诊断阿尔茨海默病或轻度认知损害的新的诊断方法

专利名称：诊断阿尔茨海默病或轻度认知损害的新的诊断方法
技术领域：
本发明涉及使用淀粉样蛋白β的片段的寡聚状态作为生物标记检测和诊断阿尔茨海默病，进一步涉及确定生物学样品中淀粉样蛋白β的片段的寡聚状态的新方法。
背景技术：
阿尔茨海默病是最常见形式的痴呆，其占所有痴呆性疾病的大约65-70%(Blennow et al.，2006)。作为预期寿命增加的结果，这种疾病在高度发达的工业化国家如日本和中国以及在美国和欧洲已经成为特别关注的问题。据估计阿尔茨海默病患者人数将从2001年的2千4百万增加至2040年的8千I百万(Ferri et al.，2005)。目前在世界范围内治疗和护理AD患者的花费每年为大约2500亿美元。所述疾病散发形式的进展相对缓慢，且阿尔茨海默病通常在第一个症状出现之后持续大约10-12年。目前非常难以对AD进行可靠及早期诊断并将之与其它形式痴呆区分。可靠性超过90%的良好诊断仅在该疾病的晚期才可行。先前仅能推测可能或大概是阿尔茨海默病；诊断依赖于使用 Knopman et al. , 2001、Waldemar et al. , 2007 或 Dubois etal.，2007所述的某些标准。然而，在注意到第一个临床症状之前20-30年已经开始发生神经变性(Blennow et al. , 2006; Jellinger KA，2007)。临床发病期通常特征在于所谓的“轻度认知损害”(MCI)，患者示出可测的认知缺陷，这不足以能以明确方式诊断痴呆(Petersenet al. , 1999; Chetkow et al.，2008)。许多MCI患者具有AD典型的神经病理学改变，这意味着可能是早期阶段AD,但不确定(Scheff et al. , 2006;Markesbery et al. , 2006; Bouwmanet al. , 2007) 0然而，许多MCI病例不进展为阿尔茨海默病，在这些情况中，其它因素造成认知缺陷(Saito et al. , 2007; Jicha et al.，2006 和 Petersen et al.，2006)。虽然一些MCI患者未示出其病症的任何恶化或者甚至一些改善，但是对于大多数MCI患者而言，认知缺陷将持续进展为临床痴呆。每年这种转变率为大约10_19%(Gauthier etal., 2006; Fischer et al.，2007)。目前有一种组合的临床、神经心理学和成像方法，其能区分轻度认知损害的各种亚型(Devanand et al. , 2007;Rossi et al.，2007;Whitwell etal. , 2007;Panza et al.，2007)。然而,在这些亚型之间关于痴呆的进一步进展无明显差异(Fischer et al.，2007)。因此，最重要的是开发一种能明确及可靠地在早期阶段、适当地在其发病或MCI期间诊断阿尔茨海默病的方法。现有抟术牛物标记阿尔茨海默病的生物标记已经在现有技术中描述。与熟知的心理学测试如ADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT 或画钟测试(Clock Drawing test) 一起，推测生物标记可改善首次诊断以及监测疾病进展的灵敏性和特异性。关于目前AD/MCI的生物标记的开发状况，已提议将所述疾病的将来与其它诊断标准相关联(Whitwell et al. , 2007;Panza etal., 2007; Hyman SE，2007)。推测生物标记在将来会支持传统的神经-心理学测试。通常认为它们将是开发抗阿尔茨海默病药物的非常重要的替代标记(Blennow K, 2004;BlennowK, 2005;Hampel et al. , 2006;Lewczuk et al. , 2006;Irizarry MC, 2004)。结构性生物标记
“磁共振成像”(MRI)是一种可以检测脑部退行性萎缩的成像方法(Barnes J etal. , 2007; Vemuri et al.，2008)。因此，内侧颞叶(MTA)的萎缩对在老年患者脑部海马区退行性改变敏感；这可以通过MRI非常明确地观测，但是非特异于阿尔茨海默病。轻度MTA在其它痴呆中不更常见(Barkhof et al.，2007)，但是其与MCI相关(Mevel etal.，2007)。由于这个原因而不能单独从MRI数据确定神经变性是阿尔茨海默病还是阿尔茨海默病早期阶段。另一种成像方法是正电子发射计算机断层扫描(PET)，其观测淀粉样沉积物上检测分子(PIB)的积聚。通过硫黄素T-类似物(11C)PIB越来越多地分别积聚在MCI和轻度阿尔茨海默病患者脑部的某些区域中而可以进行检测(Kemppainen etal. , 2007;Klunk et al. , 2004;Rowe et al. , 2007);遗憾的是这在不具有痴呆的对象中也可检测出(Pike et al.，2007)。这大概示出通过PET检测淀粉样沉积物使得可以检测临床前阶段的阿尔茨海默病，然而，这需要通过进一步的研究证实。除了最常使用的方法MRI和PET之外，还有另外的AD结构性生物标记CBF-SPECT，CMRgl-PET (葡萄糖代谢质子光谱分析(H-IMRS),高场强功能性MRI,基于体素的形态测量学(voxel-based morphometry),内侧基底颞叶的增强激活(经用于检测小神经胶质细胞的fMRI，(R) -[ (11) C]PKl1195PET检测(Huang et al. , 2007;Kantarci et al. , 2007;Petrella et al.,2007;Hamalainen et al. , 2007;Kircher et al. , 2007;Kropholler et al.，2007)。CSF生物标记老年斑(Senile plaques)是阿尔茨海默病的病理学特征之一。这些斑主要由Αβ (1-42)肽组成(Attems J，2005)。在一些研究中，可以示出在MCI患者的CSF中低水平的Αβ (1-42)与阿尔茨海默病进程中的进一步发展特别相关(Blennow andHampel, 2003;Hansson et al.，2006 和 2007)。CSF 减少可能是由于脑中 A β (1-42)增强的积聚所致(Fagan et al. , 2006; Prince et al. , 2004; Strozyk et al.，2003)。另一种可能是半溶解的Αβ (1-42)寡聚体的出现(Walsh et al.，2005)，其可以导致CSF中较低水平的检测。特别是在阿尔茨海默病早期阶段中，检测到Αβ (1-42)浓度降低，同时可以检测到CSF 中 Tau 蛋白和憐酸-tau 蛋白量分别增加(Ewers et al. , 2007; Lewczuk et al.，2004)。为了提供更好的生物标记可预测性，通常尝试使用Tau/Αβ (1-42)比率，并使其与不具有痴呆的老年人(Fagan et al. , 2007;Gustafson et al. , 2007;Hansson et al. , 2007; Liet al. , 2007; Stomrud et al. , 2007)以及 MCI 患者(Hampel et al. , 2004;Maccioni etal. ,2006; Schonknecht et al.，2007)中的认知缺陷预测相关联。脑中 Αβ (1-42)、Tau、磷酸-Tau-Thr231的死前CSF水平与死后组织病理学改变之间的进一步相关性可以在AD患者中检测到(Clark et al. , 2003;Buerger et al.，2006)。然而，在其它研究中，可以检测到在尸检后CSF生物标记和Aβ (1-42)、总Tau及磷酸-Tau与APOE ε 4-等位基因、斑和缠结负载(tangle load)无相关性(Engelborghs et al. , 2007;Buerger et al.，2007)。在多中心研究中检测到令人感兴趣的方面。其示出总Tau和磷酸-Tau(181)的水平增加与Αβ (1-42)/Αβ (1-40)比率降低相关，但是与单独的Αβ (1-42)不相关(Wiltfang etal.，2007)。然而，在其它的CNS疾病如Creutzfeldt-Jakob病、脑梗塞和脑血管性痴呆中也检测到CSF Tau水平增加，其与神经元丧失均相关(Buerger et al.，2006 (2) ; Bibl etal.，2008)。另一种可能的生物标记是CSF中BACEl活性增加作为MCI的指征(Zhong etal. , 2007) 0该研究还论述了增加的BACEl活性将导致A β产生增加及因此所述肽的聚集增加。阿尔茨海默病伴随神经炎症过程。CSF抗小胶质细胞抗体因此是AD中这些炎症过程的可能的生物标记(McRea et al.，2007)。 尽管推测许多生物标记能早期诊断阿尔茨海默病，但是无一种生物标记保证可靠且明确诊断。这通常是由于大多数研究使用各自的生物标记和临床诊断对比。更好的方法是使生物标记与阿尔茨海默病的病理学因素相关联。一种可能的方法是重复分析经明确鉴别及定义的神经病理学痴呆疾病的免疫沉淀的CSF样品以澄清Αβ (1-40)和Αβ (1-42)是否是合适的神经化学性痴呆标记(Jellinger et al.，2008)。为了揭示新的迄今为止未知的阿尔茨海默病的生物标记，通常通过对比性蛋白质组分析分析CSF样品，这样可以增强的灵敏性诊断AD，也能与其它退行性痴呆疾病区分(Finehout et al. , 2007;Castano et al. , 2006;Zhang etal. , 2005; Simonsen et al. , 2007; Lescuyer et al. , 2004; Abdi et al.，2006)。在蛋白质组分析之后，应详细分析潜在的新的生物标记的适合性及与病理学因素的相关性。通过蛋白质组分析发现的生物标记的一个典型实例是截短的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，其作为多发性硬化症的生物标记；这个生物标记随后被证实是储存假象(storage artefact) (Iraniet al. , 2006;Hansson et al.，2007(2))。血浆生物标记除了常用的血浆生物标记即Αβ肽之外，另外的炎症性血浆标记也用于痴呆的早期诊断(Ravaglia et al. , 2007;Engelhart et al.，2004),特别用于阿尔茨海默病的诊断(Motta et al.，2007)。所有这些标记仍处于讨论中。通过来自AD患者和健康对照的血衆的对比性蛋白质组分析也发现了其它可能的生物标记(German et al. , 2007; Ray etal.，2007)。未来还将示出这些生物分子是否确实特异于阿尔茨海默病及是否适合作为生物标记。还没有确信或合适的数据示出上述任何生物标记的特异性或适合性。与分析CSF中淀粉样蛋白β相反，迄今为止关于血浆中合适的Αβ生物标记的结果不可靠或者不明确。在一些研究中，发现血浆中Αβ (1-42)/Αβ (1-40)比率降低与认知功能正常人向MCI或阿尔茨海默病患者转化增强之间的相关性((Graff-Radfordet al. , 2007; van Oijen et al. , 2006; Sundelof et al.，2008)。然而，其它研究检测到A β (1-42)血浆水平降低更可能是从MCI转变为AD的标记(Song et al.，2007)，不适合作为阿尔茨海默病的神经变性目的的标记(Pesaresi et al.，2006)。然而，大多数研究未示出健康对照个体与散发性阿尔茨海默病患者之间Αβ血浆水平中的差异(Fukumotoet al. , 2003;Kosaka et al. , 1997;Scheuner et al. , 1996;Sobow et al. , 2005;Tamaokaet al. , 1996;Vanderstichele et al.，2000)。一些研究还不出血衆中Αβ水平与在脑中的水平不相关(Fagan et al. , 2006; Freeman et al.，2007),与在CSF中的水平也不相关(Mehta et al. , 2001; Vanderstichele et al.，2000)。在最近的研究中，检测到 CSF 和血浆之间Αβ (1-40)与Αβ (1-42)的相关性，但是只是在健康对照中。这种相关性在MCI和AD中不可检测到，这通过由于A β沉积在脑中导致CSF与血浆A β之间平衡被破坏而解释(Giedraitis et al.，2007)。通常，假设血浆A β (1_42)水平不是MCI或AD的可靠生物标记(Blasko et al. , 2008; Mehta et al. , 2000; Brettschneider et al.，2005),而血衆Αβ (1-38)/Αβ (1-40)比率降低被认为是血管性痴呆的生物标记，且有可能成为预测CSF标记(Bibl et al. , 2007)。
迄今为止，未考虑A β寡聚体作为阿尔茨海默病的生物标记，然而推测其在起动神经变性进程中起决定性作用(Walsh & Selkoe, 2007) 在一些研究中，示出8kDa的A β二聚体对于IOOkDa以上的初原纤维点(point of protofbrils)的神经毒性作用(Lambertet al.，1998; Walsh et al, 2002;Keayed et al. , 2004; Cleary et al.，2005)。此外，这种 Αβ 寡聚体在人体液中发现(Pitschke et al. , 1998; Santos et al. , 2007;Klyubin etal. , 2008) ο除了其神经毒性之外，寡聚体对确定人样品中Aβ浓度也有影响。寡聚体化导致Αβ肽的C末端表位被掩蔽(Roher et al.，2000)，导致通过C末端特异性ELISA检测到的Αβ水平被低估(Stenh et al.，2005)。因此，样品中Αβ寡聚体的存在导致ELISA信号降低。这对于精确确定Αβ浓度是一个问题，然而，这个事实也提供了测量生物学样品中寡聚体的量和寡聚体化水平的机会。本文展示的数据令人惊奇地证实Aβ寡聚体的含量可以通过在所述寡聚体解聚之前和之后测量ELISA信号而间接确定。这两个数值的比率反映出人血浆中可溶Αβ寡聚体的浓度与寡聚体化水平。与本发明无关，最近公布了一种相似的方法(Englund et al.，2009)。他们通过在非变性条件下通过ELISA及在变性条件下使用SDS-PAGE及随后的Western印迹分析测量A β 1-42浓度确定人CSF样品中Αβ 1-42寡聚体比率。然而，这种间接确定寡聚体水平的方法具有一些关键问题I. SDS-PAGE不能完全解聚A β 1_42。我们的经验也示出SDS凝胶上的反映A β三聚体和四聚体的条带。2.通过ELISA和通过Western印迹对比A β浓度是有缺陷的。另一种更常见的方法是直接测定Aβ寡聚体。然而，这种方法、特别是用寡聚体血浆Αβ作为生物标记，由于Αβ肽是极其疏水性的，因此这种方法非常难以建立。目前描述的测定系统使用在ELISA系统中A β寡聚体特异性抗体(Englund et al. , 2007; Schupfet al, 2008)。然而，基于这种寡聚体特异性抗体的ELISA的使用具有与传统的A β ELISA系统相同的问题。所述方法仅达到非常不令人满意的分析灵敏性，且遇到与分析物与基质即血浆之间非常复杂的相互作用的严重问题。通常，ELISA或ELISA-型系统(Multiplex)用于量化血浆中Αβ，及最近也用于量化Αβ寡聚体。这种检测系统的说明书通常仅被不令人满意地分析或者被完全忽视。例如，关键项目如回收速率未被分析或者在出版物中未提及。然而，回收速率是提供血浆中存在的这些Aβ肽或寡聚体的完整图像的决定性因素。研究之间的差异也可以得自这些速率中的差异。ELISA或多元系统的另一重要特征是其线性。因此，确定的血浆中分析物的浓度应仅非常低程度或者根本不依赖于测量中使用的稀释度。然而，这对于量化血浆中Αβ的ELISA是不可能的，对于多元系统也是不可能的。因此，计算的稀释1-20倍的血浆Αβ (1-42)浓度之间的差异比稀释1-2倍的相同样品高3倍(Hansson et al.，2008)。这个实例单独示出在一些研究中使用不同稀释度的血衆样品使得不可以进行对比。 因此，本发明的一个目的是提供可以高可靠性地确定、特别是血浆中的寡聚Αβ的新方法。本发明也使用Αβ寡聚体的间接测量法，然而与现有技术相反，使用Aβ特异性ELISA确定这两个值(在变性和非变性条件下)，以保证可对比性。由于分离单体及寡聚体形式的Αβ肽的最开始的免疫沉淀步骤，随后是我们的新解聚方法，因此随后的ELISA不受回收和/或线性问题的限制。此外，本发明目的在于提供诊断标记，其可用可靠方法确定并且可用于阿尔茨海默病的可靠及明确的预测。发明概述根据本发明的第一方面，提供了一种诊断或监测神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的方法，所述方法包括确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或A β )的寡聚状态，特征在于所述方法包括如下步骤(a)确定生物学样品中靶A β肽的第一浓度(Ca)；(b)解聚来自步骤(a)的靶Αβ肽；(c)确定解聚的A β肽的第二浓度(Cd);及(d)确定cd/ca比率,其中将第二浓度(Cd)的值除以第一浓度Ca的值；其中cd/ca比率低于I. 5是神经变性疾病的阳性诊断的指征。 根据本发明的第二方面，提供了一种确定生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Αβ)的寡聚状态的方法，所述方法包括如下步骤(a)确定生物学样品中靶A β肽的第一浓度(Ca)；(b)解聚来自步骤(a)的靶Αβ肽；(c)确定解聚的Αβ肽的第二浓度(Cd);及(d)确定cd/ca比率,其中将第二浓度(Cd)的值除以第一浓度Ca的值；其中cd/ca比率超过I是存在寡聚Aβ的指征。定义如本文所用，“寡聚”是指限定数目的聚集的Αβ肽单体单位。举例的这种寡聚体包括二聚体、三聚体和四聚体。术语“解聚”是指寡聚形式的Aβ肽转变为单体形式Αβ肽的过程。在本申请中“捕获抗体”是指涵盖结合靶Αβ肽的那些抗体。所述捕获抗体适当地以高亲和性结合所述靶Αβ肽。在本发明中，高亲和性是指亲和性的Kd值为10_7Μ或更好，如Kd值为10_8Μ或更好，甚至更特别地Kd值为10_9Μ至10_12Μ。术语“抗体”以其最广泛的含义使用，特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及呈现出希望的生物学活性的抗体片段。所述抗体可以例如是IgM、IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。然而适当地，所述抗体不是IgM抗体。所述“希望的生物学活性”是指结合靶Αβ肽。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。举例的抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段双抗体，单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本上均质抗体的抗体，即所述抗体群中包含的各个抗体除了可能以少量存在的可能天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的“多克隆抗体”制备物相反，每个单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体通常是有利的，因为其通过杂交瘤培养合成，不被其它免疫球蛋白污染。“单克隆”是指得自基本上均质抗体群的抗体的特征，且不需要通过任何特别方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由K5hleret al., Nature, 256:495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过通常熟知的重组DNA方法产生。“单克隆抗体”也可以分离自噬菌体抗体文库，使用如Clackson etal. , Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks etal. , J. Mol. Biol. , 222:581-597(1991)所述技术进行。本文的单克隆抗体特别包括嵌合抗体(免疫球蛋白)以及这种抗体的呈现希望的生物学活性的片段，其中嵌合抗体的重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab’、F (ab’)2或者抗体的其它抗原结合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体 的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有希望的特异性、亲和性和容量(capacity)的⑶R的残基置换。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体及在输入的CDR或构架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个及典型两个可变结构域，其中所有或者基本上所有CDR区相应于非人免疫球蛋白的那些区域及所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些区域。人源化抗体最佳还包含免疫球蛋白恒定区(Fe)的至少一部分，典型为人免疫球蛋白的。进一步的详细描述见 Jones et al.，Nature, 321:522-525 (1986)、Reichmann etal, Nature. 332:323-329(1988)及 Presta, Curr. Op. Struct. Biel. , 2:593-596 (1992)。人源化抗体包括Primatized 抗体，其中所述抗体的抗原结合区衍生自通过用感兴趣的抗原免疫恒河猴产生的抗体或者“骆驼源化(camelized) ”抗体。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链内。通常，Fv多肽进一步包含在Vh与'结构域之间的多肽接头，其使得sFv形成希望的结构以进行抗原结合。关于sFv的综述见Pluckthun in The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. ,Springer-Verlagj NewYork, pp. 269-315(1994)。术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含重链可变结构域(Vh)，其在同一多肽链中与轻链可变结构域(Vd)连接(Vh-Vd)。通过使用太短以至于不能使同一链上两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域与另一链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体在Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sol.USA, 90:6444-6448(1993)中更详细地描述。“分离的”抗体是已经从其天然环境成分中被鉴别及分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰所述抗体的诊断或治疗应用的材料，可包括酶、激素及其它蛋白质样或非蛋白质样溶质。在合适的实施方案中，所述抗体被纯化为(I)通过Lowry方法确定，大于抗体的95%重量，及更特别大于99%重量，(2)足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，通过使用旋转杯测序仪分析，或者(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下均质，使用考马斯蓝或者适当地银染色进行。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为不存在所述抗体的天然环境的至少一种成分。然而，通常分离的抗体是通过至少一个纯化步骤制备的。如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”及“细胞培养物”可互换使用，且这些命名均包括后代。因此，用语“转化体”和“转化细胞”包括最初的目标细胞及衍生自其的培养物，而无关乎转化次数。也应理解所有后代在DNA含量方面由于有意或无意的突变而可以不完全相同。包括在原始的转化细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在进行确切命名的情况中将更加清晰。如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，定义为是指由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。如本文所用，术语“一个”和“所述”被定义为是指“一或多个”，及还包括多个，除
非语境不当。 “淀粉样蛋白β、Αβ或β淀粉样蛋白”是本领域公认术语，指淀粉样β蛋白和肽，淀粉样β前体蛋白(APP)以及其修饰物、片段及任何功能等价物。特别地，如本文所用，淀粉样蛋白β是指通过APP的蛋白酶解产生的任何片段，但特别是参与或者与淀粉样病变相关的那些片段，包括但不限于SEQ ID NO. 3的Αβ (1-38)，SEQ ID NO. 2的Αβ (1-40)及SEQ ID NO. I 的 Αβ (1-42)。在本发明中，“淀粉样蛋白β的片段”是所有淀粉样β肽，包括SEQ IDN0. 13的核心淀粉样蛋白β片段Αβ. (3-38)，对于本发明更合适的是所有淀粉样β肽，其包含SEQID NO. 19的核心淀粉样蛋白β片段Αβ_(11-38)。这种Αβ·片段包含SEQ ID NO. 19的Αβ. (11-38)的氨基酸序列，特别是Ai3._(x_y)片段，其已经示出由于神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的结果而积聚在对象体内。其中X 定义为选自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 和 11 的整数，优选地，X是选自1、2、3和11的整数。更优选地，X是I。甚至更优选地，X是11。y定义为选自38、39、40、41、42和43的整数。优选地，丫是38、40或42，如40或42。更优选地，y是40.甚至更优选地，y是38。关于A β . (x-y)片段的合适实例是Αβ · (1-38) (SEQ ID NO. 3)Αβ · (1-39) (SEQ ID NO. 4)Αβ · (1-40) (SEQ ID NO. 2)Αβ . (1-41) (SEQ ID NO. 5)Αβ · (1-42) (SEQ ID NO. I)Αβ · (1-43) (SEQ ID NO. 6)A β · (2-38) (SEQ ID NO. 7)A β · (2-39) (SEQ ID NO. 8)
A β · (2-40) (SEQ ID NO. 9)Αβ . (2-41) (SEQ ID NO. 10)Αβ · (2-42) (SEQ ID NO. 11)Αβ · (2-43) (SEQ ID NO. 12)Αβ · (3-38) (SEQ ID NO. 13)Αβ · (3-39) (SEQ ID NO. 14)
Αβ . (3-40) (SEQ ID NO. 15)Αβ . (3-41) (SEQ ID NO. 16)Αβ · (3-42) (SEQ ID NO. 17)Αβ · (3-43) (SEQ ID NO. 18)Αβ·_(11_38) (SEQ ID NO. 19)Αβ · (11-39) (SEQ ID NO. 20)Αβ . (11-40) (SEQ ID NO. 21)Αβ · (11-41) (SEQ ID NO. 22)Αβ · (11-42) (SEQ ID NO. 23), RΑβ · (11-43) (SEQ ID NO. 24)。“功能等价物”涵盖Αβ. (x-y)的所有那些突变体或变体，其可以是在已经被选择进行本发明所述的检测方法或诊断方法的患者群中天然发生的。更特别地，在本文中“功能等价物”是指Αβ (x-y)的功能等价物是其突变体或变体且已经示出积聚在阿尔茨海默病中。所述功能等价物与各自的Αβ . (x-y)肽相比具有不超过30个,如20个、例如10个、特别是5个及更特别是2个或仅I个突变。功能等价物还涵盖突变的变体，其包含例如以氨基酸Asp-Ala-Glu开始及分别以Gly-Val-Val和Val-Ile Ala结束的所有Αβ·肽。在本发明中特别有用的等价物是Αβ . (1-40) (SEQ ID NO. 2)和Αβ · (1-42) (SEQID NO. I)的那些等价物，其是由Irie et al.，2005描述的那些，即A β .的Tottori、Flemish、Dutch、Italian、Arctic和Iowa突变。功能等价物还包含衍生自淀粉样蛋白前体蛋白的Αβ肽，其携带紧邻β.._或Y -分泌酶裂解位点的突变,如Swedish、Austrian、French、German、Florida、London、Indiana 和 Australian 改变(Irie et al.，2005)。“修饰的淀粉样蛋白β、Αβ或者β淀粉样蛋白”涵盖在的淀粉样β蛋白质和肽、淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)、其片段和功能等价物中各个氨基酸位置的所有修饰。可用于本发明中的是在所述淀粉样β蛋白和肽、淀粉样β前体蛋白(APP)、片段和功能等价物的N和/或C末端氨基酸的修饰。特别有用的是在谷氨酰胺和谷氨酸残基的修饰，如N末端谷氨酰胺或谷氨酸残基环化为焦谷氨酸。本发明适当的实例是SEQ ID No. 13-24的淀粉样β肽，其在N末端以谷氨酸残基开始，其中所述N末端谷氨酸残基被修饰为焦谷氨酸。更有用的是在天冬氨酸残基的修饰，如天冬氨酸转变为异天冬氨酸。本发明适当的实例是SEQID No. 1-6的淀粉样β肽，其中在氨基酸位置I和/或7的天冬氨酸残基转变为异天冬氨酸。进一步适当的实例是SEQID No. 7-12的淀粉样β肽，其中在氨基酸位置6的天冬氨酸残基转变为异天冬氨酸。此外，适当的实例是SEQ ID No. 13-18的淀粉样β肽，其中在氨基酸位置5的天冬氨酸残基转变为异天冬氨酸。“夹心ELISA”通常包括使用两种抗体，每种抗体均能结合被检测的蛋白质的不同的免疫原性部分或者表位。在夹心测定中，检测样品分析物由固定在固体支持物上的第一抗体结合，之后第二抗体结合该分析物，因此形成不溶的三部分复合物。第二抗体自身可用可检测部分标记(直接夹心测定)或者可以使用用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，一种合适类型的夹心测定是ELISA测定，其中所述可检测部分是酶。附图
简述图I :二价免疫沉淀系统改善捕获效率(A)通过使用不同抗体组合从Cyp18溶液和人血浆回收A β I-40。(B) 二价捕获系统示意图(阴影4G8抗体；灰色x_40抗体；黑色与磁珠缀合的 抗小鼠抗体)。图2 :确定衍生自人血浆的A β肽的寡聚状态在解聚之后确定的浓度与未解聚确定的浓度的比率反映Αβ (1-40/42)的寡聚状态。图3 DemTect 测试通过DemTect评分获得的在AD患者和健康对象中分类差异结果的平均值(平均值土SD) (I 组18 - 30 岁，II 组31-45 岁；111 组:46-65 岁)。图4 :简易精神状态测试(Mini-Mental-State Test)通过简易精神状态测试获得的在AD患者和健康对象中分类差异结果的平均值(平均值土SD) (I 组18 - 30 岁，II 组31-45 岁；111 组:46-65 岁)。图5 :画钟测试(Clock-Drawing Test)通过画钟测试获得的在AD患者和健康对象中分类差异结果的平均值(平均值土SD) (I 组18 - 30 岁，II 组31-45 岁；111 组:46-65 岁)。图6 :寡聚状态的平均值，AD组对比对照组的T-检验。**Τ_ 检验，p〈0. 01检验，ρ〈0· 001图7 :反映血浆中总体寡聚量的A β (1-40)+A β (1-42)的寡聚状态。发明详述根据本发明的第一个方面，提供了一种诊断或监测神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的方法，所述方法包括确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或A β )的寡聚状态，其特征在于所述方法包括如下步骤(a)确定生物学样品中靶Αβ肽的第一浓度(Ca)；(b)解聚来自步骤(a)的靶Αβ肽；(c)确定解聚的Αβ肽的第二浓度(Cd);及(d)确定cd/ca比率,其中将第二浓度(Cd)的值除以第一浓度Ca的值；其中cd/ca比率低于I. 5是神经变性疾病的阳性诊断结果的指征。本文呈现的数据令人惊奇地证实当与对照患者相比时在阿尔茨海默病患者中Αβ的寡聚状态显著降低。因此，Αβ的寡聚状态看起来可以可靠及明确的预测阿尔茨海默病。(cd/ca)的比率为I. O提示在样品中无寡聚体。较高比率的cd/ca(即比率>1.0)反映出样品中存在较多量的寡聚体或者更紧密的寡聚体(表位可及性较低)。已经发现cd/ca的比率低于I. 5 (即比率在I. 0-1. 5之间)，如低于I. 4、低于I. 3、低于I. 2、低于I. I或者低于I.05是神经变性疾病如阿尔茨海默病的阳性诊断结果的指征。在本发明的另一实施方案中，提供了诊断或监测神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的方法，所述方法包括确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样Αβ肽(Abeta或A β )的寡聚状态，其特征在于所述方法包括如下步骤(a)确定生物学样品中靶Αβ肽的第一浓度(Ca)；(b)解聚来自步骤(a)的靶A β肽；(c)确定解聚的Αβ肽的第二浓度(Cd);及(d)将Cd和Ca的值相加，其中Cd与Ca的和低于3. O是神经变性疾病的阳性诊断结果的指征。
已经发现Cd与Ca的和低于2. 9、低于2. 8、低于2. 7、低于2. 6、低于2. 5、低于2. 4或者低于2. 3是神经变性疾病如阿尔茨海默病的阳性诊断结果的指征。在几乎所有研究中，通过由捕获抗体和检测抗体组成的夹心ELISA系统确定步骤
(a)和(c)中靶Αβ肽的浓度。与抗体(150kDa)的大小相比，Αβ肽(4.5kDa)作为单体是非常小的。由于肽的聚集倾向，它们趋于形成寡聚体，初原纤维形成原纤维点。在这种聚集物内，Αβ单体紧密填充，结果是由于位阻或表位不可及性而导致不是所有单体均可以由检测抗体结合。检测的寡聚体A β浓度低于单体的。这将导致在血浆和CSF中低估的A β水平。测量的浓度与真实的浓度之间的矛盾取决于寡聚体的量及其密集性。相反，Αβ聚集物的量或者更精确地负荷表位(burden epitopes)的量可以通过对比在存在寡聚体条件下检测的浓度与在寡聚体完全解聚为单体之后的浓度而确定。该方法的原理在图2中示出。在一个实施方案中，解聚步骤(b)包括使用碱。在另一个实施方案中，用于步骤
(b)中解聚的碱是氢氧化钠，如500mM氢氧化钠。使用碱及特别是强碱如氢氧化钠的优势是实现更有效的解聚。例如，获得较高比率的单体，无可观测数量的二聚体、三聚体或者四聚体。在一个实施方案中,解聚步骤(b)另外包括使用合适的溶剂,如甲醇,例如50%(v/V)甲醇。在一个实施方案中，解聚步骤(b)包括保温步骤。在另一个实施方案中，保温步骤包括在室温保温至少2分钟。在另一个实施方案中，所述保温步骤包括在室温保温至少10分钟。在通过β-和Y-分泌酶相继裂解之后，Αβ肽从淀粉样蛋白前体蛋白(APP)中释出。Y分泌酶裂解导致主要的Αβ (1-40)和Αβ (1-42)肽产生，但是显然在位置38或43结束，其在C末端不同，且呈现出不同的聚集、原纤维形成及神经毒性等效力。同样，β-分泌酶释放可产生不同的N末端及随后由肽酶及其它酶修饰，获得主要种类，如在如2、3、4和11位置开始的Aβ肽，而在谷氨酸3和11位置开始的种类可以被转化为焦谷氨酸，使得这些肽是特别疏水性的并且具有快速聚集的倾向(Schilling et al, 2004;Piccini etal. , 2005; Schilling et al, 2006; Schlenzig et al, 2009) A β 的这种 C-和 N-末端变体可作为Αβ (1-40)和Αβ (1-42)肽的功能等价物。本发明因此提供了确定Αβ (x-y)肽的寡聚状态的方法，其中x和y如上文定义。因此，根据上述方法的一个实施方案，被确定的靶A β肽的寡聚状态选自如下组中
Αβ · (1-38) (SEQ ID NO. 3)，Αβ · (1-39) (SEQ ID NO. 4)，Αβ · (1-40) (SEQ ID NO. 2)，Αβ . (1-41) (SEQ ID NO. 5)，Αβ · (1-42) (SEQ ID NO. I)，Αβ · (1-43) (SEQ ID NO. 6)，Αβ · (2-38) (SEQ ID NO. 7)，Αβ · (2-39) (SEQ ID NO. 8)，Αβ · (2-40) (SEQ ID NO. 9)，Αβ · (2-41) (SEQ ID NO. 10)，Αβ · (2-42) (SEQ ID NO. 11)，Αβ · (2-43) (SEQ ID NO. 12)，Αβ · (3-38) (SEQ ID NO. 13)，Αβ · (3-39) (SEQ ID NO. 14)，Αβ · (3-40) (SEQ ID NO. 15)，Αβ · (3-41) (SEQ ID NO. 16)，Αβ · (3-42) (SEQ ID NO. 17)，Αβ · (3-43) (SEQ ID NO. 18)，
Αβ_11_38) (SEQ ID NO. 19)，Αβ · (11-39) (SEQ ID NO. 20)，Αβ · (11-40) (SEQ ID NO. 21)，Αβ · (11-41) (SEQ ID NO. 22)，Αβ· (11-42) (SEQ ID NO. 23),RΑβ · (11-43) (SEQ ID NO. 24)。在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Αβ肽的寡聚状态是Αβ (1-40) (SEQ IDNo:2)。在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Αβ肽的寡聚状态是Αβ (1-42) (SEQ IDNo:1)ο在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Αβ肽的寡聚状态是Αβ (1-40) (SEQ IDNo :2)和Αβ (1-42) (SEQ ID No: I)。本文呈现的数据证实A β (1-40)与Αβ (1-42)肽总和的适合性，其中已经示出这两种寡聚状态的总和改善诊断的显著性。在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Αβ肽的寡聚状态是选自SEQ IDNO :13-24的至少一种Αβ肽，其以在N末端的谷氨酸残基起始。在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Αβ肽的寡聚状态是Αβ (3-38) (SEQ IDNo:13)。在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Αβ肽的寡聚状态是Αβ (11-38) (SEQ IDNo:19)。在另一个特殊的实施方案中，被检测的靶Αβ肽的寡聚状态是选自SEQIDNO: 13-24的至少一种A β肽，其中在这些肽N末端的谷氨酸残基被环化为焦谷氨酸。
在另一个特殊的实施方案中，被检测的靶Αβ肽的寡聚状态是选自SEQID No. 1-6的至少一种Aβ肽，其中在氨基酸位置I和/或7的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。更特别地，被检测的靶A β肽的寡聚状态是选自SEQ ID No. 7-12的至少一种A β肽，其中在氨基酸位置6的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。更特别地，被检测的靶A β肽的寡聚状态是选自SEQ ID No. 13-18的至少一种A β肽，其中在氨基酸位置5的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。应意识到确定Αβ的寡聚状态的方法构成了本发明的另一方面，其涉及新的及有创造性的测定，其非必需限于诊断神经变性疾病如阿尔茨海默病。因此，根据本发明的第二个方面，提供了一种确定生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Αβ)的寡聚状态的方法，所述方法包括如下步骤(a)确定生物学样品中靶Αβ肽的第一浓度(Ca)； (b)解聚来自步骤(a)的靶Αβ肽；(c)确定解聚的Αβ肽的第二浓度(Cd);及(d)确定cd/ca比率,其中将第二浓度(Cd)的值除以第一浓度Ca的值；其中cd/ca比率超过I是存在寡聚Aβ的指征。在一个实施方案中，解聚步骤(b)包括使用如前文定义的碱。在一个实施方案中，在步骤(a)和(C)中确定靶Αβ肽的第一浓度和第二浓度的方法包括i)将生物学样品与至少两种捕获抗体接触，ii)检测所得免疫复合物，iii)破坏所述免疫复合物，及iv)量化捕获的Αβ肽。在一个实施方案中，量化步骤(iv)包括在Αβ特异性ELISA中分析。在另一个实施方案中，所述A β特异性ELISA是夹心-ELISA。在一个实施方案中，步骤(a)和(c)均包含用Αβ特异性ELISA分析。这个实施方案提供了使得可以对比在步骤(a)和(c)中获得的第一浓度和第二浓度的优势。在一个实施方案中，生物学样品选自血液、血清、尿液、脑脊液(CSF)、血浆、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑膜液、泪液、胆汁和胰腺分泌物。在另一个实施方案中，生物学样品是血浆。生物学样品可以本领域技术人员熟知的方式得自患者。特别地，血液样品可得自对象，且血液样品可通过常规方法分离成血清和血浆。从中获得生物学样品的对象怀疑患有阿尔茨海默病，处于发生阿尔茨海默病的风险中和/或处于其它类型痴呆风险中或具有其它类型痴呆。特别地，所述对象是怀疑患有轻度认知损害(MCI)和/或处于早期阿尔茨海默病的对象。本发明的方法具有优于本领域已知方法的几个优势，即本发明的方法可用于检测阿尔茨海默病早期阶段以及在疾病发生和进展的早期区分阿尔茨海默病与其它类型痴呆。一种可能的早期阶段是轻度认知损害(MCI)。使用本领域目前已知的方法还不能明确及可靠地诊断早期阿尔茨海默病，及特别不能在所述早期阶段区分阿尔茨海默病的发生与其它形式痴呆。这种方法特别用于患有MCI的患者。相反，本发明提供的方法适于区分性诊断阿尔茨海默病。特别地，本发明提供了一种方法，其中可以在得自任何上述对象的生物学样品中以高度可再现形式检测靶A β肽的寡聚状态。本发明方法的高度可再现性通过在最初的免疫沉淀步骤(步骤(a))中使用至少两种不同的捕获抗体实现，所述免疫沉淀步骤与在随后步骤(C)中使用的方法相同。在一个实施方案中，有至少两种不同的捕获抗体针对靶Αβ肽的不同表位。在一个实施方案中，生物学样品是血浆。上述“靶A β肽”涵盖如前文定义的A β (x-y) 0本发明必须克服的一个特殊问题是使用的生物标记在阿尔茨海默病早期阶段中例如在轻度认知损害期间是被改变的。本发明人已经示出可以可靠方式确定靶Αβ肽的寡聚状态，且也首次更明确地指出事实上Αβ (x-y)的寡聚状态特别适于诊断早期发作的阿尔茨海默病。在步骤(a)和(C)中确定靶A β肽的第一浓度和第二浓度的方法特别包括如下步骤i)在免疫沉淀步骤中将生物学样品与至少两种不同的捕获抗体接触。在将生物学样品与前述至少两种不同的捕获抗体接触之后，在所述至少两种不同的捕获抗体与靶A β肽之间形成免疫复合物。这个步骤不特异性分离全长A β (x-y)，其中X是I，而是捕获和分离所有A β种类，特别是在38、40和/或42位置结束的。ii)然后通过二抗检测这个复合物。适当地，将所述二抗固定在磁珠上。使用磁性分离器，可容易地将所述免疫复合物与磁珠一起与体液(血浆/血清、CSF等)分离。 iii)将所述免疫复合物从所述珠中洗脱。适当地，洗脱步骤通过将携带所述免疫复合物的珠在包含50%甲醇/O. 5%甲酸的溶液中在室温保温I小时。从而所有分子间相互作用被破坏，分离自生物学样品的所有A β肽分子从溶液中的珠中释出。iv)将释出的分离的Αβ肽在随后的步骤中量化，例如通过夹心ELISA量化，其特异性检测全长(x_y)，其中这个步骤中全长Αβ (x-y)最适当地是指Αβ (1-40)和Αβ (1-42)。适用于本发明中的进行免疫沉淀的可能抗体是如下抗体，但是本发明不限于这些特别的实例3D6,表位1-5 (Elan Pharmaceuticals, Innogenetics)pAb_EL16,表位1-72H4,表位1-8 (Covance)IElI,表位1-8 (Covance)20. I,表位1-10 (Covance, Santa Cruz Biotechnology)兔抗_Αβ多克隆抗体，表位1-14(Abeam)AB10,表位:1-16 (Chemicon/Upstate-part of Millipore)82E1，表位1-16 (IBL)pAb 1-42，表位:1-11NAB228,表位1-11 (Covance, Sigma-Aldrich, Cell Signaling, Santa CruzBiotechnology, Zymed/Invitrogen)
DE2，表位1-16 (Chemicon/Upstate-part of Millipore)DE2B4，表位1-17 (Novus Biologicals，Abcam，Accurate，AbD Serotec)6E10，表位:1-17 (Signet Covance, Sigma-Aldrich)10D5，表位3-7 (Elan Pharmaceuticals)W0-2，表位4-10 (The Genetics Company)1A3，表位 5-9 (Abbiotec)pAb-EL21，表位 5-11
310-03，表位 5-16 (Abcam，Santa Cruz Biotechnology)鸡抗-人Αβ多克隆抗体，表位12-28 (Abcam)鸡抗-人Αβ多克隆抗体，表位25-35 (Abcam)兔抗-人Αβ多克隆抗体，表位N_terminal (ABR)兔抗-人Αβ多克隆抗体(Anaspec)12C3，表位 10-16 (Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)16C9，表位 10-16 (Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)19B8，表位 9-10 (Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)pAb-EL26，表位11-26BAM90. 1，表位13-28 (Sigma-Aldrich)兔抗-β_淀粉样蛋白(pan)多克隆抗体，表位15_30(MBL)22D12，表位:18-21 (Santa Cruz Biotechnology)266，表位16-24(Elan Pharmaceuticals)pAb-EL17;表位15-244G8，表位17-24 (Covance)兔抗-Αβ多克隆抗体，表位22-35 (Abcam)G2-10，表位31-40 (The Genetics Company)兔抗-A0，aa32-40 多克隆抗体(GenScript Corporation)EP 1876Y，表位x_40 (Novus Biologicals)G2-11，表位33-42 (The Genetics Company)16C11，表位33-42 (Santa Cruz Biotechnology)21F12，表位34-42 (Elan Pharmaceuticals，Innogenetics)1A10，表位35-40 (IBL)D-17 山羊抗-Αβ 抗体，表位C_ 末端(Santa Cruz Biotechnology)对于免疫沉淀特别的抗体是:3D6(Elan)、BAN50 (Takeda)、82E1 (IBL)、6E10 (Covance)、W0-2 (The Genetics Company)、266 (Elan)、BAM90. I (Sigma)、4G8 (Covance)、G2-10 (The Genetics Company)、1A10 (IBL)、BA27 (Takeda)、11A5-B10(Mi 11ipore)Λ12F4(Millipore)、21F12(Elan)。举例的A β N3pE特异性抗体是-Pyro-Glu Abeta 抗体 A β 5-5-6 (保藏号 DSM ACC 2923)，A β 6+6 (保藏号 DSMACC 2924)，Αβ 17-4-3 (保藏号 DSM ACC 2925)及 Aβ 24-2-3 (保藏号 DSM ACC 2926)，这些抗体在 PCT/EP2009/058803 (单克隆，小鼠)，Probiodrug AG 中描述；
-Pyro-Glu Abeta 抗体克隆 2-48 (单克隆，小鼠)；Synaptic Systems-Pyro-Glu Abeta 抗体(多克隆，兔)；Synaptic Systems-Pyro-Glu Abeta 抗体克隆 8E1 (单克隆，小鼠)；Anawa-Pyro-Glu Abeta 抗体克隆 8E1 (单克隆，小鼠)；Biotrend-抗-人淀粉样蛋白β(Ν3ρΕ)兔IgG(多克隆，兔)；IBL-抗-人ΑβΝ3ρΕ(8Ε1)小鼠 IgG Fab (单克隆，小鼠)；IBL举例的A β isoAsp I特异性抗体是
·
-抗-人APisoAsp I 抗体(多克隆，兔)；在 Saido TC, et al. , Neurosci Lett.(1996) 13; 215 (3) : 173-6 中揭示。特别用于免疫沉淀的抗体对是4G8 与 11A5-B10，3D6 与 4G8，6E10 与 4G8，82E1 与 4G8，4G8 与 12F4，4G8 与 21F12,3D6 与 21F12，6E10 与 21F12，BAN50 与 4G8，3D6 与 11A5_B10，3D6 与 1A10，3D6 与 BA27，6E10与 11A5-B10，6E10 与 1A10，6E10 与 BA27，4G8 与 11A5-B10，4G8 与 1A10，4G8 与 BA27，4G8 与12F4，4G8 与 21F12。举例的A β Ν3ρΕ特异性抗体是-Pyro-Glu Abeta 抗体 A β 5-5-6 (保藏号 DSM ACC 2923)，A β 6+6 (保藏号 DSMACC 2924) ,Αβ 17-4-3 (保藏号 DSM ACC 2925)及 Aβ 24-2-3 (保藏号 DSM ACC 2926)，这些抗体在 PCT/EP2009/058803(单克隆，小鼠)，Probiodrug AG 中描述；-Pyro-Glu Abeta 抗体克隆 2-48 (单克隆，小鼠)；Synaptic Systems-Pyro-Glu Abeta 抗体(多克隆，兔)；Synaptic Systems-Pyro-Glu Abeta 抗体克隆 8E1 (单克隆，小鼠)；Anawa-Pyro-Glu Abeta 抗体克隆 8E1 (单克隆，小鼠)；Biotrend-抗-人淀粉样蛋白β(Ν3ρΕ)兔IgG(多克隆，兔)；IBL-抗-人ΑβΝ3ρΕ(8Ε1)小鼠 IgG Fab (单克隆，小鼠);IBL。举例的Αβ isoAsp I特异性抗体是-抗-人APisoAsp I 抗体(多克隆，兔)；Saido et al.，1996)。除了上述抗体之外，适于进行免疫沉淀的所有其它淀粉样蛋白β特异性抗体(单克隆及多克隆)均可用于浓度确定方法中(其它合适的抗体可例如来自WWW. alzforum.org)。良好捕获效率的决定因素是使用具有不同表位的两、三或多种不同抗体。使用一种以上的抗体类型进行Αβ肽的免疫沉淀提供了协同及令人惊奇的协同结合作用(亲和力)，最终可以实现极高的捕获效率(见图I)。步骤ii)中的二抗特异性抗宿主捕获抗体的抗体类型。合适的二抗是抗小鼠抗体和抗兔抗体。在步骤iii)中将所述复合物与磁珠保温之后，用洗涤缓冲液洗涤该珠(见本发明实施例)。含有洗涤剂或者防止非特异性结合的其它添加剂的洗涤缓冲液可用于这个步骤。非限制性的洗涤缓冲液的实例是-含有10mg/ml 亲环蛋白 18 (Cyp 18)和 O. 05%Tween-20 的 D-PBS，-PBS+0. 05%Tween-20,-TBS+0. 05%Tween-20,
-PBS+1%(w/v)BSA+0. 05%Tween_20，-TBS+1% (w/v) BSA+0. 05%Tween_20，以及-Pierce ELISA Blocker (with Tween-20) 在步骤iv)中将所述免疫复合物与所述珠洗脱之后，将溶液在稀释缓冲液中稀释。任何可以防止与表面以及固定化的第一 ELISA抗体非特异性相互作用的稀释缓冲液均可用于这个步骤。非限制性的稀释缓冲液的实例是-EIA缓冲液(IBL 1-40 (N) ELISA试剂盒的稀释缓冲液)，-PBS+1%(w/v)BSA+0. 05%Tween_20，-TBS+1%(w/v)BSA+0. 05%Tween_20，及-Pierce ELISA Blocker (及 Tween-20)。能定量全长Αβ (1-40)的ELISA-试剂盒可商购。在本发明方法中用于定量Αβ (1-40)的合适的ELISA试剂盒是例如淀粉样蛋白β (1-40) (N)ELISA(IBL, JP27714)；Αβ [1-40]人 ELISA 试剂盒(Invitrogen);人淀粉样蛋白 β (Amyloid-β ), aa 1-40ELISA试剂盒(Wako Chemicals USA, Inc.);淀粉样蛋白 β 1-40ELISA 试剂盒(The GeneticsCompany)。能定量全长Αβ (1-42)的ELISA-试剂盒也可商购。在本发明方法中用于定量Αβ (1-42)的合适的ELISA-试剂盒是例如淀粉样蛋白β (1-42) (N) ELISA (IBL, JP27712)；Αβ [1-42]人 ELISA 试剂盒(Invitrogen),人淀粉样蛋白 β (Amyloid-β ), aa 1-42ELISA试剂盒(Wako Chemicals USA, Inc.),淀粉样蛋白 β 1-40ELISA 试剂盒(The GeneticsCompany)，INNOTEST β -AMYLOID (1-42) (Innogenetics)。所述浓度确定方法不限于举例的前述可商购的Aβ (1-40)或Αβ (1-42)的ELISA试剂盒。全长Αβ (1-40)或Αβ (1-42)的许多其它夹心ELISA可以在现有技术领域中获得或者可以由技术人员开发。所有这些全长Αβ 1-40或Αβ 1-42夹心ELISA应也包含在所述浓度确定方法中，并且应典型包含一对合适的捕获抗体和检测抗体，其分别特异于Αβ (1-40)和/或Αβ (1-42)的完整N末端及在氨基酸位置40或42结束的C末端。这种全长Aβ (1-40)夹心ELISA可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ (1-40)的C末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别A β (1-40)的完整N末端。全长Αβ (1-42)夹心ELISA可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ (1-42)的C末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别A β (1-42)的完整N末端。全长Αβ (1-40)夹心ELISA也可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ (1-40)的完整N末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别A β (1-40)的C末端。全长Αβ (1-42)夹心ELISA也可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ (1-42)的完整N末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别A β (1-42)的C末端。用于所述浓度确定方法中的合适的A β (1-40/42) N-末端特异性抗体例如是 3D6 (Elan)、W0-2 (The Genetics Company)、82E1 (IBL)、BAN-50 (Takeda)。许多其它A β (1-40/42) N-末端特异性抗体在现有技术领域中可获得或者可以由技术人员开发。所有这些A β (1-40/42) N-末端特异性抗体也预期用于浓度确定方法中。 合适的Αβ (1-40)C_ 末端特异性抗体例如是 G2_10(The Genetics Company)、11A5-B10 (Mi 11 ipore)、1A10(IBL)、BA27 (Takeda)、EP1876Y (Novus Biologicals)。许多其它Αβ (1-40)C-末端特异性抗体可以在现有技术领域中获得或者由技术人员开发。所有这些A β (1-40) C-末端特异性抗体也预期用于浓度确定方法中。合适的Αβ (1-42)C_ 末端特异性抗体例如是 G2-11 (The Genetics Company)、12F4 (Millipore),抗人 Αβ (38-42)兔 IgG(IBL)、21F12 (Elan)、BC05 (Takeda)、16C11 (Santa Cruz Biotechnology)。许多其它A β (1_42) C-末端特异性抗体可以在现有技术领域中获得或者由技术人员开发。所有这些Αβ (1-42)C-末端特异性抗体也预期用于浓度确定方法中。根据一个实施方案，所述检测抗体是标记的。 对于诊断性应用，检测抗体典型地由可检测部分标记。可利用许多标记，其通常可被分为如下类别(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和131L所述抗体可以用所述放射性同位素标记，使用如在 Current Protocols in Immunology, Volumes land 2, Giitigen etal. , Ed. , ffiley-Interscience. New York, New York. Pubs. , (1991)中所述技术进行，放射性可以通过使用闪烁计数法测量。(b)荧光标记，如可利用稀土元素螯合物(铕螯合物)或者荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，Lissamine,藻红蛋白和Texas Red。所述突光标记可以与抗体缀合，使用如在如前述Current Protocols in Immunology中所述技术进行。突光可以通过使用荧光计量化。(C)可利用各种酶-底物标记。所述酶通常催化生色底物的化学改变，可以使用各种技术测量。例如，酶可以催化底物颜色改变，这可以通过分光光度法测量。或者，酶可以改变底物的荧光或者化学发光。量化荧光改变的技术在上文描述。化学发光底物通过化学反应变为电激发状态，然后可以发射可测量的光(例如使用化学发光测量仪)或者将能量供给荧光受体。举例的酶标记包括萤光素酶(如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4，737，456)，萤光素，2，3- 二氢酞嗪二酮，苹果酸脱氢酶，脲酶，过氧化物酶，如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，O-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。使酶与抗体缀合的技术在O’ Sullivan etal. , Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay,in Methods in Enzym. (ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, NewYork, 73:147-166(1981)中描述。举例的酶-底物组合包括例如(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与过氧化氢酶作为底物，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或者3，3’，5，5’ -四甲基盐酸联苯胺(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)与对硝基苯基磷酸酯(para-Nitrophenyl phosphate)作为生色底物；以及(iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)与生色底物(例如对硝基苯基_β _D_半乳糖苷酶)或者生荧光底物4-甲基伞形基-β -D-半乳糖苷酶。本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。(d)检测抗体的另一可能的标记是短核苷酸序列。然后通过RT-PCR系统确定浓度(Imperacer , Chimera Biotech)。有时所述标记与抗体间接缀合。技术人员已知实现这个目的的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合，及上述任何三种广义类别的标记可以与抗生素蛋白缀合，或者反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，因此所述标记可以这种间接方式与抗体缀合。或者，为了实现标记与抗体的间接缀合，将抗体与小的半抗原(如地高辛)缀合，及将上述不同类型的标记之一与抗-半抗原抗体(如抗-地高辛抗体)缀合。因此，可以实现标记与抗体的间接缀合。用于本发明中的抗体可用于任何已知测定方法中，如竞争性结合测定，直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola, Monoclonal Antibodies A Manual ofTechniques, pp. 147-158(CRC Press.Inc. , 1987)。
竞争性结合测定依赖于标记的标准物与检测样品分析物竞争结合限量抗体的能力。检测样品中Αβ肽的量与结合抗体的标准物的量成反比。为了便于确定结合的标准物的量，通常抗体在竞争之前或之后是不溶的，以便与所述抗体结合的标准物和分析物可方便地与保持未结合的标准物和分析物分离。对于在人体内分析Αβ (1-40)浓度，所有如下体液均可以使用血液、脑脊液(CSF)、尿液、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑膜液、水相液体、泪液、胆汁以及胰腺分泌物。所述新方法由本发明人使用血液样品确立(见本发明实施例)。然而本发明的方法不限于血液样品。所述方法也可以相同方式使用CSF、脑提取物和尿液样品，以及其它人体体液，如上述体液。特别的样品包括血浆样品。对于免疫组织化学分析，组织样品可以是新鲜或者冷冻的或者可以包埋于石蜡中及用防腐剂如福尔马林固定。可以意识到尽管夹心ELISA系统包含本发明步骤(a)和(C)中确定Αβ浓度的一个特殊实施方案，但是可以使用其它浓度确定方法。确定A β浓度的其它合适方法是I.淀粉样蛋白 β 1-40 HTRF*8测定(CisBio Bioassays):这个测定原理基于TR-FRET，其是时间分辨荧光免疫分析与FOrster共振能量转移的组合。与通常夹心ELISA相似，Αβ (1-40)由两种抗体结合；然而所述抗体在此不结合表面，在溶液中发生相互作用。这两种抗体均用荧光团标记。当这两种荧光团通过生物分子相互作用聚在一起时，在激发期间由供体荧光团捕获的一部分能量通过FRET转移至受体荧光团，结果其被激发。测量受体荧光团的荧光。测量信号与FRET的量相关，因此确定溶液中Αβ (1-40)的量。相似地，基于相当原理，可以使用Lilly的Alphascreen 测定。2.多元测定系统多元测定系统可得自一些厂商，且为本领域技术人员熟知及广泛使用。用于本发明方法中的合适实例是INNO-BIA血衆Αβ形式测定(Innogenetics)。这个测定是非常标准化的多参数基于珠的免疫测定，同时量化血浆中人β_淀粉样肽形式Αβ (1-42)和Αβ (1-40)或者 Αβ (Χ-42)和 Αβ (Χ-40)，使用χΜΑΡ 技术进行(xMAP 是 Luminex Corp.的注册商标)。这个测定能同时量化直至100个不同分析物。这种方法的基础是小球形聚苯乙烯颗粒，称作微球或珠。与ELISA和Western印迹相似，这些珠作为生物化学检测的固相。这些珠以颜色编码，由此可以区分100个不同类别的珠。每个类别的珠具有一个特异性抗体(例如抗Αβ (1-40))固定在微球体表面上。如果Αβ (1-40)浓度增加，则更多的肽分子将由这个类别的珠结合。检测分析物的结合通过二抗抗-Aβ (1-40)抗体进行，其用另一种荧光染料标记，发射绿光。类似于FACS分析处理样品。通过流体力聚焦使微球单一化(singularized)，并通过基于激光的检测系统分析，这样可以基于绿色荧光进行量化及通过珠的特殊颜色鉴别结合的分析物。因此，可以在一个样品中确定多个分析物的浓度。3.通过质谱分析进行暈化-对于量化Αβ(1-40),也可使用SELDI-T0F质谱分析术(Simonsen etal.，2007(2))。、
-使用免疫沉淀与MALDI-T0F质谱分析术量化分析Aβ肽。15N标记的标准A β肽用于校准(Gelfanova et al.，2007)。4. Western 印迹分析2D-凝胶电泳结合Western印迹分析可以是量化Αβ肽的合适方法(Sergeant etal.,2003;Casas et al.，2004)。诊断试剂盒为方便起见，本发明方法中使用的抗体可以在试剂盒中提供，即包装的预定量的试剂组合，附带进行诊断测定的说明书。因此，根据本发明的另一方面，提供了诊断神经变性疾病如阿尔茨海默病的试剂盒，所述试剂盒包含合适的碱及根据本发明所述方法使用该试剂盒的说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒另外包含如本文定义的至少两种不同的捕获抗体。在抗体用酶标记的情况中，所述试剂盒还包括所述酶需要的底物和辅因子(例如底物前体，其提供可检测的生色团或荧光团)。此外，可以包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或者裂解缓冲液)等等。各种试剂的相对量可以大大不同，以提供基本上最佳化测定灵敏性的试剂溶液浓度。特别地，所述试剂可以干粉形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，当其溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液。本发明的诊断试剂盒特别用于检测和诊断神经变性疾病，如淀粉样蛋白相关疾病和病症，例如阿尔茨海默病。应用本发明的方法首次可以以可靠方式检测和量化寡聚的靶Αβ肽，特别是Αβ (1-40) ,Aβ (1-42) ,Aβ (3-38)和/或Αβ (11-38)或者其功能等价物。特别地，本发明提供了寡聚Aβ (1-40) ,Aβ (1-42) ,Aβ (3-38)和/或Αβ (11-38)作为血浆生物标记，其适用于区分性诊断阿尔茨海默病，特别是在疾病的早期阶段。因此，在一个实施方案中，本发明涉及使用确定淀粉样β肽的寡聚状态的方法诊断阿尔茨海默病，如区分性诊断阿尔茨海默病，特别是在疾病的早期阶段。适当地，阿尔茨海默病的早期阶段是轻度认知损害。在另一个实施方案中，本发明涉及使用寡聚靶Αβ肽诊断阿尔茨海默病，如区分性诊断阿尔茨海默病，特别是在疾病的早期阶段。适当地，阿尔茨海默病的早期阶段是轻度认知损害。特别地，使用本发明的方法检测和量化寡聚靶Αβ肽，其用于诊断阿尔茨海默病。在另一个实施方案中，所述靶Αβ肽是如前文定义的Αβ (x-y)或者其功能等价物。本发明的方法还具有工业实用性以监测对于神经变性疾病如阿尔茨海默病给予的治疗的效力。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种监测在对象中的治疗效力的方法，所述对象患有、怀疑患有或者倾向于患有神经变性疾病如阿尔茨海默病，所述方法包括确定取自检测对象的生物学样品中如本文定义的靶淀粉样β肽(Abeta或Αβ)的寡聚状态。在一个实施方案中，生物学样品在两或多个时间点取自检测对象。在另一个实施 方案中，所述方法另外包括对比在两或多个时间点取自检测对象的生物学样品中存在的靶淀粉样β肽(Abeta或Αβ)的寡聚状态的水平。在一个实施方案中，所述方法另外包括将检测样品中存在的靶淀粉样β肽(Abeta或Αβ)的寡聚状态的水平与在开始治疗之前取自所述对象的一或多个样品和/或在治疗早期取自所述对象的一或多个样品中存在的量进行对比。在一个实施方案中，所述方法另外包括将靶淀粉样β肽(Abeta或Αβ)的寡聚状态的水平与一或多种对照进行对比。本发明通过如下实施例得以进一步描述，然而所述实施例不以任何方式限制本发明，本发明的范围由所附权利要求书定义。本发明的实施例I.材料和方法I. I患者和健康对照经临床诊断为AD的患者及健康对照由CRO(GALMED GmbH)招募。在预实验检测中，通过一些心理测试检测研究的所有参加者的神经心里学功能(DemTect，简易精神状态测试,画钟测试)。DemTect 测试DemTect评分是简便的痴呆筛选方法，包括五个短的子测试(10字表重复、数字译石马(number transcoding)、语义流中為任务(semantic word fluency task)、反向数字广度(backward digit span)、延迟字表回忆(delayed word list recall)) (Kessleret al. , 2000) 0原始评分被转化以给出不依赖于年龄和教育程度的评分，分类为“疑似痴呆”(评分彡8)，“轻度认知损害”(评分为9-12)和“年龄相适”(评分为13-18)。MMSE简易精神状态检查(TheMini-Mental State Examination,MMSE)或 Folstein 测试是简短的30道题问卷测试，其用于评估认知(见表I)。其在医学中通常用于筛选痴呆。在大约10分钟时长内，其抽样调查各种功能,包括计算、记忆和方向。其由Folstein etal.，1975引入，并经小改变而广泛使用。MMSE包括在一些领域的简单问题测试的时间和地点、重复单词表、计算、语言运用和理解以及基本的运动技能。例如，一个问题是要求重复画两个五边形(见下表)。(30之中)任何超过27的评分是有效正常的。低于此评分，20-26表示轻度痴呆；10-19为中度痴呆,低于10为严重痴呆。正常值也根据教育程度和年龄校正。低到极低评分与痴呆存在密切相关，尽管其它精神疾病也可以导致MMST测试中的异常发现。

表I :简易精神状态检查
权利要求
1.诊断或监测神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的方法，所述方法包括确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Αβ)的寡聚状态，其特征在于所述方法包括如下步骤 (a)确定生物学样品中靶Αβ肽的第一浓度(Ca)； (b)解聚来自步骤(a)的靶Αβ肽； (C)确定解聚的A β肽的第二浓度(Cd);及 (d)确定cd/ca比率，其中将第二浓度(Cd)的数值除以第一浓度Ca的数值；其中cd/ca的比率低于I. 5是神经变性疾病阳性诊断的指征。
2.权利要求I的方法，其中所述解聚步骤(b)包括使用碱。
3.权利要求2的方法，其中用于在步骤(b)中进行解聚的碱是氢氧化钠，如500mM氢氧化钠。
4.权利要求2或3的方法，其中所述解聚步骤(b)另外包括使用合适的溶剂，如甲醇，特别是50% (v/V)甲醇。
5.前述任ー权利要求的方法，其中所述解聚步骤(b)包括保温步骤。
6.权利要求5的方法，其中所述解聚步骤(b)包括在室温进行至少2分钟的保温步骤。
7.权利要求6的方法，其中所述解聚步骤(b)包括在室温进行至少10分钟的保温步骤。
8.前述任ー权利要求的方法，其中cd/ca的比率低于I.4如低于I. 3是神经变性疾病阳性诊断的指征。
9.权利要求8的方法，其中cd/ca的比率低于I.2如低于I. I是神经变性疾病阳性诊断的指征。
10.前述任ー权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽包含SEQID NO. 13的Αβ (3-38)的氨基酸序列。
11.前述任ー权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽包含SEQ ID NO. 19的Αβ (11-38)的氨基酸序列。
12.前述任ー权利要求的方法,其中所述祀Aβ肽是Αβ (x_y),包括其功能等价物,其中X被定义是整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，y被定义是整数，选自38、39、40、41、42 和 43。
13.权利要求10的方法，其中X是选自1、2、3和11的整数，如1，特别是11。
14.权利要求10的方法，其中y是选自38、40或42的整数，如40，特别是38。
15.前述任ー权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽选自SEQ ID NO. 1_24，包括其功能等价物。
16.前述任ー权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽是SEQID ΝΟ:2的Αβ (1_40)，包括其功能等价物。
17.权利要求1-15任ー项的方法，其中所述靶Αβ肽是SEQID ΝΟ:1的Αβ (1-42)，包括其功能等价物。
18.权利要求1-15任ー项的方法，其中所述靶Αβ肽包含SEQID NO. 2的Αβ (1-40)及SEQ ID NO. I的Αβ (1-42)，包括其功能等价物。
19.权利要求1-15任ー项的方法，其中所述靶Αβ肽选自SEQID NO. 13-24，包括其功能等价物。
20.权利要求1-15和19任ー项的方法，其中所述靶Αβ肽是SEQID NO: 13的Αβ (3-38)，包括其功能等价物。
21.权利要求1-15和19任ー项的方法，其中所述靶Αβ肽是SEQID ΝΟ:19的Αβ (11-38)，包括其功能等价物。
22.权利要求19-21任ー项的方法，其中在所述靶Αβ肽N末端的谷氨酸残基被环化为焦谷氨酸。
23.权利要求1-15任ー项的方法，其中所述靶Αβ肽选自SEQID No. 1_6，包括其功能等价物，以及其中在氨基酸位置I和/或7的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。
24.权利要求1-15任ー项的方法，其中所述靶Αβ肽选自SEQID No. 7_12，包括其功能等价物，以及其中在氨基酸位置6的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。
25.权利要求1-15任ー项的方法，其中所述靶Αβ肽选自SEQID No. 13-18，包括其功能等价物，以及其中在氨基酸位置5的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。
26.前述任ー权利要求的方法，其中所述生物学样品选自血液、血清、尿液、脑脊液(CSF)、血浆、淋巴液、唾液、汗液、胸水、滑膜液、泪液、胆汁和胰腺分泌物。
27.权利要求26的方法，其中所述生物学样品是血浆。
28.前述任ー权利要求的方法，其中确定靶Aβ肽浓度的步骤包括 i)将生物学样品与至少两种不同的捕获抗体接触， ii)检测所得免疫复合物， iii)破坏所述免疫复合物，以及 iv)量化捕获的Aβ肽。
29.权利要求28的方法，其中所述至少两种不同的捕获抗体各自特异于Αβ肽上的不同表位。
30.权利要求28或29的方法，其中所述捕获抗体选自 .3D6，表位:1-5, pAb-EL16，表位:1-7, .2H4，表位:1-8, IElI，表位:1-8, .20.1，表位1-10， 兔抗-Αβ多克隆抗体，表位1-14 (Abeam)， AB10，表位:1-16, .82E1，表位:1-16, pAbl-42,表位:1-11, NAB228，表位1-11， DE2，表位:1-16, DE2B4，表位:1-17, .6E10，表位:1-17, .10D5，表位3-7， WO-2，表位4-10，.1A3，表位 5-9，pAb-EL21，表位 5-11，.310-03，表位 5-16，鸡抗-人Αβ多克隆抗体，表位12-28 (Abcam)，鸡杭-人Αβ多克隆抗体，表位25-35 (Abeam)，兔杭-人Αβ多克隆抗体，表位Ν-末端(ABR)，兔抗-人Αβ多克隆抗体(Anaspec),.12C3，表位 10-16，.16C9，表位 10-16，.19Β8，表位 9-10，pAb-EL26，表位11-26，BAM90. 1，表位13-28，兔抗-β -淀粉样蛋白(pan)多克隆抗体，表位15-30 (MBL)，.22D12，表位18-21，.266，表位16-24，pAb-EL17，表位15-24，.4G8，表位17-24，兔抗-Αβ多克隆抗体，表位22-35 (Abeam)，G2-10，表位:31-40，兔抗-A β , aa 32-40 多克隆抗体(GenScript Corporation)，EP1876Y，表位:x-40,G2-11，表位33-42，.16C11，表位33-42，.21F12，表位34-42，.1A10，表位:35-40，及D-17山羊抗-A β抗体，表位C-末端焦谷氨酸A β抗体，Probiodrug AGAβ 5-5-6，Aβ 6-1-6,Αβ 17-4-3，Aβ 24_2_3，焦谷氨酸A β抗体克隆2-48(单克隆，小鼠)，Synaptic Systems,焦谷氨酸A β抗体(多克隆，兔)，Synaptic Systems,焦谷氨酸A β抗体克隆8Ε1 (单克隆,小鼠)，Anawa,焦谷氨酸A β抗体克隆8Ε1 (单克隆,小鼠)，Biotrend,杭-人淀粉样蛋白β (Ν3ρΕ)兔IgG (多克隆，兔)，IBL，杭-人ΑβΝ3ρΕ(8Ε1)小鼠IgG Fab (单克隆，小鼠)，IBLisoAsp 抗体(T. Saido 小组)。
31.权利要求28-30任ー项的方法，其中所述捕获抗体选自3D6、BAN50、82E1、6E10、W0-2、266、BAM90. 1、4G8、G2-10、1A10、BA27、11A5-B10、12F4 和 21F12。
32.权利要求28-31任ー项的方法，其中如下抗体对用作捕获抗体4G8 和 11A5-B10,3D6 和 4G8,6E10 和 4G8,82E1 和 4G8,4G8 和 12F4, 4G8 和 21F12,3D6 和 21F12,6E10 和 21F12,BAN50 和 4G8，3D6 和 11A5-B10,3D6 和 1A10,3D6 和 BA27,6E10 和 11A5-B10,6E10 和 1A10,6E10 和 BA27,4G8 和 11A5-B10,4G8 和 IAlO，4G8 和 BA27, 4G8 和 12F4，及 4G8 和 21F12。
33.权利要求30-32任ー项的方法，其中所述复合物的检测通过使用与每种捕获抗体特异性反应的ニ抗进行。
34.权利要求33的方法，其中所述ニ抗是抗小鼠抗体或抗兔抗体。
35.权利要求33或34的方法，其中所述ニ抗是标记的。
36.权利要求33-34任ー项的方法，其中所述ニ抗被固定化在磁珠上。
37.权利要求36的方法，其中使用磁性分离器使携帯所述免疫复合物的磁珠与生物学样品分离。
38.权利要求30-37任ー项的方法，其中所述免疫复合物的破坏是在存在50%(v/v)甲醇/0. 5%(v/v)甲酸的条件下进行的。
39.权利要求30-38任ー项的方法，其中量化检测的免疫复合物。
40.权利要求30-39任ー项的方法，其中捕获的Aβ肽通过选自如下的量化手段量化；夹心ELISA,淀粉样蛋白βト40 HTRF'llJ定，Alphascreen 测定,多重测定系统,质谱分析法及Western印迹分析法。
41.权利要求40的方法，其中捕获的Αβ肽通过夹心ELISA作为量化手段进行量化。
42.权利要求41的方法，其中所述夹心ELISA包括第一抗体，其特异于Aβ (χ-y)的完整N末端，及包括检测抗体，其特异于以氨基酸y结束的Αβ (x-y)的C末端。
43.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQID NO. 2的Αβ (1-40)的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于在第40位氨基酸结束的SEQ ID NO. 2的Αβ (1-40)的C末端。
44.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQID NO. I的Αβ (1-42)的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于在第42位氨基酸结束的SEQ ID NO. I的Αβ (1-42)的C末端。
45.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQID NO. 2的Αβ (1-40)的C末端；及包含检测抗体，其特异于以Asp-Ala-Glu开始的SEQ ID NO. 2的Αβ (1-40)的完整N末端。
46.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQID NO. I的Αβ (1-42)的C末端；及包含检测抗体，其特异于以Asp-Ala-Glu开始的SEQ ID NO. I的Αβ (1-42)的完整N末端。
47.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于选自SEQIDNO. 13-24的Αβ靶肽的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于选自SEQ ID NO. 13-24的所述Αβ靶肽的C末端。
48.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQID NO. 13的Αβ (3-38)的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于在第38位氨基酸结束的SEQ IDNO. 13 的 Αβ (3-38)的 C 末端。
49.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQID NO. 19的Αβ (11-38)的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于在第38位氨基酸结束的SEQ IDNO. 19 的 Αβ (11-38)的 C 末端。
50.权利要求47-49任ー项的方法，其中选自SEQID NO. 13-24的Αβ靶肽的N末端被环化为焦谷氨酸，以及其中所述第一抗体特异性检测焦谷氨酸化形式的选自SEQ IDNO. 13-24的所述Αβ靶肽。
51.权利要求42-50任ー项的方法，其中所述第一抗体是固定化的。
52.权利要求42-51任ー项的方法，其中所述检测抗体是标记的。
53.权利要求42的方法，其中使用ELISA试剂盒量化Aβ (χ-y)。
54.权利要求53的方法，其中所述ELISA试剂盒是量化SEQID NO. 2的Αβ (1-40)的试剂盒，选自Amyloid-β (1-40) (N) ELISA (IBL, JP27714)，Αβ [1-40] Human ELISAKit (Invitrogen), Human Amyloid beta(Amyloid-b), aa 1-40ELISA Kit(ffako ChemicalsUSA, Inc.),以及 Amyloid Beta 1-40ELISA Kit (The Genetics Company)。
55.权利要求53的方法，其中所述ELISA试剂盒是量化SEQID NO. I的Αβ(1_42)的 ELISA 试剂盒，选自Amyloid-β (1-42) (N) ELISA (IBL, JP27712)，Αβ [1-42] HumanELISA Kit (Invitrogen)，Human Amyloid beta(Amyloid-β), aa 1-42 ELISA Kit(ffakoChemicals USA, Inc.), Amyloid Betal-40 ELISA Kit(The Genetics Company),1NN0TEST β-AMYLOID (1-42) (Innogenetics)。
56.前述任ー权利要求的方法，用于阿尔茨海默病的鉴别诊断。
57.权利要求1-55任ー项的方法，用于早期阿尔茨海默病的诊断。
58.权利要求57的方法，用于轻度认知损害的诊断。
59.权利要求10-25任一项定义的寡聚Aβ肽如靶Αβ肽在诊断阿尔茨海默病中的应用。
60.权利要求59的应用，用于阿尔茨海默病的鉴别诊断。
61.权利要求59或60的应用，用于早期阿尔茨海默病的诊断。
62.权利要求61的应用，用于轻度认知损害的诊断。
63.确定生物学样品中靶淀粉样P肽(Abeta或AP)的寡聚状态的方法，包括如下步骤 (a)确定生物学样品中靶AP肽的第一浓度(Ca)， (b)解聚来自步骤(a)的靶AP肽， (C)确定解聚的AP肽的第二浓度(Cd)，及 (d)确定cd/ca的比率，其中将第二浓度(cd)的值除以第一浓度(ca)的值，其中cd/ca比率超过I是存在寡聚AP的指征。
64.权利要求65的方法，其中所述解聚步骤(b)包括使用碱。
65.诊断阿尔茨海默病的体外方法，其中使用权利要求63或64的确定淀粉样P肽的寡聚状态的方法。
66.诊断神经变性疾病如阿尔茨海默病的试剂盒，其包括合适的碱及根据权利要求.1-55任ー项的方法使用所述试剂盒的说明书。
67.监测在患有、怀疑患有或者倾向于患有神经变性疾病如阿尔茨海默病的对象中的治疗效カ的方法，包括根据权利要求1-55任一项确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样P肽(Abeta或者AP )的寡聚状态。
68.权利要求1-55或67任一项的诊断或监测方法，其包括确定来自检测对象的取自两个或多个时机的生物学样品中靶淀粉样P肽的寡聚状态。
69.权利要求68的诊断或监测方法，其包括对比取自两个或多个时机的生物学样品中靶淀粉样P肽的寡聚状态水平。
全文摘要
本发明涉及使用淀粉样蛋白β的片段的寡聚状态作为生物标记检测和诊断阿尔茨海默病，及进一步涉及确定生物学样品中淀粉样蛋白β的片段的寡聚状态的新方法。
文档编号G01N33/68GK102666577SQ201080053137
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者C·格特利希, H-U·德穆特, J-U·拉费尔德, M·克兰施米特 申请人:前体生物药物股份公司