专利名称：有机着色微粒、含有其的诊断药试剂盒以及体外诊断方法
技术领域：
本发明涉及来自有机高分子的有机着色微粒以及使用了其的诊断药试剂盒及体外诊断方法。
背景技术：
从粒径、机械强度、粒径分布、形状、凝聚程度的控制难易度方面考虑，由高分子形成的微粒被利用于各种领域，例如，可列举出调色剂、包装材料的抗粘连剂、绝缘填料、晶体成核剂、层析法用填充剂、研磨剂等。近年来，还应用于免疫诊断试剂用载体、液晶显示器的间隔物(spacer)、分析仪器的校正用标准粒子、多孔膜的检定用标准粒子等用途。、
由高分子形成的微粒在免疫诊断药用载体用途中的使用量尤为増大，特别是在使用了免疫层析方法的诊断(以下，也称为“免疫层祈”。)中的使用量増大。作为主要原因，首先可列举出像妊娠检查试剂那样医务人员以外的普通人也可利用的作为准药品的试剂盒被大量销售，除此之外还有以下背景作为腺病毒(adeno virus)、轮状病毒(rota virus)、诺如病毒(noro virus)等各种病毒，B型、C型各种肝炎检查，0-157等病原性菌群等各种检查的POCT (即时检验(point-of-care-testing):医师或其他医疗担当者在患者近旁实施检查并迅速地得到結果)的手段，对该微粒的需求高涨。由于近年来流感的流行，推測今后免疫层析的使用量会激増。另外除了免疫诊断药以外，免疫层析还利用于生物化学分析、遗传学分析等任意的分析反应等各种领域中。免疫层析是指例如如下方法使被由金属胶体或源于聚苯こ烯的着色胶乳形成的显色微粒标记了的抗体或抗原(配体)选择性地与层析基材上的检查对象物质进行反应，形成复合体并展开；接着，通过预先将抗原或抗体(与前述配体特异性地结合的物质)固定在层析基材上的规定的检测位置并捕捉展开了的复合体，由此使其显色。截止至今进行了多种研究，并确立了简便的检查方法，从减少在医疗现场POCT给医疗从业人员带来的负担这一需要考虑，期望免疫层析试剂盒的进ー步高灵敏度化、诊断迅速化。在流感的诊断中，有时在感染初期的阶段时免疫层析不呈阳性，而在翌日检查时变为阳性。为了解决该问题，寻求检查的进ー步高灵敏度化。另外，用I个免疫层析试剂盒同时进行A型抗原和B型抗原两者的诊断已日趋普遍。这样地存在多种检体的情况下，若一次检查可同时检查多种检查对象物质，则有利于诊断迅速化，但为了防止误诊，需要提高可视性。因此，优选用检出检查对象物质时的显色颜色对每个检查对象加以区别(多色显色化)。在各种病毒的感染症诊断、食品安全性诊断中，也期望通过I个试剂盒同时进行多种被诊断物的诊断，认为同样的按顔色加以区分是有效的。免疫层析的显色来自标记中使用的物质。在金属胶体的情况下，因对应于其金属种类的等离子体效果而导致显色，因此仅限定为ー种顔色。例如，如以下的专利文献I所记载那样地使用金胶体时仅显色为红色。设想同时检查多种项目时，可期待在检测位置上下工夫这种程度的效果，但从可视性、防止误诊的观点考虑，不能说是适合的。另外，在金属胶体的情况下，配体的结合方法一般基于被称为物理吸附的原理。作为配体的结合方法，通常可列举出物理吸附、化学键合(共价键合)、离子键合、包理法等。物理吸附是指利用作用于基材(例如，显色微粒)与所结合的材料(例如，配体)之间的疏水性相互作用的结合方法。实际上不仅疏水性相互作用起作用，静电作用、分子间力、其它各种机理也起作用。物理吸附与其它的结合方法相比操作容易，因此从简便性、成本的方面来看是有利的。然而在物理吸附的情况下，有时出现配体的结合部位不固定、或因表面活性剂的存在而导致吸附受阻等问题。另外有时也无法结合充足量的配体。另ー方面，如以下的专利文献2所公开的那样，在使用聚苯こ烯等胶乳粒子的情况下，通过使由分散染料、油溶染料、顔料形成的显色团包含于微粒后使用，可以按颜色加以区分。另外，一般而言，作为配体的结合方法可以选择物理吸附、化学键合等任意的方法。因此还可回避前述物理吸附的问题。然而，根据专利文献2的实施例，对粒子的染色量(amount of dyeing)低至6wt%左右,显色的强度变弱。因此,在用于免疫层析的情况下,无法得到明显的显色结果，可信性欠缺。以下的专利文献3中公开了将纤维素染色而成的微粒，相对于纤维素微粒量的染 料投料量为20wt%左右，因此所得到的染色微粒淡。如以下的专利文献4那样通过物理吸附或化学键合对其赋予抗体并用于免疫层析，但抗体的结合量不充分，并且微粒本身的显色弱，因此无法得到明显的显色結果。现有专利文献专利文献专利文献I:日本特公平7-60159号公报专利文献2:日本专利第2955405号说明书专利文献3:国际公开W02008/084854小册子专利文献4:国际公开W02009/123148小册子
发明内容
发明要解决的问题鉴于上述现状，本发明的课题在于得到显色性高且能按顔色加以区分的有机着色微粒，并使其结合配体而应用于诊断药、特别是免疫层析中，从而达成免疫层析试剂盒的高灵敏度化。用于解决问题的方案本发明人等进行深入研究并反复实验，结果成功地以纤维素为起始原料，得到染色为深色的微粒。更令人震惊的是，发现将纤维素染色为深色，由此可通过物理吸附来结合配体，进而根据需要导入反应性活性基团，由此可通过共价键来结合配体。而且发现将其作为诊断药用载体应用于免疫层析时可实现免疫层析试剂盒的高灵敏度化，从而完成了本发明。即本发明如下所述。[I] 一种有机着色微粒，其特征在于，其平均粒径为IOnnTlOOOnm,且显色强度为I. 0 5· O。[2]根据上述[I]所述的有机着色微粒，其中，上述有机着色微粒的重量的10wt% 80wt%为着色成分。
[3]根据上述[2]所述的有机着色微粒，其中，上述着色成分为染料。[4]根据上述[I] [3]的任一项所述的有机着色微粒，其中，上述有机着色微粒的重量的20wt% 90wt%来自纤维素。[5]根据上述[I] [4]的任一项所述的有机着色微粒，其通过物理吸附结合了配体。[6]根 据上述[I] [5]的任一项所述的有机着色微粒，其具有反应性活性基团。[7]根据上述[6]所述的有机着色微粒，其中，上述反应性活性基团具有原子数为3以上的间隔结构。[8]根据上述[6]或[7]所述的有机着色微粒,其中,通过共价键在上述反应性活性基团上结合了配体。[9] ー种诊断药试剂盒，其含有上述[I] [8]的任一项所述的有机着色微粒。[10]根据上述[9]所述的诊断药试剂盒，其为免疫层析试剂盒。[11] ー种体外诊断方法，其包括使用上述[I] [8]的任一项所述的有机着色微粒的エ序。[12]根据上述[11]所述的体外诊断方法，其为免疫层析方法。发明的效果本发明所述的有机着色微粒与现有技术的胶乳粒子的显色性相比，具有格外显著的优异显色性，且能够吸附抗体等配体，因此可应用于免疫层析，该微粒在选择性并特异性的反应中被捕捉时的显色更加明显化，由此可以提供高灵敏度的免疫层析试剂盒，进而，由于可使显色成为多色，因此对同时测定多种检查对象是有用的。另外，本发明的有机着色微粒除了选择来自染料的物理吸附作为与配体的结合方法之外，还可以选择化学键合等任意方法，因此可应用于各种检查对象物质。因此本发明使误诊少的早期诊断变为可能，并大大地有助于检查的迅速化，大幅扩大免疫层析的适用范围。
具体实施例方式<平均粒径>以下，对本申请发明进行详细地说明。本发明的有机着色微粒是指平均粒径为IOnnTlOOOnm且显色强度为I. (Γ5. O的有机着色微粒。平均粒径的优选范围为100nnT900nm,更优选为200nnT800nm。平均粒径超过IOOOnm时，用于免疫层析试剂盒时的展开慢，不利于评价的迅速化，并且存在以下倾向在展开膜上变得容易被捕捉，背景本身显色而导致所期待的检出部位的显色变得不明显。特别是对于检测部位而言，由于捕捉试剂的涂布而导致展开膜的孔径变小的情况较多。因此此处存在标记易于被捕捉的倾向，即容易出现假阳性(false-positive)。作为检查试剂盒已变得无法信赖。<显色强度>本发明的显色强度如下定义在光路长度10mm、400nnT800nm的范围下使用积分球对有机着色微粒的分散液进行可见光吸光度測定，并减去分散介质的背景成分，从而得到分散基质本身的吸光度曲线，将其最大值(ABS)用分散基质的重量百分数进行折算，算出对应于0.01wt%的值。通过使用积分球，可以降低粒子的散射光的影响，因此可判断所得到的值可作为微粒的显色程度的指标，该数值越大则显色越明显。本发明的微粒的显色强度为1.0以上，越大越优选。为了増大显色强度，可选择使用显色强的物质作为分散的染料、顔料或増加染色次数等手段。然而，想要使显色强度为5. O以上，使用通常的染料进行数次染色是无法达成的，因此考虑经济性时，显色强度为l.(T5.0，更优选为I. 5、. 0，进ー步优选为2. (Γ5. O。显色强度小于I. O时，显色弱，因此用于免疫层析试剂盒时检出部位的可视性差，导致检查结果的可信性受损。<有机着色微粒的原材料(材料)>本发明的有机着色微粒的原材料只要是显色強度高、稳定分散的原材料则无特别限定。可应用能够使用染料、顔料实现深色化的原材料，实现深染化且稳固的染色有助于在基于免疫层析的检查时、试剂盒的长期保管时赋予品质稳定化，因此优选。为了达成稳固的染色，例如，可以使用共价键性的反应染料，作为可用反应染料染色的原材料，可列举出来 自纤维素的原材料。由来自纤维素的原材料形成的微粒具有大量的羟基，因此不仅可通过共价键保持多个反应性染料，还可在深染化后保持对水等的稳定分散性。因此，作为有机着色微粒的原材料，使用纤维素是适合的，对其种类并无特别限定。可以使用再生纤维素、纯化纤维素、天然纤维素等。还可以使用部分衍生化的纤维素。优选有机着色微粒的重量的2(T90wt%来自纤维素。更优选有机着色微粒的重量的2(T80wt%来自纤维素。进ー步优选为 20 70wt%。<有机着色微粒的原材料的制造方法>对本发明的有机着色微粒的原材料的制造方法并无特别限定。可使用基于湿式粉碎等的力学方法，进行分级而得到所期望的平均粒径的微粒，但在本发明中，将纤维素溶解在其良溶剂中，并使用混合了水、有机溶剤、氨等的凝固液，由此调制了纤维素微粒。通过使用该方法而得到的纤维素微粒的粒径可利用凝固液的组成进行调整。以下通过具体例进行更详细地说明，但其意图不在于对本发明的有机着色微粒的原材料的制造方法进行限定。首先，将纤维素棉短绒(Iinter)溶解在纤维素的良溶剂中。本发明中良溶剂使用以公知的方法调制的铜氨溶液。而且作为凝固液主要使用有机溶剤+水+氨混合体系。边搅拌该凝固液，边添加事先调制好的铜氨纤维素溶液来进行凝固。再添加硫酸进行中和、再生，从而可以得到含有目标纤维素微粒的浆料。通过对该浆料进行稀释、纯化、干燥，可得到纤维素微粒分散液、纤维素微粒。く着色方法〉对本发明的有机着色微粒的原材料的着色方法并无特别限定，可使用采用染料的方法、采用颜料的方法等各种方法。其中，从可提高显色强度的观点出发优选采用染料的方法，可以使用直接染料、含金染料、酸性染料、反应染料、碱性染料、分散染料、硫化染料、植物染料，萘酚染料等各种染色剂。在本发明中使用纤维素微粒作为有机着色微粒时，与纤维的表面积相比，纤维素微粒的表面积显著増大，因此可极大地提升染色量，还可得到有机着色微粒之中的10wt%以上为着色成分的微粒。然而，从显色性和经济性的观点考虑，着色成分优选为有机着色微粒的10wt% 80wt%,更优选为20wt% 80wt%,进一步优选为30wt% 80wt%。进而，在本发明中，为了能够将纤维素微粒染为深色、并使得长期稳定即湿处理牢度(wet colour fastness)优异而期望用共价键进行染色，从这ー观点出发，优选选择反应染料。
本发明的相对于有机着色微粒的着色成分的比例可通过着色前后的重量变化来算出。本发明中作为着色方法使用染色，且在该过程中，使用离心分离，因此有时无法回收全部的粒子，该情况下由可回收的粒子的重量与染色前的粒子的重量算出着色成分的比例。例如对I. Og纤维素微粒进行染色而得到2. Og有机着色微粒时为50wt%。另外，可根据需要，通过对有机着色微粒和着 色成分进行分离的操作，例如，通过基于酸、碱处理切断共价键、使微粒溶胀等最佳的清洗操作等将有机微粒和着色成分分离而算出着色成分的比例。< 配体>本发明的配体是指具有与特定的检查对象物质选择性且特异性地结合的性质的物质。对其种类并无特别限定，例如可列举出抗体、抗原、酶、基因、激素、细胞、核酸、肽、蛋白质等。<基于染色的配体的物理吸附>本发明中，仅使用染料将纤维素染色为深色即可实现配体的物理吸附。在仅染色而物理吸附性能不充分的情况下，也可通过与根据需要的纤维素的衍生化进行组合来调整亲水疏水平衡。仅将纤维素染色为深色即可实现配体的物理吸附的理由尚未明确，可考虑为通过染色而使纤维素疏水化。一般而言，对于薄膜等，可通过测定接触角来了解亲水疏水程度，但对于纳米微粒难以測定接触角。因此典型的是在将作为平坦的纤维素的Cellophane (注册商标)染色为深色并测定接触角时未染色的纤维素的接触角为2(Γ30度左右，与此相对，对于充分地染色的Cellophane (注册■商标),接触角与染料染色量成比例地达到4(Γ100度。通常的染料具有苯、萘、蒽醌、偶氮等疏水性强的结构。本发明中，在纤维的染色条件下通常令人考虑不到的使大量的染料与纤维素结合的结果，可预测为能够达成可物理吸附抗体的程度的疏水化。在使用蛋白质定量法中普遍的罗氏蛋白质定量法(I ο wrymethod)对所结合的小鼠IgG抗体进行定量时，在如本发明的有机着色微粒那样进行充分染色的情况下，可确认到抗体的结合。另ー方面，染色強度过低时，未观察到与未染色粒子的差异，存在抗体结合量低的倾向。<基于反应性活性基团的配体的化学键合>本发明中作为配体的结合方法，不仅有物理吸附，还可选择化学键合。一般而言，物理吸附具有操作简便且成本低廉的优点，但被指出可能发生以下那样的问题。例如，配体的结合部位不固定而丧失反应的选择性、因表面活性剂的存在化而导致所结合的配体脱落等。因此为了解决这些问题，有时也可根据状况采取与配体形成共价键的化学键合方式。另外在化学键合方式中，有时可比物理吸附获得更多的配体的结合量。<反应性活性基团>本发明的反应性活性基团用于与配体形成共价键。作为反应性活性基团的代表性的例子，可列举出羧基、氨基、醛基、硫醇基、环氧基、羟基等。对种类并无特别限定，优选羧基和氨基。在羧基的情况下，可使用碳ニ亚胺与配体的氨基形成共价键。有关导入反应性活性基团的时机，可在染色前预先导入，也可在染色后导入。导入的部位可以为有机微粒，也可以导入染料部分。另外，还可将染料的结构的一部分作为反应性活性基团。本发明的反应性活性基团的导入可通过红外分光分析装置进行确认。例如，在羧基的情况下，若为游离酸型则可通过1730CHT1前后的吸收进行确认。另外在氨基的情况下，若为伯氨基则可通过1600cm—1前后的吸收进行确认。其中对反应性活性基团的导入量进行定量是非常困难的。这是由于存在大量的染料成分，通过一般的定量方法无法进行定量。本发明中红外分光分析装置仅可判断是否导入。<间隔结构(spacer structure) >本发明中的反应性活性基团优选具有原子数为3以上的间隔结构。本申请发明人等发现在高度深色化的有机着色微粒上导入反应性活性基团并使其化学键合配体后用于免疫层析时，若具有原子数为3以上的间隔结构，则灵敏度进ー步提升。其理由还未明确，例如，可认为存在以下可能由于大量存在的染料的位阻、电荷的影响，导致配体与检查对象物质的选择性的反应受到阻碍。间隔结构是指存在于反应性活性基团与有机着色微粒之间的原子。另外，间隔结 构存在支链时则指的是主链的原子数。例如，众所周知的羧甲基纤维素是将纤维素的羟基的一部分取代为羧甲基而得到的。此时的反应性活性基团为羧基，而间隔结构为-CH2-,即成为原子数为I的间隔结构。本发明的实施例中，用以下4种方法导入了具有间隔结构的反应性活性基团。将化合物Γ4的结构分别表示为化合物f4。原本羟基的一部分结合有染料，但省略染料。<化合物I >
权利要求
1.一种有机着色微粒，其特征在于，其平均粒径为IOnnTlOOOnm,且显色强度为I.0 5· O。
2.根据权利要求I所述的有机着色微粒，其中，上述有机着色微粒的重量的10wt% 80wt%为着色成分。
3.根据权利要求2所述的有机着色微粒，其中，上述着色成分为染料。
4.根据权利要求I所述的有机着色微粒，其中，上述有机着色微粒的重量的20wt% 90wt%来自纤维素。
5.根据权利要求I所述的有机着色微粒，其通过物理吸附结合了配体。
6.根据权利要求I所述的有机着色微粒，其具有反应性活性基团。
7.根据权利要求6所述的有机着色微粒，其中，上述反应性活性基团具有原子数为3以上的间隔结构。
8.根据权利要求6所述的有机着色微粒，其中，通过共价键在上述反应性活性基团上结合了配体。
9.ー种诊断药试剂盒，其含有权利要求Γ8的任一项所述的有机着色微粒。
10.根据权利要求9所述的诊断药试剂盒，其为免疫层析试剂盒。
11.ー种体外诊断方法，其包括使用权利要求广8的任一项所述的有机着色微粒的エ序。
12.根据权利要求11所述的体外诊断方法，其为免疫层析方法。
全文摘要
本发明提供一种高灵敏度且可多色显色的免疫层析试剂盒、以及适合作为该试剂盒的成分的有机着色微粒。以纤维素作为起始原料调制了一种有机着色微粒，其特征在于，其平均粒径为10nm~1000nm，且显色强度为1.0~5.0。已判明将所述有机着色微粒用作免疫层析试剂盒的标记时，成为比现有技术灵敏度更高的免疫层析试剂盒。本发明所述的免疫层析试剂盒还可多色显色，对迅速的诊断来说是有用的。
文档编号G01N33/543GK102667482SQ201080052098
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月16日 优先权日2009年11月17日
发明者吉田晓, 土井雅宪, 松井敏彦, 松濑武志, 盐见祥之, 美村信之 申请人:旭化成纤维株式会社