建模块连接的明确的纳米尺寸的功能超分子体系结构的产生，被认为为许多领域提供了新的视角(Lehn，J.M. (2007))。相对较短的SNARE基序允许重组生产的多肽和无机分子的结合，正如在肉毒杆菌神经毒素组装下生物素和荧光素的掺入所证明的一样。SNARE卷曲螺旋的最大优势是其异质四聚的性质(heterotetrameric nature),允许多达8个不同功能体的连接。这种潜力已经在未来医药和应用技术中得到扩展。方法质粒和蛋白的反应。所有的蛋白在BL21大肠杆菌菌株中表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。用于表达LcHN-SNAP25的质粒的产生过程如下BoNT/ALc (1-449位氨基酸)的cDNA通过PCR扩增，并且插入到pGEX-KG载体(Guan，K.L.et al. (1991))的SmaI和EcoRI限制性酶切位点之间。BoNT/A易位结构域HN的密码子优化的cDNA (450-872位氨基酸，来自ATG Biosynthetics,德国)插入到轻链的3'末端。凝血酶裂解位点(氨基酸LVPRGS(SEQ ID NO. 16))插入到BoNT/A的轻链和易位结构域之间。最后，大鼠SNAP25B的cDNA(1-206位氨基酸)插入在HN的3'末端。允许Hc-Syb表达的质粒生成如下大鼠的小突触泡蛋白(25-84位氨基酸)的cDNA经PCR扩增，并插入到pGEX_KG载体的BamHI和EcoRI位点之间。BoNT/A重链的cDNA (876-1296位氨基酸)经PCR扩增，并插入到小突触泡蛋白的3'末端。合成突触融合蛋白3SNARE基序的肽(200-250位氨基酸)，化学连接有生物素或荧光素(多肽合成，英国)。与GST融合的蛋白在谷胱甘肽琼脂糖珠(GE Healhcare，美国)上纯化，并用20mMHEPES，pH 7. 3，IOOmM氯化钠使用凝血酶从珠上洗脱。将带有SNARE标签的蛋白与突触融合蛋白肽，在22°C混合I小时，组装得到超分子复合体。神经元成像和免疫印迹。鼠抗突触素抗体(克隆7. 2)来自Synaptic System公司，鼠抗SNAP25抗体(克隆SMI81)来自Sternberger Monoclonals公司。链霉亲和素连接的Q-dots 525来自Invitrogen公司。海马神经元的原代培养物的准备如(Darios,F.etal. (2009))中所描述和在体外7-10天后使用。神经元与带有SNARE标签的，或天然的毒素接触2小时，用4%的PFA固定，然后用抗突触素抗体免疫染色。在连接有尼康Eclipse荧光显微镜的 Radiance 共聚焦系统(Zeiss/Bio-Rad ；HemeI Hempstead, Herts, U. K.)上观察荧光。或者，将神经元与组装好的毒素或天然BoNT/A孵育20个小时，用60mM Tris, pH 6. 8，2mM 氯化镁，2% SDS, benzonase 核酸酶(Novagen，250U/ml)裂解，然后借助抗 SNAP25抗体进行免疫印迹来分析SNAP25断裂。阻断神经递质的释放。如(Darios，F. et al. (2009))所述，分离新鲜的大鼠脑突触体。突触体(O. 5毫克/毫升的蛋白)在含有指示浓度的LcHN-SNARE-Hc缓冲液A (单位为 mM, 132NaCl，5KCl，20HEPES，I. 2NaH2P04,1. 3MgCl2，0. 15Na2EGTA, IMgSO4, 5NaHC03, IOD-葡萄糖)中，在37°C孵育I小时，加入等体积的含有谷氨酸脱氢酶(15units/ml，Sigma)和3mMNADP (Sigma)的缓冲液A，10分钟。在2mM CaCl2存在下，加入KCl (35mM)诱导谷氨酸盐的释放，随后通过突光进行监测(Exc. 340nm,Em. 460nm) (Darios,F. et al. (2009)McMahonH. T. et al. (1992))。如之前所述(Mahrhold，S. et al. (2006))进行膈神经偏侧膈测试(Phrenic Nerve hemidiaphragm assay)。小鼠膈神经来自海军医学研究所(NMRI)小鼠。在5-25mA，IHz的频率，O. Ims的脉冲宽度下，持续刺激所述膈神经。等长收缩被力传感器转化，并用VitroDat在线软件(FMI GmbH)记录下来。确定振幅减少到50%初始值所需的时间(半麻痹时间)。
其他信息肉毒杆菌神经毒素是最有效的天然设计的毒素。这些毒素是由梭菌属(Clostridium)细菌产生的，能引起长期瘫痪和死亡。在过去的30年，肉毒杆菌家族的一些成员，如A型肉毒杆菌毒素(BoNT/A)也称为Β0Τ0Χ，已成功地被开发出药用和美容作用。这些毒素沉默神经肌肉接头，也可以阻止多种类型神经元中神经递质的释放。人体的几乎每个部分，除脑以外，都可以通过Β0Τ0Χ进行治疗。由于神经肌肉接头的麻痹是可逆的，持续的肌肉松弛需要每三到四个月的重复注射。BoNT/A不仅可以阻止横纹肌，而且可以阻止平滑肌的神经支配。此外，控制出汗，流涎和其他类型分泌的自主神经系统的胆碱能接头(cholinergic junctions)和神经肌肉接头一样,对Β0Τ0Χ是敏感的。因此,基于Β0Τ0Χ的治疗，最近已扩大到包括令人眼花缭乱的近百个从张力失常到胃肠和泌尿系统疾病的状况。BoNT/A临床用药的有效性导致了对肉毒杆菌家族其他成员的兴趣的增加。比较研究表明，在7个不同的免疫血清型BoNTs(A-G)中，BoNT/A具有最长的致瘫效果，因此，力口强了特别的BoNT/A在神经疾病治疗中的有用性。所有的BoNTs都从细菌合成出来，是单一的多肽链，分子量为150kDa。细菌死亡和裂解后，毒素被细菌蛋白酶“切断”，产生50kDa的轻链和IOOkDa的重链,二者通过二硫键连接在一起。这两条链,仍然通过二硫键相连，通过胞转作用穿越肠上皮细胞进入血流中，并最终与外周胆碱能神经末梢(peripheralcholinergic nerve terminals)结合。BoNTs的极端毒性表明，外周神经末梢携带可以作为BoNTs高亲和受体的分子。事实上，数个突触囊泡蛋白已被证明作为BoNTs受体。重链负责BoNTs与神经末梢的结合，轻链是有效的攻击囊泡融合机器的内肽酶，因此必须进入神经末梢。BoNTs通过劫持囊泡内吞路线来完成这个任务。作为循环囊泡的内部液滴(interior drop)的pH值,BoNTs发生大的构象变化。这使重链的移位部分(被称为HN)，形成横跨囊泡膜的假定渠道，部分未折叠的轻链穿过该囊泡膜，滑入细胞溶质。在进入细胞溶质的过程中，二硫键被还原，将轻链从重链上释放。BoNT轻链是强的内肽酶，其攻击介导囊泡融合的三种SNARE蛋白的很多亚型，从而使神经递质释放。目前已知的是，BoNT/A和BoNT/E蛋白酶解SNAP-25，而BoNTs B，D，F和G在突触融合蛋白囊泡上切断VAMP。被BoNT/A切短仅9个氨基酸的SNAP-25仍保留其与原生质膜突触融合蛋白和囊泡小突触泡蛋白相互作用的能力，但不能介导正常的囊泡融合过程。关于肉毒杆菌神经毒素(BoNTs)的进一步信息,可以参见Davletov, B. ajohrs, M. andBinz,T. , Trends Neurosci 28,446-452(2005) ；Johnson, E. A. (1999)Annu Rev Microbiol53,551-575 ；Jankovic, J. (2004)J Neurol Neurosurg Psychiatry 75 (7),951-957 ；Aoki, K. R. and Guyer, B. (2001)EurJNeurol 8Suppl 5,21-29 ；Simpson, L. L. (2004)AnnuRev Pharmacol Toxicol 44,167-193 ;Dolly, 0. (2003)Headache 43Suppl I, S16-24 ;和 Montecucco, C. and Schiavo, G. (1993)Trends Biochem Sci 18(9),324-327. BoNT/A (BOTOX)的完整序列信息公开在 Binz，T. et al. (1990) JBiol Chem 265 (16)，9153-9158。重新定向策略迄今为止，BoNTs的好 处被限制用于神经肌肉状况和自主神经系统疾病的治疗。但是，BoNTs也可以阻止神经递质在中央神经元的释放，从而有可能在实验神经科学和未来处理较高的脑功能的神经学中利用它们。关于脑切片的研究，培养的神经元和突触体已经表明=BoNTs可以阻止神经递质的释放，不仅是こ酰胆碱，还有谷氨酸盐，甘氨酸，去甲基肾上腺素，多巴胺，血清素，ATP和各种神经肽(Ashton et al. (1988)，Capogna, M. etal. (1997),Sanchez-Prieto,J. et al. (1987), Verderio, C. et al. (2004), Luvisetto, S. etal. (2004)，and Costantin, L. et al. (2005))。BoNTs 的轻链是通过它们的伙伴重链来天然输送的，但是其他的输送的方式也是有效的，如脂质体或重组融合构建体(de Paiva,A. et al. (1990), Chaddock, J. A. et al. (2004), and Duggan, M. J. et al. (2002))。外源凝集素与BoNT/A的轻链进行重组的想法最近使得后者被输送进了痛觉传导(nociceptiveafferent)或背根节(Chaddock，J. A. et al. (2004))。重要的是，如果轻链与GFP荧光标签融合，则输送效率能够很容易跟踪，并可标记沉默的细胞。BoNTs的重链靶向突触体和输送它们的轻链到神经末端的能力提供了另ー个可以在神经生物学中使用的工具(Goodnough，M-C.et al. (2002)and Bade, S. et al. (2004))。不同分子的输送，特别是酶，用 BoNT 重链更容易操作突触生理学。实际上，最近的报道称BoNT/D可以输送重组的附着的酶到神经末端(Bade, S. et al. (2004))。发明人表明，由两部分的毒素重组以得到功能性肉毒杆菌毒素是可能的，所述两部分为具有易位结构域(HN)的轻链(LC)，其中，HN的C-末端携带SNARE标签(突触融合蛋白，SNAP-25或小突触泡蛋白);并且重链的受体结合部分(HC部分)，其N-末端携带SNARE标签(突触融合蛋白，SNAP-25或小突触泡蛋白)。SNARE标签允许功能単元的不可逆连接。在不具有健康风险的蛋白生产细菌株中，这两部分(LCHN和HC)可以分开生产。每个部分都可以通过安全的方式纯化。当混合两部分时，他们在I小时内生产出活性的神经毒素，其可在暴露的神经元中切断它的分子靶标SNAP-25，并阻止神经递质从神经末梢释放。由于具有SNARE标签的LCHN部分是功能性的(即，观察到SNAP-25神经元切断和神经递质释放的阻止)，通过加入具有SNARE标签的配体，用于LCHN/配体部分的不可逆组装，直接将该活性部分加入特异性的神经元或内分泌细胞是可能的。ー个例子是与SNARE标签连接的生长抑素肽。配体与趋化细胞的结合造成LCHN输送到将释放轻链的细胞里，因此在神经递质或激素释放中SNAP-25的损害随后停止。由于具有SNARE标签的HC部分是功能性的(即，在LCHN/具有SNARE标签的附着后，观察到神经递质释放的阻止)，使用具有SNARE标签的HC部分用于递送其他酶部分或成像部分至神经元是可能的。也可以使用具有SNARE标签的其他受体结合化合物(如生长抑素神经肽)，用于递送药物，成像试剂等进入携帯必要受体的特异性细胞中。具有SNARE基序标签的LCHN的序列和具有SNARE基序标签的HC的序列如下通过分子生物学技术融合编码的BoNT/A的轻链(1_449位氨基酸)，易位结构域(449-872位氨基酸)和SNARE蛋白的cDNA。凝血酶位点LVPR-GS(SEQ ID NO. 17)插入到轻链(LC)和BoNT/A的易位结构域(HN)之间，以模仿毒素被凝血酶切割的天然切ロ(用上述序列中的“-”表示)。与GST融合的蛋白按照如上所述进行纯化。使用凝血酶，用20mMHepes,pH 7. 3，IOOmM氯化钠将蛋白从珠子上洗脱下来。对于小突触泡蛋白2 (25-84)BoNT/AHc (876-1296)，洗脱缓冲液中还有O. 8%的辛基葡萄糖苷。洗脱后，我们得到具有以下序列的蛋白LcHN-SNAP25 BoNT/A Lc (1-449)凝血酶 HN(449-872) -SNAP25B (C 至 A) -SEQ IDNO. 18LcHN-Syx BoNT/A Lc (1-449)凝血酶 HN (449-872) _Syx3 (195-253)-SEQ ID NO. 19LcHN-Syb BoNT/A Lc (1-449)凝血酶 HN (449-872) -Syb2 (1-96 ；WWK-AAA) -SEQ IDNO. 20Syb-HcA Syb2 (25-84) BoNT/A He (876-1296)-SEQ ID NO. 21Syb HcD Syb2 (25-84) BoNT/D He (863-1276)-SEQ ID NO. 22纳米锁(Nanolock)HcA:Syx 3 (195-253) Syb 2(1-84) BoNT/A He (876-1296)-SEQID NO. 23SNAP25B (C 至 A) -SEQ ID NO. 24突触融合蛋白3 (195-253)-SEQ ID NO. 25除了由细菌生产获得的重组蛋白(以上所有)タト，也使用合成肽Syx3 肽(45aa，52aa_FITC)生长抑素-小突触泡蛋白多妝(Somatostatin-synaptobrevinpeptide)生长抑素-突触融合蛋白多肽(Somatostatin-syntaxin peptide)生长抑素肽-SEQ ID NO. 26AC-RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADAL-Ahx-Ahx-AGCKNFFWKTFTSC-OH为了使催化部分与受体结合域部分连接，发明人将融合有SNARE蛋白的活性部分(LcHN-Syx7LcHN SNAP25或LcHN-Syb)与含有第二 SNARE蛋白的受体结合部分混合I小时。通过加入第三SNARE伴侣封闭组装。表中给出组合的例子
催化结构域锁蛋白受体结合部分
LcHN-Syx3SNAP25Syb-HcA
LcHN-SNAP25Syx3(45aa)Syb-HcA
LcHN-SNAP25Syx3(52aa-FITC)Syb-HcA
LcHN-SNAP25Syx3(195-253)Syb-HcA
权利要求
1.用于形成分子支架的复合系统，该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，并且其中，所述衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋与所述衍生自小突触泡蛋白或其同系物 的多肽螺旋连接。
2.用于形成分子支架的复合系统，该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，并且其中，所述多肽螺旋连接在一起以形成两个含有螺旋的组分。
3.根据权利要求I所述的系统，其中，所述螺旋中的两个连接在一起，以使得这两个螺旋能组装进同一稳定的SNARE复合体。
4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述螺旋中的另外两个连接在一起，以使得这两个螺旋能组装进同一稳定的SNARE复合体。
5.根据权利要求2所述的系统，其中，所述螺旋中的三个连接在一起，以使得所有这三个螺旋能组装进同一稳定的SNARE复合体。
6.根据权利要求5所述的系统，其中，所述两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋和以下多肽螺旋连接在一起衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；或衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，所述螺旋中的一个被固定在基质上。
8.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，所述SNAP蛋白为SNAP-25。
9.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，所述多肽螺旋衍生自小突触泡蛋白。
10.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，每个螺旋的长度至少为约40个氨基酸。
11.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，每个多肽螺旋的序列与衍生出所述多肽螺旋的蛋白或蛋白的部分的序列具有至少约80%的同一性。
12.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，该系统包括的货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分。
13.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，该系统包括的货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分，或生长抑素肽或其功能部分。
14.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，该系统包括的货物部分包括与单独的螺旋或含有螺旋的组分附着的第一货物部分和第二货物部分，并且其中，所述第一货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分；且所述第二货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分，或生长抑素肽或其功能部分。
15.根据权利要求14所述的系统，其中，所述第二货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。
16.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，该系统还包括一个多肽螺旋，该多肽螺旋衍生自能够与SNARE复合体结合的复蛋白。
17.根据前述权利要求中的任意一项所述的系统，其中，该系统还含有去垢剂。
18.根据权利要求17所述的系统，其中，所述去垢剂选自MEGA8、C-HEGA 10、C-HEGA11、HEGA 9、庚基吡喃葡萄糖苷、辛基吡喃葡萄糖苷、壬基吡喃葡萄糖苷、zwittergent3-08、zwittergent 3-10 和 zwittergent 3-12。
19.根据权利要求17或18所述的系统，其中，所述去垢剂是辛基吡喃葡萄糖苷。
20.根据权利要求I或2所述的系统，其中，所述螺旋中的两个连接在一起，以使得这两个螺旋不能组装进同一 SNARE复合体。
21.根据权利要求I或2所述的系统，其中，所述螺旋中的两个连接在一起，并且其中，所述系统还包括单独的多肽螺旋，所述单独的多肽螺旋与连接在一起的两个螺旋的其中之一衍生自相同的蛋白。
22.根据权利要求21所述的系统，其中，所述单独的多肽螺旋固定在基质上。
23.由权利要求20-22中任何一项所述的系统产生的多聚体。
24.权利要求1-22中任何一项所述的复合系统的应用。
25.权利要求1-22中任何一项所述的复合系统在诊断中的应用。
26.其上固定有稳定的SNARE复合体的仪器，所述SNARE复合体包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分，其中，所述仪器选自阵列，检测器，微流体设备，SPR仪，石英晶体微天平仪，质谱仪，电泳仪，层析柱，扫描探针显微镜，和热量测定仪。
27.形成携带一个或多个货物部分的SNARE复合体的方法，该方法包括将两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋、一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋结合在一起，以形成稳定的SNARE复合体，其中，一个或多个货物部分与所述多肽螺旋附着，并且其中(i)衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接；或( )所述多肽螺旋连接在一起，以形成两个含有螺旋的组分。
28.用于形成分子支架的组分，该组分包括与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接的、衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，并且其中，这两个连接的螺旋能够形成稳定的SNARE复合体的一部分。
29.根据权利要求28所述的组分，其中，所述组分具有选自SEQIDNOsl2，13，14和73所示的序列。
30.用于形成分子支架的组分，其中，该组分包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，和，衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋或衍生自小突触泡蛋白的多肽螺旋，其中，这三个螺旋连接在一起，以形成三螺旋组分，并且其中，这三个连接的螺旋能够形成稳定的SNARE复合体的一部分。
31.根据权利要求30所述的组分，其中，所述组分具有SEQID NO. 15所示的序列。
32.权利要求28-31中任意一项所述的组分的应用。
33.一种包括组分的试剂盒，该组分包括与衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋连接的、衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，并且其中，这两个连接的螺旋能够形成稳定的SNARE复合体的一部分。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，所述多肽螺旋能够与突触融合蛋白/小突触泡蛋白衍生的螺旋形成稳定的SNARE复合体。
35.一种包括组分的试剂盒，该组分包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，和衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋或衍生自小突触泡蛋白的多肽螺旋，其中，这三个螺旋连接在一起，以形成三螺旋组分，并且其中，这三个连接的螺旋能够形成稳定的SNARE复合体的一部分。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包括衍生自第四SNARE蛋白的单独的多肽螺旋，所述第四SNARE蛋白为小突触泡蛋白或其同系物，或突触融合蛋白，其中，所述单独的多肽螺旋能够与所述三螺旋组分形成稳定的SNARE复合体。
37.用于形成分子支架的复合系统，该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，并且其中，所述SNARE复合体在去垢剂的存在下形成。
38.根据权利要求37所述的系统，其中，所述系统不含MunclS蛋白。
39.不存在Muncl8蛋白的情况下，去垢剂用于促进SNARE复合体组装的应用。
40.包括多个连接在一起的稳定的SNARE复合体的多聚体，其中，每个SNARE复合体包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；其中，来自一个SNARE复合体的螺旋与来自另一个SNARE复合体的螺旋连接，以将所述SNARE复合体连接在一起，并且其中，一个或多个货物部分与所述多肽螺旋附着。
41.根据权利要求40所述的多聚体，其中，所述多聚体还包括分支，其中，来自一个SNARE复合体的三个螺旋与三个不同的SNARE复合体中的螺旋附着。
42.一种多聚体的生产方法，该方法包括以下步骤I)提供衍生自第一 SNARE螺旋的第一多肽螺旋；2)将第二多肽螺旋和第三多肽螺旋与所述第一多肽螺旋结合，以形成三螺旋复合体，其中，所述第二多肽螺旋和第三多肽螺旋衍生自第二 SNARE螺旋和第三SNARE螺旋；3)将第四多肽螺旋与三螺旋束结合，以形成稳定的SNARE复合体，其中，所述第四多肽螺旋衍生自第四SNARE螺旋，并且其中，所述第四多肽螺旋与衍生自第一 SNARE螺旋的第五多肽螺旋连接；并且4)重复步骤2)和步骤3)，以形成多聚体，其中，一个或多个货物部分与所述多肽螺旋附着。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，在重复的步骤中，保持第二多肽螺旋，第三多 肽螺旋，第四多肽螺旋和第五多肽螺旋的同一性。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中，所述第二多肽螺旋和第三多肽螺旋连接在一起，以使得它们能够一起组装进同一 SNARE复合体。
45.根据权利要求42-44中任意一项所述的方法，其中，所述第一多肽螺旋固定在基质上。
46.根据权利要求42-45中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括在每个结合的步骤后的洗涤步骤，以去除任何未结合的螺旋。
47.根据权利要求42-46中任意一项所述的方法，其中，通过使用衍生自第一SNARE螺旋的第六多肽螺旋，将分支引入所述多聚体中，其中，所述第六多肽螺旋与第二多肽螺旋、第三多肽螺旋、第四多肽螺旋或第五多肽螺旋中的一个附着。
48.由权利要求42-47中任意一项所述的方法产生的多聚体。
49.用于形成包括两个货物部分的二元复合物的复合系统，该复合系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分与第一螺旋附着，且第二货物部分与第二单独的螺旋附着，并且其中，所述SNARE复合体的形成导致了所述二元复合物的形成。
50.根据权利要求49所述的复合系统，其中，所述二元复合物是毒素。
51.根据权利要求50所述的复合系统，其中，所述毒素选自肉毒杆菌毒素、白喉毒素、破伤风毒素和蓖麻毒素。
52.根据权利要求51所述的复合系统，其中，所述毒素为肉毒杆菌毒素。
53.根据权利要求52所述的复合系统，其中，该复合系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分与第一螺旋附着，且第二货物部分与第二单独的螺旋附着，并且其中，所述第一货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分；且所述第二货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。
54.权利要求49-53中任意一项所述的复合系统的应用。
55.权利要求50-53中任意一项所述的复合系统在治疗中的应用。
56.根据权利要求51所述的复合系统，其中，所述毒素选自白喉毒素和蓖麻毒素，用于治疗肿瘤疾病。
57.根据权利要求52或53所述的复合系统，其中，所述复合系统用于治疗通过抑制神经突触而缓解的疾病或状况。
58.根据权利要求57所述的复合系统，所述通过抑制神经突触而缓解的疾病或状况选自以下组成的组过度出汗，过度流涎，肌张力失常，胃肠疾病，泌尿疾病，面肌痉挛，斜视，大脑性瘫痪，口吃，慢性紧张性头痛，hyperlacrymation,多汗症,咽下缩肌疫挛,疫挛性膀胱，疼痛，偏头痛，以及美容，如减少皱纹，抬头纹等。
59.一种治疗通过抑制神经突触而缓解的疾病或状况的方法，该方法包括将有效量的含有权利要求52或53所述的系统的组合物给药至受试者。
60.形成SNARE复合体以形成包括两个货物部分的二元复合物的方法，该方法包括将两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋结合在一起，以形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分与第一螺旋附着，且第二货物部分与第二单独的螺旋附着，并且其中，所述SNARE复合体的形成导致了所述二元复合物的形成。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述二元复合物是毒素。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述毒素选自肉毒杆菌毒素，白喉毒素，破伤风毒素和蓖麻毒素。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述毒素是肉毒杆菌毒素。
64.根据权利要求63以形成肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括将两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋结合在一起，以形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分与第一螺旋附着，且第二货物部分与第二单独的螺旋附着，其中，所述第一货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分；且所述第二货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。
65.用于形成肉毒杆菌毒素的组分，该组分包括衍生自SNAP蛋白、突触融合蛋白、或小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，所述多肽螺旋与货物部分附着，所述货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分。
66.用于形成肉毒杆菌毒素的组分，该组分包括衍生自SNAP蛋白、突触融合蛋白、或小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，所述多肽螺旋与货物部分附着，所述货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。
67.权利要求65或66所述的组分的应用。
68.一种试剂盒，该试剂盒包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，其中，第一货物部分与第一螺旋附着，且第二货物部分与第二单独的螺旋附着，并且其中，所述第一货物部分含有肉毒杆菌毒素的轻链或其功能部分，以及肉毒杆菌毒素的重链的易位部分，且所述第二货物部分含有肉毒杆菌毒素的重链的受体结合部分。
69.用于形成分子支架的复合系统，该系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体，并且其中，至少两个所述多肽螺旋的长度小于50个氨基酸。
70.形成携带一个或多个货物部分的SNARE复合体的方法，该方法包括将两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋，和一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋结合在一起，以形成稳定的SNARE复合体，其中，一个或多个货物部分与所述多肽螺旋附着，并且其中，至少两个所述多肽螺旋的长度少于50个氨基酸。
全文摘要
本发明涉及一种复合系统，该复合系统包括两个衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一个衍生自突触融合蛋白的多肽螺旋；一个衍生自小突触泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一个或多个与所述多肽螺旋附着的货物部分，其中，这四个多肽螺旋能够形成稳定的SNARE复合体。本发明还涉及该复合系统的生产方法和该复合系统的应用。
文档编号G01N33/94GK102625812SQ201080044446
公开日2012年8月1日 申请日期2010年8月12日 优先权日2009年8月12日
发明者B·达夫列托夫, E·费拉里, F·达里欧斯, M·索洛维耶夫 申请人:医药研究协会