在固相利用单一标记固定化探针及外切核酸活性的靶核酸序列检测的制作方法

专利名称：在固相利用单一标记固定化探针及外切核酸活性的靶核酸序列检测的制作方法
在固相利用单一标记固定化探针及外切核酸活性的靶核酸序列检测
技术领域：
本发明涉及一种在固相利用单一标记固定化探针且通过反复性外切核酸反应(CER, cyclic exonucleolytic reaction)或者外切核酸反应(ER, exonucleolyticreaction )检测祀核酸序列的新颖的方法。
背景技术：
基于微阵列的技术作为可以分析基因或者基因族的存在、水准或者表达模式的亮点工具非常受人瞩目(Schena et al., 1995.Quantitative Monitoring of GeneExpression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Science, 270:467-470 ；DeRisi et al., 1996, Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene Expression Patternsin Human Cancer, Nature Geneticsl4:457_460)。但是，以往的DNA微阵列方法为了检测革巴核苷酸序列主要依赖于杂交方式，因此，高比率的假阳性是极其严重的缺点。特别是，一般在以往DNA微阵列中产生的交叉反应(非-特异性杂交)及减少的灵敏度会致使最终杂交信号的可靠性急剧减少(William E.Bunney, et al.2003.Microarray Technology:A Reviewof New Strategies to Discover Candidate Vulnerability Genes in PsychiatricDisorders, Am.J.Psychiatryl60:4, 657-666)。为了克服这种基于微阵列的技术的问题，不仅仅依赖于是否杂交，而是提出了利用如DNA聚合酶反应或者连接酶(Iigase)反应等的酶反应使祀检测的可靠性提高的多种而新颖的微阵列接近法。单喊基延伸(SBE,single base extension)方法或者微测序(minisequencing)方法(SBE: Shumaker et al.Mutation detection by solid phase primer extension.Hum.Mutat.7:346-354 (1996) ；Pastinen, et al., Minisequencing:a specific tool for DNAanalysis and diagnostics on oligonucleotide arrays.Genome Res.7:606-614(1997))在单一标记ddNTPs存在下，利用5’一 3’DNA聚合酶且通过诱导包含单一标记ddNTPs的引物的单一碱基延伸来检测靶。连接(ligation)方法(Affymetrix, INC,Enzymatic methods for genotyping onarrays,U.S.Pub.N0.US2008/0131894)通过利用连接酶使阵列探针与单一标记探针相连接(ligation)来检测祀序列。虽然，这种现有方法提供了利用单一标记分子的基于微阵列的靶检测接近法，但是，上述方法还具有严重的缺点。例如，单碱基延伸方法及连接方法分别需要如标记的ddNTPs及第二标记的探针等的追加的结构因素，同样，也需要对于这种追加的结构因素的追加的反应。并且，这种方法由于DNA聚合酶及连接酶所具有的内在的反应误差率可能会产生假阳性信号。

另一方面，介绍了利用DNA聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性及双重标记探针来检测革巴序列的基于固相的拖慢(TaqMan)探针方法(Liu et al., TaqMan probe array forquantitative detection of DNA targets, Nucleic Acid Res.34: e4 (2006))。在上述方法中，双重标记探针在固相基质上实现固定化。上述方法通过检测利用DNA聚合酶的引物-依赖性5’ 一3’核酸酶活性而切割双重标记探针时产生的信号的增加，来检测靶序列。上述引物-依赖性5’ 一 3’核酸酶活性意味着仅利用与上游引物或者上游引物的延伸产物相结合的DNA聚合酶，来切割双重标记探针。这种双重标记方法具有成为问题的考虑因素。例如，应考虑到通过酶性切割来分离两种标记分子，即使在切割反应之后也使报道分子残留在固相基质上，来决定探针上的报道分子及猝灭分子的位点。报道分子及猝灭分子之间的距离越远，由于不稳定的猝灭而产生本底信号的可能性就越多。这种在探针上的双重标记系统相关难题在用于基于固相的拖慢探针方法的探针的设计上引起局限性及困难。进而，两种标记分子在有成本效益的方面上不适合利用。并且，使用用于切割反应的追加的上游引物会致使这种方法变得更加复杂。因此，在本技术领域中，需要开发出仅利用单一标记分子在一个DNA微阵列上能够以改善的可靠性及重现性，更简便地检测靶序列的新颖的DNA微阵列技术，上述靶序列优选为多个靶序列。并且，在本技术领域中，也需要为了靶核酸序列的定量分析而仅利用单一标记分子的新颖的实时微阵列方法。
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在本说明书全文中参照多篇专利及文献，并用括号来表示其引用部分。这样的专利及文献，作为参照全部包括在本说明书中，因此，能够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。发明概述在这种情况下，本发明者为了开发更简便又能够无假阳性及假阴性结果地在固相检测、鉴定及定量靶核酸序列的新颖的靶检测技术而锐意努力研究。其结果，本发明者定立了在固相实施的新颖的检测方案，根据该新颖的方案利用具有单一标记的固定化探针，在固相通过反复性外切核酸反应(CER, cyclic exonucleolytic reaction)或者外切核酸反应(ER, exonucleolytic reaction)减少表示祀核酸序列的存在的信号，并且扩增信号减少。上述新颖的检测方案利用了单一标记系统，因此，非常适合在固相检测靶核酸序列。因此，本发明的目的在于，提供一种在固相利用反复性外切核酸反应(CER)从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法。本发明的再一目的在于，提供一种在固相利用外切核酸反应(ER)从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法。本发明的另一目的在于，提供一种用于在固相利用反复性外切核酸反应(CER)或者外切核酸反应(ER)从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒。本发明的另一目的及优点，通过所附的权利要求书和附图以及下面的详细说明将变得更加明确。

图1表示本发明的方法。在固相基质上的单一标记固定化探针与靶核酸序列进行杂交的情况下，上述单一标记固定化探针的5’ -末端部位由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的酶所切割，单一标记从探针分离。通过这种单一标记的分离产生固相基质上的信号减少，该信号减少表示靶核酸序列的存在。图2a及图2b表示利用在固相基质上实现固定化的单一标记探针且通过本发明的反复性外切核酸反应得到的靶检测结果。图2a表示相当于循环数的荧光图像，图2b表示上述图像的荧光强度。图3a及图3b表示利用在固相基质上实现固定化的单一标记探针且通过本发明的外切核酸反应到的靶检测结果。图3a表示相当于培养时间的荧光图像，图3b表示上述图像的荧光强度。发明详述本发明涉及一种利用单一标记探针及5’ 一 3’外切核酸酶的新颖的固相方法。通过反复性外切核酸反应或者非-反复性外切核酸反应(non-cyclicexonucleolytic reaction,以下称为外切核酸反应(ER))在固相基质实施本发明。本发明者为了开发更简便又能够无假阳性及假阴性结果地在固相检测、鉴定及定量靶核酸序列的新颖的靶检测技术而锐意努力研究。其结果，本发明者定立了在固相实施的新颖的检测方案，根据 该新颖的方案利用具有单一标记的固定化探针，在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应减少表示靶核酸序列的存在的信号，并且扩增信号减少。上述新颖的检测方案利用了单一标记系统，因此，非常适合在固相检测靶核酸序列。在本说明书中使用的术语“反复性外切核酸反应”意味着利用于杂交及改性的循环的基于5’ 一 3’外切核酸酶活性的切割反应。在本说明书中使用的术语“外切核酸反应”意味着单一标记探针与靶核酸序列进行杂交，且无需人为的(有意的)改性步骤地从靶核酸序列分离之后，新的单一标记探针与靶核酸序列进行杂交的5’ 一 3’外切核酸酶活性-诱导切割反应。在本说明书中使用的术语“信号减少”意味着在使单一标记探针固定化的固相基质上检测出的信号的减少。在靶核酸序列检测中，本发明并不是通过信号增加而是利用信号减少来进行检测。在本说明书中使用的术语“信号减少的扩增”意味着在固相基质上检测出的信号更加减少。根据本发明，扩增上述信号减少，从而能够以更准确、灵敏的方式来检测靶核酸序列。本发明者考虑到从二聚物DNA向5’一 3’方向用于催化5’核苷酸的连续去除的T7外切核酸酶或者一部分DNA聚合酶通过单一标记探针与靶核酸序列的杂交，可从在固相实现固定化的单一标记探针诱导信号变化。通过与单一标记探针与靶核酸序列的杂交，在固相实现固定化的单一标记探针形成双链核酸分子，从而借助具有用于切割反应的5’ 一 3’外切核酸酶活性的酶而被特异性地识别出来。通过切割反应使存在于探针的5’-末端部位的单一标记被分离，从而诱导在固相实现的信号减少，由此检测靶核酸序列的存在。并且，本发明者发现了在固相实施的信号减少的扩增能够无需靶核酸序列扩增地通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应来达成，且在固相能够以更加准确、灵敏的方式检测靶核酸序列。有关在固相实施的靶检测的以往技术的最大重点在于，在反应结束点所检测的信号上。与此不同，本发明基于通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应在信号减少的扩增期间信号强度的变化，由此本发明者检测了信号减少的变化，并能够进行更加准确的靶核酸序列的定性分析及定量分析。在本发明中，不受从在固相基质上实现固定化的双重标记的探针分离的标记分子的干涉地利用无需清洗步骤的如共聚焦激光扫描仪等适合的设备，来检测或者测定固相基质上的信号。因此，在本发明中，通过单一标记探针与靶核酸序列的杂交，在固相基质上实现固定化的单一标记探针被切割而分离出标记，能够以实时方式检测固相基质上实现的信号的减少，由此以实时方式检测靶核酸序列。本发明通过应用于本发明的酶反应而表示更高的靶特异性，由于利用单一标记而不是双重标记，因而从本底信号去除及有成本效益的观点来看，具有非常优秀的优点。本发明的一种特征在于，通过从探针分离出单一标记分子，来测定固相基质上实施的信号减少，由此检测靶核酸序列。现有方法为了判定靶核酸序列的存在，通常测定或者分析在固相基质上实施的信号产生(即，信号增加)。因此，现有方法需要双重标记系统或者在单一标记系统中需要追加的标记成分(例如，标记的ddNTP或者追加的标记探针)。有趣的是，利用在固相实现固定化的单一标记探针的本发明在液相呈现利用单一标记探针无法得到的效果。利用单一标记探针及5’ 一 3’外切核酸酶的基于液相靶检测方法为了判定单一标记探针的切割，将会需要如电泳一样的复杂的过程。与此不同，在固相实施的本发明无需复杂的分离步骤，即使仅利用单一标记也确保将会检测出探针切割。以往基于液相的方法，无法利用实时方式来检测单一标记探针的切割。相反，在固相实施的本发明利用实时方式来检测单一标记探针的切割。1.利用单一标记探针及反复性外切核酸反应在固相基质上实施的靶检测根据本发明的一实施方式，提供一种在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列 的方法，包括如下步骤:步骤(a)，将上述靶核酸序列与固定化探针进行杂交；上述固定化探针包含:核苷酸序列，与上述靶核酸序列互补，以及单一标记，用于产生可检测的信号；上述固定化探针通过其3’ -末端在固相基质上实现固定化；步骤(b)，在切割上述固定化探针的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶相接触；上述固定化探针由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的上述热稳定性酶所切割，使得上述单一标记从上述固定化探针分离，来引起在上述固相基质上实现的信号减少；步骤(C)，使上述步骤(b)的结果物得到改性；步骤(d)，至少反复进行两次上述步骤(a)_步骤(C)，进而使上述固相基质上实现的上述信号减少；以及步骤(e)，检测上述固相基质上实现的上述信号减少；通过上述固定化探针的切割而引发的上述信号减少表示上述靶核酸序列的存在。通过反复性外切核酸反应的本发明涉及一种为了通过反复性外切核酸反应检测靶核酸序列而在固相获得信号的新颖的接近法，上述反复性外切核酸反应包含:(i)信号减少，通过由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶切割单一标记探针来实现；以及
(ii)信号扩增(即，扩增信号减少)，通过单一标记探针与靶核酸序列的杂交及改性的反复来实现。
本发明的反复性外切核酸反应过程借助杂交及改性的循环，来扩增信号减少。反复性外切核酸反应过程无需扩增靶核酸序列地确保表示靶核酸序列的存在的信号减少的扩增，来检测极少量的靶核酸序列。并且，反复性外切核酸反应过程在比较短的切割反应时间内以更加迅速、有效的方式使信号减少扩增。反复进行杂交及人为的(有意的)改性步骤会使靶核酸序列与非切割单一标记探针之间的杂交机会增加，以实现信号减少的扩增。并且，在比较短的时间内反复的杂交使非-特异性杂交的可能性减少，有助于防止非-特异性信号。在使用双链靶核酸序列的情况下，上述双链以在每个循环中改性为单链的方式参与杂交。在优点中，反复性外切核酸反应过程与无人为的(有意的)改性步骤的外切核酸反应过程相比表示更为有效的杂交反应。在本发明中靶核酸序列与在固相基质上实现固定化的单一标记探针进行杂交。在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，且在杂交、退火或者扩增条件下与探针或者引物进行退火或者杂交。本说明书中使用的术语“探针(probe)”意味着与靶核酸序列实质上互补的部位或者包含这些部位的单链核酸分子。优选地，探针为单链脱氧核糖核苷酸分子。并且，探针可包含核糖核苷酸。在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶一样的聚合剂的存在以及适合的温度与PH的条件下，可起到合成的起始点的作用。优选地，引物在扩增中作为具有最大有效性的单链。优选地，引物为寡脱氧核糖核苷酸。在本发明中所利用的探针或者引物可包含自然(naturally occurring)脱氧单磷酸核苷(dNMP) (S卩，脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧鸟苷酸(dGMP)、脱氧胞苷酸(dCMP)及脱氧胸苷酸(dTMP))、变形的核苷酸或者非-自然核苷酸。就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延伸产物的合成。引物的适合的长度取决于多 个因素，例如，温度，应用领域及引物的根源(source)。在本说明书中使用的术语“退火”或者“引发”意味着在模板核酸并置(apposition)寡脱氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互补的核酸分子。在本说明书中使用的术语“杂交(hybridization)”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。杂交在两个核酸链之间完全互补时(perfect match)产生,或存在部分错配的(mismatch)碱基也会产生杂交。杂交所需的互补程度可随着杂交条件而不同，尤其可以根据温度进行调节。在本说明书中使用的术语“退火”和“杂交”没有区分，在本说明书中混用。在本发明中使用的固定化探针具有与靶核酸序列互补的核苷酸序列。术语“互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件下引物或者探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并包括“实质上互补的(substantially complementary)”及“完全互补的(perfectly complementary)”的意思,优选地,意味着完全互补的意思。在本发明中使用的固定化探针通过其3 ’ -末端在固相基质上实现固定化。优选的固相基质包含适合的固相或者半-固相载体，例如，膜、过滤器、芯片、载玻片、晶片、纤维、磁珠或者非磁性磁珠、凝胶、管材、板、高分子、微粒及毛细管。
虽然，在一部分实例中，优选地，针对互不相同的化合物，以物理方式分离合成区域，该合成区域例如为，孔板、凸起区域(raised region)、销、蚀刻沟槽(etched trench)等，但是，在多个实例中，固相基质的至少一个表面实质上可以是平面。根据本发明的其他实例，这些固相基质将会具有磁珠、树脂、凝胶、微球或者其他几何排列形态。优选地，固相基质包含微阵列。探针在固相基质的表面直接或者间接地实现固定化，优选地，间接地实现固定化。并且，探针能够以共价键或者非共价键方式在固相基质的表面上实现固定化。在探针间接地在固相基质的表面上实现固定化的情况下，可利用合适的连接肽。可利用于本发明的连接肽均包含用于在微阵列中使探针固定化的任何连接肽。例如，具有胺基的烷基或者芳基化合物或者具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作为连接肽利用于探针固定化。并且，可将聚尾(poly T tail)或者聚腺苷酸尾(poly A tail)作为连接肽来利用，从而能够减少有可能将酶作用(例如，酶性切割反应)抑制的可能性高的空间性妨碍(space hindrance)或者增加杂交效率。聚尾(poly T tail)或者聚腺苷酸尾(polyA tail)不包含于探针的序列。在本发明中提供反应环境的微阵列也包括在本发明所属的技术领域中公知的任何微阵列。本发明的全部过程，即与靶序列的退火、延伸/切割反应及荧光的检测在微阵列上完成。在微阵列中固定化探针利用为杂交阵列因素(hybridizable array element)。用于制备微阵列的固相基质(solid substrate)包括,例如金属(例如，金、金与铜的合金及铝)、金属氧化物、玻璃、陶瓷、石英、硅、半导体、Si/Si02晶片、锗、砷化镓、碳、碳纳米管、聚合物(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯及聚丙烯酰胺)、琼脂糖凝胶(sepharose)、琼脂糖(agarose)及胶体(colloids),但是不局限于此。本发明的多个固定化探针固定化在固相基质上的一个可设定地址的(addressable)区域(region)或者多个可设定地址的区域(region),固相基质可包括2-1000000个可设定地址的区域(region)。为了通过如光刻法、喷墨打印法、机械点样法及与其类似的方法等现有制备技术，生产阵列或者用于特定应用的阵列而可以制备(fabricate)固定化探针。在本发明中，由于在固相基质上实现固定化的探针以物理方式相互隔开，因此即使利用一个种类的标记分子，也可以在固相基质上检测多个靶核酸序列。在本发明中使用的固定化探针具有产生可检测的信号的单一标记。上述单一标记不受特别的限制，例如为，化学标记(例如，生物素)、酶标记(例如，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β -半乳糖昔酶(β -galactosidase)及 β -葡萄糖昔酶(β -glucosidase)、突光素酶(luciferase)、细胞色素(cytochrome) P450 及辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase))、放射性标记(例如,C14、I125、P32及S35)、突光标记、发光(luminescent)标记、化学发光(chemiluminescent)标记或者金属标记(例如,金)。根据本发明的优选实例，单一标记为能够利用实时方式产生信号的标记。更为优选地，上述单一标记为突光标记。荧光标记的的优选例如下:Cy2 (506)，YO-PROtm-1(509)，YOYOtm-1 (509)，Calcein (517)，FITC(518), FluorX (519), Alexa (520), Rhodaminel10(520)，OregonGreen 500 (522), Orego n Green 488(524), RiboGreen (525), Rhodamine Green (527),Rhodaminel23(529)，Magnesium Green (531), Calcium Green (533), TO-PROtm-1(533)，T0T01 (533), JOE (548)，B0DIPY530/550 (550)，Dil(565), BODIPY TMR(568),B0DIPY558/568(568)，B0DIPY564/570(570)，Cy3 (570), Alexa 546(570), TRITC(572)，Magnesium Orange (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575),Calcium Orange (576), Pyronin Y(580), Rhodamine B(580), TAMRA(582), RhodamineRed (590), Cy3.5 (596), ROX(608)，Calcium Crimson (615), Alexa 594(615), TexasRed(615)，Nile Red (628)，Y0-PR0 -3(631), Y0Y0 -3 (631)，R-phycocyanin(642),C-Phycocyanin (648), T0-PR0 -3 (660), T0T03 (660), DiD DiIC (5) (665)，Cy5 (670),Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556)，TET (536)，Biosearch Blue(447)，CAL Fluor Gold540(544)，CAL Fluor 0range560 (559), CAL Fluor Red590(591),CAL Fluor Red610(610)，CAL Fluor Red 635(637), FAM (520), Fluorescein (520),Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566)，Quasar570 (667), Quasar670 (705)及Quasar705(610)。括号的数字为以纳米单位表示的最大发光波长。适合的突光标记公开在如下的许多文献中:Pesce等，editors, FluorescenceSpectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971) ；ffhite 等，Fluorescence Analysis:A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970) ；Berlman, Handbook ofFluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, NewYork, 1971) !Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (AcademicPress,New York, 1976) ；Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press,Oxford, 1972)；Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (MolecularProbes, Eugene, 1992) ；Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (IntersciencePublishers, New York, 1949) ；Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals, 6th Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg.，1996 ;美国专利第3996345 号及第 4351760 号。单一标记分子可通过多种方法与探针相连接。优选地，单一标记分子可通过包含至少三个碳原子的间隔区(例如，3-碳间隔区、6-碳间隔区、9-碳间隔区或者12-碳间隔区)与探针相连接。根据本发明的优 选实例，固定化探针上的单一标记位于其5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-5核苷酸的位点，更优选地，位于5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-4核苷酸的位点，进而优选地，位于5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-3核苷酸的位点,尤其优选地,位于5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-2核苷酸的位点,最优选地,位于5’ -末端。探针或者引物的退火或者杂交可根据本发明所属技术领域公知的多种杂交方法来实施。在本发明中，适合的杂交条件借助最优化程序决定为一连串的过程。温度、成分的浓度、杂交及清洗时间、缓冲液成分及它们的PH及离子强度等条件根据多种因子而变得多样，例如，如探针及靶核酸序列的寡核苷酸的长度及糖皮质激素(GC)含量。对于杂交的详细条件可以在 Joseph Sambrook,等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001);及M.L.M.Anderson, NucleicAcid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc.N.Y.(1999)石角认。在本发明中，例如，靶核酸序列和固定化探针的杂交温度为30°C -80°C，更优选为400C -75°C，进而优选为 50°C -72°C。结束杂交反应之后，在切割固定化探针的条件下，使步骤(a)的结果物与具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶相接触。仅在固定化探针与靶核酸序列进行杂交的情况下，由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶所切割，使单一标记从固定化探针分离，最终，引起在固相基质上的信号减少(参照图1)。通过切割固定化探针而引起的这种信号减少表示靶核酸序列的存在。本说明书中的“切割固定化探针的条件”意味着有助于由具有5’一 3’外切核酸酶活性的酶致使固定化探针被切割的反应条件，包括温度、pH、离子强度、缓冲液、探针长度、序列及外切核酸酶的种类。根据本发明的优选实例，杂交及切割反应实施10分钟以下，优选为5分钟以下，进而优选为I分钟以下，尤其优选为0.5分钟以下。根据本发明的优选实例，杂交及切割反应至少实施5秒钟，优选为至少10秒钟，更优选为至少20秒钟。具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶包含热-稳定酶，该热-稳定酶作用于与靶核酸序列进行杂交相关的探针，来向5’ 一 3’方向促进外切核酸反应。上述酶不对单链核酸分子进行切割。选择性地，在本发明中使用的单一标记探针在其5’ -末端还包含至少一个错配核苷酸。一部分5’ 一 3’外切核酸酶根据条件呈现外切核酸酶活性和5’ 一 3’内切核酸酶活性(参考 Murante 等，Journal of Biological Chemistry, 269:1191-1196 (1994))。因此，利用在5’-末端具有至少一个错配核苷酸的单一标记探针的情况下，本发明可根据5’一 3’外切核酸酶(例如，Taq DNA聚合酶)的种类及反应条件来检测靶核酸序列。优选地，单一标记探针在其5’ -末端还包含1-3个错配核苷酸。优选地，单一标记分子位于错配核苷酸。优选地，具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶为具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性模板-依赖性核酸聚合酶，更优选为从多种细菌种类中获得的热稳定性 DNA 聚合酶，例如包含 Thermus aquaticus (Taq)、Thermus thermophilus、Thermusfiliformis、Thermus flavus、Thermus antranikiani1、Thermus caldophilus、Thermuschliarophilus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshima1、Thermusruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05及Thermus species spsl7的DNA聚合酶。最优选地，具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶。与靶核酸序列进行杂交的固定化探针由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶所切割，使上述单一标记从固定化探针分离，来使固相基质上的信号减少。结束固定化探针的切割反应之后，使步骤(b)的结果物得到改性。改性方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙醇酸处理、酶方法(例，解旋酶作用)及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，改性可以通过以70°C _105°C范围的温度进行热处理而达成。用于达成上述处理的常规方法提供在 Joseph Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)。优选地，本发明的改性在靶核酸序列与探针之间的杂交中不发生的条件下实施。在利用双链靶核酸序列的情况下，在使靶核酸序列得到改性而变成单链的条件下实施改性。随后，至少反复进行2次 步骤(a)-步骤(c)(优选为至少5次，更优选为至少10次)，来追加地减少固相基质上的信号。
反复进行杂交、切割及改性(即，反复性外切核酸反应)使信号减少扩增，这将会引起在固相基质上实现的信号变化。
包括核酸分子(靶核酸序列及探针)的浓度和序列及所使用的酶的种类和活性的反应条件对信号减少的程度产生影响。信号减少模式的测定提供多种、有用的信息(例如，靶核酸序列的定性分析及定量分析)。在本发明中，在反复性反应的结束点可测定反复性反应期间的信号减少，以能够进行更为准确的靶核酸序列的定性分析及定量分析。在这观点上，利用固相基质上的单一标记探针的反复性外切核酸反应非常有用于靶核酸序列的定量检测。最终，检测出固相基质上实现的信号减少，这种通过切断固定化探针而引起的信号减少表示靶核酸序列的存在。信号检测在反复的结束点(S卩，结束点方式)、反复的各循环(S卩，实时方式)或者反复期间各预定时间间隔中实施。优选地，信号检测可在反复的各循环或者反复期间各预定时间间隔(predetermined time intervals)中实施。可通过现有方法检测或测定各标记的信号。例如，荧光信号可通过现有方法，例如突光光度计(fIuorometer)进行检测或测定。清洗步骤可在步骤(e)之前实施。但是，本发明不受从固相基质上的单一标记探针分离的标记分子的干涉地利用未清洗固相基质的如共聚焦激光扫描仪等适合的设备，能够仅检测存在于固相基质上的信号。因此，信号减少可以通过实时方式进行检测，其结果，以更简便、准确的方式实时检测固相基质上的靶核酸序列。根据本发明的优选实例，步骤(a)中还包含反向引物，该反向引物用于生成与固定化探针进行杂交的靶核酸序列。在利用反向引物和具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶的情况下，与探针进行杂交的模板在反复步骤期间通过核酸合成反应来选择性地增加。通过增加上述模板能够以更迅速的方式提供检测靶序列的信号。选择性地，步骤(a)中还包含上游引物或者探针，上述上游引物与固定化探针的杂交位点(hybridized site)的下游位点(site)进行杂交。在本说明书中使用的术语“上游引物”意味着杂交于下游位点而不是杂交于固定化探针的杂交位点来形成与靶核酸序列互补的序列的引物，上述引物借助模板-依赖性核酸聚合酶来延伸。在本说明书中使用的术语“上游探针”意味着在下游位点与靶核酸序列进行杂交的非-延伸(non-extendible)探针,而不是在供固定化探针杂交的位点与祀核酸序列进行杂交。上游引物或者上游探针位于固定化探针的5’ -末端的上游位点。具有5’一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶使上游引物延伸之后，对固定化探针进行切割。选择性地，上述模板-依赖性核酸聚合酶与上游探针(或者上游引物)相接触，由此可以切割固定化探针，上述上游探针(或者上游引物)以与固定化探针邻接的方式存在。在利用上游引物或者探针的情况下，固定化探针可通过上游引物或者模板-依赖性核酸聚合酶的探针-依赖性5’ 一 3’外切核酸酶活性来切割。在上游引物或者探针与靶核酸序列进行杂交之前，模板-依赖性核酸聚合酶的5’一 3’外切核酸酶活性作用于靶核酸序列和单一标记探针的二聚物的情况下，与上游引物或者探针的存在相独立的本发明可诱导信号减少。因此，在上游寡核苷酸(上游引物或者探针)参与反应的情况下，不仅可以通过DNA聚合酶的寡核苷酸-依赖性5’ 一 3’外切核酸酶活性，而且也可以通过寡核苷酸-独立性5’ 一3’外切核酸酶活性来引起信号减少。根据本发明的优选实例，在模板-依赖性核酸聚合酶同时与上游探针的3’ -末端部位及固定化探针的5’ -末端相接触的范围内，上游探针及固定化探针相互紧邻。优选地，上游探针的3’ -末端位于从固定化探针的5’ -末端隔开1-20核苷酸的位点(更优选为1-10核苷酸，进而优选为1-5核苷酸)。最优选地，上游探针的3’-末端位于与固定化探针的5’ -末端相互紧邻的(immediately adjacent)位点。在本发明中利用上游引物及反向引物的情况下，靶核酸序列可随着扩增而被检测。优选地，上游探针的3’ -末端被阻断(blocking)，以便抑制延伸反应。上游探针的非-延伸阻断(non-extendable blocking)可以添加非-互补核苷酸或者在其最后核苷酸的3’-羟基添加如磷酸盐基的化学成分(moiety)而达成。并且，阻断过程去除最后核苷酸的3’ -羟基或者采用如双脱氧核苷酸一样没有3’ -羟基的核苷来实施。根据本发明的优选实例，固定化探针具有阻断部位(blocker site)。阻断部位包含针对由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少一个的核苷酸阻断齐U。在固定化探针与非-靶核酸序列进行杂交的情况下，阻断剂部位位于由具有5’ 一3’外切核酸酶活性的酶所切割的部位。根据本发明的优选实例，阻断部位包含1-15阻断剂，更优选地包含2-10阻断剂，进而优选地包含3-8阻断剂，尤其优选地包含3-6阻断剂。存在于固定化探针的阻断剂核苷酸为一个或者连续或者不连续存在的一 个以上的核苷酸。作为阻断剂的核苷酸，即包含对于具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的主链(backbone )的核苷酸，包含本发明所属的技术领域中公知的任何物质。例如，上述核苷酸包含多种硫代磷酸酯键合(linkage)、磷酸酯键合、磷酰胺酯键合及2’-碳水化合物改性。根据本发明的优选实例，包含针对具有5’ 一3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的主链的核苷酸包含硫代磷酸酯合(pho sphor ο th i oat einkage)、烧基磷酸三酯键合(alkyl phosphotriester Iinkage)、芳基磷酸三酯键合(arylphosphotriester linkage)、烧基憐酸酯键合(alkyl phosphonate linkage)、芳基憐酸酉旨键合(aryl phosphonate I inkage)、M1Ii粦酸酉旨键合(hydrogen phosphonate linkage)、烧基磷酰胺酯键合(alkyl phosphoroamidate linkage)、芳基磷酰胺酯键合(arylphosphoroamidate I inkage )、憐硒酸酯键合(phosphorose Ienate I inkage )、2，-O-氨丙基改性(2，-0-aminopropyl modification)、〗，_0_ 烧基改性(2，-O-alkylmodification)、2’ -O-烯丙基改性(2，-0-allyl modification)、2’ -O- 丁基改性(2，-0-butylmodification)、α -异头寡核苷酸(a-anomeric oligodeoxynucleotide)及 1- (4，-硫代-β-D-呋喃核糖基)改性(1- (4，-thio-β-D-ribofuranosyl) modif ication)。存在于固定化探针的阻断剂核苷酸为一个或者连续或者不连续存在的一个以上的核苷酸。根据本发明的优选实例，在本发明中追加利用的上游引物和/或反向引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸(DP0, dual priming oligonucleotide)结构:5， -Xp-Yq-Zr-3’(I)
上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’ -第一次引发部位(5，-first priming portion) ;Yq为包含三个以上通用碱基的分离部位(separationportion) ;Z,为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’ -第二次引发部位(3’ -secondpriming portion) ;p、q以及r表示核苷酸的数量,X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm ;上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引发部位从上述3’ -第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’ -第一次引发部位以及上述3’ -第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述引物的整体退火特异性得到提高。利用引物来实施本发明的情况下，以往引物可以稍微特异性地检测靶核酸序列。因此，优选地，利用具有双重引发寡核苷酸结构的引物。但是，具有双重引发寡核苷酸结构的弓I物使本发明的靶特异性提高(参照W02006/095981)。在本说明书中揭示引物而使用的术语“以往”意味着不具有双重引发寡核苷酸结构的所有引物。它们在本说明书中被说明为以往引物。在本发明中 ，任何探针也可以被利用为包含单一标记分子的固定化探针。选择性地，在本发明中利用的固定化探针不包含具有改性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针(TD probe, target discriminative probe)。改性双重特异性寡核苷酸结构是双重特异性寡核苷酸(DS0:dual specificity oligonucleotide)改性的新结构，本发明者第一次提出了该结构(参照W02006/095981)。并且，上述双重特异性寡核苷酸结构起到引物作用时，命名为双重引发寡核苷酸(DP0, dual priming oligonucleotide) (Chun等,Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratoryviruses and SNP genotyping of CYP2C19gene,Nucleic Acid Research,35:6e40(2007))。根据本发明的优选实例，本发明利用于靶核酸序列的定量检测。特别是，在步骤Cd)的反复的各循环中实施用于检测的步骤(e)或者在反复期间各个预定时间间隔中实施用于检测的步骤(e)的情况下，本发明非常有用于靶核酸序列的定量检测。本发明的定量检测可通过变更一部分以往定量聚合酶链式反应(PCR)方法而达成(Sambrook, J.等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001))。例如，在由标准曲线可以使在反应起始点存在的靶核酸序列的数量与表示探针的切割程度的信号相关联的情况下，能够以通常的方式使本发明的反复性外切核酸反应与标准曲线相结合。标准曲线可利用已知数量的标准分子来制作。根据本发明的优选实例，在本发明中所利用的靶核酸序列为利用扩增引物而得到的预-扩增的(pre-amplified)核酸序列。预-扩增的核酸序列可以通过多种扩增方法来得到。例如，聚合酶链式反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)、连接酶链式反应(LCR, Ligase Chain Reaction)、链置换扩增(SDA, Strand Displacement Amplification)、转录介导扩增(TMA, TranscriptionMediated Amplification)、滚环扩增(RCA, Rolling Circle Amplification)或者核酸序列依赖性扩增法(NASBA, Nucleic Acid Sequence Bases Amplification)。优选地，扩增弓I物具有上述双重弓I发寡核苷酸结构。
本发明的优点在至少两种靶核酸序列的同步(多重)检测中被强调。根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，固定化探针包含至少两种探针(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，固定化探针包含至少两种探针(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，上游引物和/或反向引物包含至少两种引物(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，固定化探针包含至少两种探针(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，上游探针包含至少两种探针(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。通过本发明检测到的靶核酸序列不受特别的限制，包含DNA CgDNA或者cDNA)或者RNA分子。并且，本发明不要求所要检测和/或扩增的靶核酸序列具有某种特征序列或者长度。当mRNA用作初期物质时，在实施退火步骤之前必需要进行反转录步骤，以上详细的内容公开在 Joseph Sambrook等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001);及 Noonan, K.F.等，NucleicAcids Res.16:10366 (1988)。为了反转录反应，可利用随机六聚体或者与mRNA杂交的寡核苷酸dT引物。寡核苷酸dT引物由dTMPs组成，且在dT引物可以起到引物作用的范围内其dTMPs的一个或者一个以上可由其他脱氧单磷酸核苷(dNMP)来代替。反转录可以由具有核糖核酸酶(RNase H:Ribonuclease H)活性的反转录酶来实施。利用具有核糖核酸酶活性的酶时，慎重地选择反应条件，从而可以省略另行的核糖核酸酶切割过程。特别是，在本发明中可以进行检测和/或扩增的靶核酸序列还均包含任何自然(naturally occurring)原核细胞核酸、真核细胞(例如,原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)核酸、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV:HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS)、流感病毒、EB 病毒(Epstein-Barrvirus)、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或者类病毒核酸。
·
并且，本发明非常有用于核苷酸变异的检测。在本发明中使用的术语“核苷酸变异”意味着在连续的DNA片段或者序列类似的DNA片段中存在于特定位点的DNA序列的核苷酸的多样性。这种连续的DNA片段包含一个基因或者一个染色体的某些其他部位。例如，可以通过本发明的方法而检测的核苷酸变异包括单核苷酸多态性(SNP, single nucleotidepolymorphism)、缺失、插入、置换及易位(translocation)。核苷酸变异的例子包括:人类基因组的多种变异(例如，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR, methyIenetetrahydrofolatereductase)基因的变异)、与病原体的药物耐性相关的变异及癌产生-相关变异。根据本发明的优选实例，固定化探针包含与核苷酸变异互补的核苷酸或者相当于核苷酸变异的核苷酸。在本发明检测靶核酸序列的核苷酸变异的情况下，在步骤(a)中所利用的靶核酸序列优选为预-扩增的核酸序列。根据本发明的优选实例，本发明利用用于扩增靶核酸序列的扩增引物来实施。利用具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶及扩增引物且通过反复性外切核酸反应而实施的本发明扩增靶核酸序列的同时可检测靶核酸序列。
[I1.利用单一标记探针及外切核酸反应在固相基质上实施的靶检测根据本发明的另一实施方式，提供一种在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，包括如下步骤:步骤(a)，将上述靶核酸序列与固定化探针进行杂交；上述固定化探针包含:核苷酸序列，与上述靶核酸序列互补，以及单一标记，用于产生可检测的信号；上述固定化探针通过其3’ -末端在固相基质上实现固定化；步骤(b)，在切割上述固定化探针的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的酶相接触；上述固定化探针由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的上述酶所切割，使得上述单一标记从上述固定化探针分离，来引起上述固相基质上实施的信号减少；步骤(C)，为了对上述步骤(a)及步骤(b)中未被切割的固定化探针进行追加切害I]，在与上述步骤(b)相同的条件下维持上述步骤(b)的结果物，由此追加地减少上述固相基质上的上述信号；以及步骤(d)，检测上述固相基质上实现的上述信号减少；通过上述固定化探针的切割而引发的上述信号减少表示上述靶核酸序列的存在。在固相基质基于外切核酸反应的本发明除了外切核酸反应方案利用外切核酸反应来代替反复性外切核酸反应之外，与上述反复性外切核酸反应方案类似。因此，为了避免不必要的重复，不反复它们之间的重复的内容，但均包括上述方法的相关内容。在利用探针的切割反应的本发明中，在恒定的温度下维持用于杂交的反应的情况下，被切割的探针自然从靶核酸序列分离，非切割的探针与靶核酸序列进行杂交并进行切割及分离。因此，基于外切核酸反应方法的本发明诱导探针杂交、切割及分离的反复，这引起信号减少的扩增。

并且，在固相基质上检测出的信号灵敏度随着时间的经过更加减少，因此，本发明的外切核酸反应方法以时间-经过方式检测信号减少。包含核酸分子(靶核酸序列及探针)的浓度和序列及所使用的酶的种类和活性的反应条件对信号减少的程度产生影响。信号减少模式的测定提供多种、有用的信息(例如，靶核酸序列的定性分析及定量分析)。本发明的信号减少可在反应的结束点或者反应期间被测定，以能够进行更为准确的靶核酸序列的定性分析及定量分析。通过信号减少的实时检测，能够以更简便、准确的方式在固相基质上检测靶核酸序列。根据本发明的优选实例，在步骤(d)中的检测在步骤(C)的结束点实施。选择性地，在步骤(d)中的检测在步骤(b)及步骤(C)期间按各个预定时间间隔实施。优选地，在步骤(d)中的检测在步骤(b)及步骤(C)期间按各个预定时间间隔实施。优选地，在进行杂交之后切割反应温度与杂交的温度相同。选择性地，在进行杂交之后切割反应温度与杂交的温度相比可低或高。例如，在杂交温度与酶活性的最佳温度不同的情况下，可根据最佳酶反应来调节杂交之后切割反应温度。杂交及切割反应之间的温度差优选为±20°C的范围，更优选为±10°C的范围，进而优选为±5°C的范围。根据本发明的优选实例，外切核酸反应是在进行杂交之后在恒定的反应温度下以规定的反应时间期间实施的等温反应(isothermal reaction)。
外切核酸反应的反应时间优选为2小时以下，更优选为I小时以下，进而优选为30分钟以下。 根据本发明的优选实例，单一标记为荧光分子。优选地，在固定化探针上的单一标记位于探针的5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-5核苷酸的位点。最优选地，在固定化探针上的单一标记位于探针的5’ -末端。具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的酶为非-热稳定性外切核酸酶或者热稳定性外切核酸酶。可利用如T7外切核酸酶及λ (Lambda)外切核酸酶一样具有5’一 3’外切核酸酶活性的非-热稳定性酶。具有5’ 一3’外切核酸酶活性的酶优选为热稳定性外切核酸酶，更优选为具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶(例如，E.coli DNA聚合酶1、热稳定性DNA聚合酶及噬菌体T7DNA聚合酶)，最优选为热稳定性DNA聚合酶。根据本发明的优选实例，步骤(a)中还包含上游引物或者探针，上述上游引物与固定化探针的杂交位点(hybridized site)的下游位点进行杂交。根据本发明的优选实例，本发明的方法利用于靶核酸序列的定量检测。优选地,祀核酸序列为预-扩增的(pre-amplified)核酸序列。根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述固定化探针包含至少两种探针。根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。II1.在固相基质上利用单一标记探针及反复性外切核酸反应或者外切核酸反应的靶检测用试剂盒

根据本发明的另一实施方式，提供一种在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，包含:(a)固相基质；(b)固定化探针，其包含:核苷酸序列，与上述靶核酸序列互补，单一标记，用于产生可检测的信号，上述固定化探针通过其3’ -末端在固相基质上实现固定化；以及(c)酶，其具有5’ 一 3’外切核酸酶活性。本发明的试剂盒是为了实施本发明的上述检测方法而构成的，为了避免本说明书的过度复杂性，故省略试剂盒和检测方法的共同内容。本发明的试剂盒可选择性地包含在实施靶扩增聚合酶链式反应(PCR)(例如，聚合酶链式反应)时所需的如缓冲液、DNA聚合酶辅因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等试齐U。选择性地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液、试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。并且，本发明的试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组反应时所需的试剂。熟知本说明书的公开事项的本领域的技术人员能够容易地决定在特定反应中所使用的试剂的最佳量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示的组成成分的额外的包装或者组分(compartment)而制备。对本发明的特征及优点如下进行概括:(a)在本发明中，在固相利用单一标记系统可检测靶核酸序列。对于探针设计及制备而言，利用单一标记探针的本发明与如双重标记法的多重标记系统相比，在方便性及有成本效益方面具有非常卓越的优点。
(b)如上所述，在本发明中，在所有通过探针与靶序列之间的杂交及酶反应(5’ 一 3’外切核酸酶)的探针切割中依赖性地引起表示靶核酸序列的信号减少。因此，双重性地决定本发明的靶特异性，以能够克服在以往探针技术中出现的非-特异性杂交引起的假阳性信号问题。(c)本发明的一种特征在于，通过从探针分离出单一标记分子，来测定固相基质上实施的信号减少，由此检测靶核酸序列。现有方法为了判定靶核酸序列的存在，通常测定或者分析在固相基质上实施的信号产生(即，信号增加)。因此，现有方法需要双重标记系统或者在单一标记系统中需要追加的标记成分(例如，标记的ddNTP或者追加的标记探针)。(d)利用反复性外切核酸反应的本发明的优选实例确保靶核酸序列和在固相基质上实现固定化的探针之间的更为有效的杂交，并且以更为可靠而迅速的方式引起表示靶核酸序列的信号减少的扩增。如实施例所公开，利用反复性外切核酸反应的本发明的实例与利用外切核酸反应相比，呈现出更迅速的信号变化(例如，信号减少)。(e)本发明测定在反应结束点的最终信号减少的变化或者反应期间的信号减少的变化。通过测定反应期间的信号减少的变化，来实现靶核酸序列的更准确的定性分析及定量分析。(f)在本发明中，为了检测靶核酸序列，以时间-经过方式测定通过外切核酸反应的信号减少的变化。上述时间-经过测定不仅有助于靶核酸序列的更可靠的检测，而且也有助于定性检测。(g)利用单一标记系统的本发明解决了利用双重标记系统的以往技术中出现的问题。根据利用双重标记系统的以往技术，在以往技术中，应考虑外切核酸酶作用范围、反应后在固相基质上的报道分子的残余及报道分子和猝灭分子之间的猝灭效率，再决定探针上的报道分子及猝灭分子的位点。但是，本发明无需考虑这种因素。并且，因报道分子和猝灭分子之间的不稳定的猝灭而产生的本底信号，致使以往技术难以实现。相反，本 发明完全克服这种本底信号的问题。(h)在利用热稳定性5’ 一3’外切核酸酶的情况下，在严格性强(highstringency)的温度下可实施杂交步骤,使得探针与祀核酸序列之间的杂交特异性得以提高。并且，可通过利用热稳定性5’ 一 3’外切核酸酶，来反复进行改性及杂交，由此以更为有效的方法诱导信号减少。下面，将通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于更加具体说明本发明，根据本发明的宗旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例实施例1:利用在固相基质的表面上实现固定化的单一标记探针及反复性外切核酸反应的靶核酸序列的检测本发明者为了在固相中检测靶核酸序列，应用了反复性外切核酸反应及单一标记探针。为了实现这些应用，将金黄色葡萄球菌(SA, Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸用作模板。利用位于探针的3’ -末端的氨基，将在5’ -末端具有荧光报道分子(TAMRA)及作为连接肽的聚(T) 5的探针固定于固相基质的表面。将在5’ -末端具有荧光分子(TAMRA)的标记探针作为位点标记固定于固相基质的表面。将具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶利用于5’ 一 3’外切核酸反应。在本实施例中所利用的合成模板、单一标记探针及标记的序列如下:SA_T705，-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’ (SEQ ID NO:1)SA_Con5，-[TAMRA]CATTCCGTGGTCAATCATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[Amino]-3， (SEQ ID N0:2)Marker5，-[TAMRA]ATATATATAT[Amino]-3’(SEQ ID NO:3)将NSB9N-轻基琥拍酰亚胺(NHS, N-Hydroxysuccinimide)载玻片(NSB浦项科技有限公司，韩国:NSB POSTECH，Korea)利用于探针(SEQ ID NO:2及3)的制备。利用PersonalArrayer 16 微陈列测位仪(Microarray Spotter)(博奥生物，中国:CapitalBio,China)在NSB9N-羟基琥珀酰亚胺载玻片上印刷了利用NSB测定点位缓冲液(NSB spottingbuffer)溶解成最终浓度为50 μ M的各个探针。将上述探针以2 X I格式(双重点(duplicatespots))并行了测定点位(spotting),将如此制备的微阵列在约85%湿度的腔室培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的多个探针，在37°C下，用含有2XSSPE (0.3M氯化钠(sodium chloride)、0.02M 憐酸氢钠(sodium hydrogen phosphate)及 2.0mM 乙二胺四乙酸(EDTA, Ethylene Diamine Tetraacetic Acid))及 7.0mM 十二烧基硫酸钠(SDS, Sodiumdodecyl sulfate)的pH7.4缓冲溶液，清洗上述载玻片30分钟之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，对上述DNA-功能化(DNA-functionalized)的载玻片进行干燥,保管在4°C的暗室内以备后用。

以含有对于金黄色葡萄球菌的合成寡核苷酸(SEQ ID NO:1)10pmole、10X反应缓冲液(5mM MgCl2)3 μ 1、各50 μ M dNTPs及Taq DNA聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国:Solgent，Korea) 2单元的30 μ I的最终体积,在DNA-功能化的(DNA-functionalized)载玻片的表面上实施了反复性外切核酸反应。将上述整体混合物应用于组装在交联(ciOss-linked)了上述多个探针的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。利用原处(in situ)块方式使载玻片位于热循环仪(基因扩增仪B4I,中国:Genepro B4I, China)。为了分析反复性外切核酸反应期间的各个循环而制备了 5个相同的载玻片。如下实施反复性外切核酸反应:在95°C下进行2分钟初始改性，在95 °C下进行20秒钟的反应过程，在55 °C下进行20秒钟的反应过程，如此循环0、5、10、30或者50次。按各个循环数进行反应之后，利用共聚焦激光扫描仪Axon Genepi X 4100A (分子器件，美国:Molecular Device, USA),并通过 10-μπι 像素分辨率的扫描获取了各个载玻片的图像。利用定量的微阵列分析软件GenePix软件(分子器件，美国:Molecular Device，USA)分析了荧光强度。去除周边本底后用点-中央值表示荧光强度。为了勘察再现性，按每两个点进行测定点位。用2个点的平均值表示了荧光强度。如图2a以及图2b所示，在模板的存在下利用单一标记固定化探针时，荧光信号随着循环的数量而被减少(O循环_RFU:65, 471 土 1.41 ；5循环_RFU:25375±534.57 ；10循环_1^^:16, 745±863.38 ；30 循环 _RFU:9444±247.49 ;及 50 循环 _RFU:5703±608.11)。作为阴性对照组在无模板的情况下，没有随着循环数而产生的荧光信号的变化(O循环_RFU:65471±0.00 ；5 循环 _RFU:65462±0.00 ；10 循环 _RFU:62226±9.90 ；30 循环 _RFU:65454±0.0O ;及 50 循环 _RFU:64699±1071.91)。实施例2:利用在固相基质的表面上实现固定化的单一标记探针及外切核酸反应的靶核酸序列的检测本发明者为了在固相中检测靶核酸序列，应用了外切核酸反应及单一标记探针。为了实现这些应用，将金黄色葡萄球菌基因的合成寡核苷酸用作模板。利用位于探针的3’ -末端的氨基，将在5’ -末端具有荧光报道分子(TAMRA)及作为连接肽的聚(T)5的探针固定于固相基质的表面。将在5’-末端具有荧光分子(TAMRA)的标记探针作为位点标记固定于固相基质的表面。将具有5’一 3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶利用于5’一 3’外切核酸反应。在本实施例中所利用的合成模板、单一标记探针及标记的序列与实施例1中利用的序列相同。将NSB9N-羟基琥珀酰亚胺载玻片(NSB浦项科技有限公司，韩国:NSB POSTECH,Korea)利用于探针(SEQ ID NO:2及3)的制备。利用PersonalArrayer 16微陈列测位仪(博奥生物，中国:CapitalBio，China)在NSB9N-羟基琥珀酰亚胺载玻片上印刷了利用NSB测定点位缓冲液溶解成最终浓度为50 μ M的各个探针。将上述探针以2Χ I格式(双重点)并行了测定点位，将如此制备的微阵列在约85%湿度的腔室培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的多个探针，在37°C下，用含有2XSSPE(0.3M氯化钠、0.02M磷酸氢钠及2.0mM乙二胺四乙酸)及7.0mM十二烷基硫酸钠的pH7.4缓冲溶液，清洗上述载玻片30分钟之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，对上述DNA-功能化的载玻片进行干燥，保管在4 C的暗室内以备后用。以含有对于金黄色葡萄球菌的合成寡核苷酸(SEQ ID NO:1) lOpmole、10X反应缓冲液(6mM MgCl2) 3 μ 1、各200 μ M dNTPs及钻星(Diastar) Taq DNA聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国:Solgent，Korea) 1.2单元的30 μ I的最终体积，在DNA-功能化的载玻片的表面上实施了外切核酸反应。将上述整体混合物应用于组装在交联了上述多个探针的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。利用原处块方式使载玻片位于热循环仪(基因扩增仪Β4Ι，中国:Genepro B4I, China)。为了分析外切核酸反应期间的预定的时间间隔(predeterminedtime interval)分析而制备了 6个相同的载玻片。在95°C下进行2分钟初始改性之后，以时间-依赖性方式，如下实施外切核酸反应:在55°C下进行O分钟、I分钟、5分钟、20分钟、30分钟或60分钟的反应过程。按各个指定时间培养进行反应之后，利用共聚焦激光扫描仪Axon Genepix4100A (分子器件,美国:Molecular Device, USA),并通过 10-μπι 像素分辨率的扫描获取了各个载玻片的图像。利用定量的微阵列分析软件GenePix软件(分子器件，美国:Molecular Device，USA)分析了荧光强度。去除周边本底后用点-中央值表示荧光强度。为了勘察再现性，按每两个点进行测定点位。用2个点的平均值表示了荧光强度。如图3a及图3b所示，在模板的存在下利用单一标记固定化探针时，荧光信号随着培养时间而被减少(O 分钟 _RF U:65, 449±11.3 ；1 分钟_RFU:56576±4471.0 ;5 分钟_RFU:29603±1，547.9 ；20 分钟 _RFU:16, 171±206.5 ；30 分钟 _RFU:10540±47.4 ;及 60 分钟 _RFU:5889± 100.4)。作为阴性对照组在无模板的情况下，没有随着培养时间而产生的荧光信号的变化(O 分钟 _RFU:65464±0.7 ;1 分钟 _RFU:65433± 1.4 ;5 分钟_RFU:65444± 1.4 ；20 分钟 _RFU:65443± 1.4 ；30 分钟 _RFU:65426± 1.4 ;及 60 分钟 _RFU:65449±0.7)。
实施例3:通过反复性外切核酸反应进行的各个不同数量靶核酸序列的检测本发明者为了在固相中检测3种不同数量的靶核酸序列，应用了反复性外切核酸反应及单一标记探针。为了实现这些应用，金黄色葡萄球菌基因的合成寡核苷酸用作模板。利用位于探针的3’-末端的氨基，将在5’-末端具有荧光报道分子及作为连接肽的聚(T)5的探针固定于固相基质的表面。利用位于标记探针的3’ -末端的氨基,将在5’ -末端具有突光分子的作为位点标记的标记探针固定于固相基质的表面。将具有5’ → 3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶利用于5’→ 3’外切核酸反应。在本实施例中所利用的合成模板、单一标记探针及标记的序列与实施例1中利用的序列相同:将NSB9N-羟基琥珀酰亚胺载玻片(NSB浦项科技有限公司，韩国:NSB POSTECH,Korea)利用于探针(SEQ ID NO:2及3)的制备。利用PersonalArrayer 16微陈列测位仪(博奥生物，中国:CapitalBio，China)在NSB9N-羟基琥珀酰亚胺载玻片上印刷了利用NSB测定点位缓冲液溶解成最终浓度为50 μ M的各个探针。将上述探针以2Χ 1格式(双重点)并行了测定点位，将如此制备的微阵列在约85%湿度的腔室培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的多个探针，在37°C下，用含有2XSSPE(0.3M氯化钠、0.02M磷酸氢钠及2.0mM乙二胺四乙酸)及7.0mM十二烷基硫酸钠的pH7.4缓冲溶液，清洗上述载玻片30分钟之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，对上述DNA-功能化的载玻片进行干燥，保管在4 C的暗室内以备后用。以含有对于金黄色葡萄球菌的合成寡核苷酸(SEQ ID N0:1) 10pmole、lpmole或
0.1pmole 和 1OX 反应缓冲液(5mM MgCl2) 3 μ 1、各 50 μ M dNTPs 及 Taq DNA 聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国:Solgent，Korea) 2单元的30 μl的最终体积，在DNA-功能化的载玻片的表面上实施了反复性外切核酸反应。将上述整体混合物应用于组装在交联了上述探针的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。利用原处块方式使载玻片位于热循环仪(基因扩增仪Β4Ι，中国Kenepro B4I，China)。针对作为实验对象的靶核酸序列的各个含量，利用了 5个载玻片。如下实施反复性外切核酸反应:在95°C下进行2分钟初始改性，在95°C下进行20秒钟的反应过程，在55°C下进行20秒钟的反应过程，如此循环0、5、10、30或者50次。按各个循环数进行反应之后，利用共聚焦激光扫描仪Axon Genepix4100A (分子器件，美国:Molecular Device, USA),并通过10-μ m像素分辨率的扫描获取了各个载玻片的图像。利用定量的微阵列分析软件GenePix软件(分子器件,美国:Molecular Device, USA)分析了荧光强度。去除周边本底后用点-中央值表示荧光强度。为了勘察再现性，按每两个点进行测定点位。用2个点的平均值表示了荧光强度。在模板的存在下利用单一标记固定化探针时，荧光信号随着靶核酸序列的数量而被减少。对本发明的优选实例进行了详细记述，可以进行根据本发明的原理的变形及修改，本发明的范围根据所附的权利要求书及其等同技术方案而定义，这对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
权利要求
1.一种在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤(a)，将上述靶核酸序列与固定化探针进行杂交；上述固定化探针包含:核苷酸序列，与上述靶核酸序列互补，以及单一标记，用于产生能够检测的信号；上述固定化探针通过其3’ -末端在固相基质上实现固定化； 步骤(b)，在切割上述固定化探针的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶相接触；上述固定化探针由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的上述热稳定性酶所切割，使得上述单一标记从上述固定化探针分离，来引起在上述固相基质上实现的信号减少； 步骤(C)，使上述步骤(b)的结果物得到改性； 步骤(d)，至少反复进行两次上述步骤(a)_步骤(C)，进而使上述固相基质上的上述信号减少；以及 步骤(e)，检测上述固相基质上的上述信号减少；通过上述固定化探针的切割而引发的上述信号减少表示上述靶核酸序列的存在。
2.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述检测在上述步骤(d)的反复的结束点实施。
3.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述检测在上述步骤(d)每次反复循环时实施。
4.根据权利要求1所述 的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述检测按上述反复期间的各个预定时间间隔实施。
5.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述单一标记为荧光分子。
6.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述固定化探针上的上述单一标记位于探针的5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-5核苷酸的位点。
7.根据权利要求6所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述固定化探针上的上述单一标记位于探针的5’ -末端。
8.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，具有上述5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶为具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
9.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤(a)中还包含反向引物，上述反向引物用于生成与上述固定化探针进行杂交的上述靶核酸序列。
10.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤(a)中还包含上游引物或者探针，上述上游引物与上述固定化探针的杂交位点的下游位点进行杂交。
11.根据权利要求3或4所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法利用于上述靶核酸序列的定量检测。
12.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
13.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于， 上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列； 上述固定化探针包含至少两种探针。
14.根据权利要求1所述的在固相通过反复性外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
15.一种在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤(a)，将上述靶核酸序列与固定化探针进行杂交；上述固定化探针包含:核苷酸序列，与上述靶核酸序列互补，以及单一标记，用于产生能够检测的信号；上述固定化探针通过其3’ -末端在固相基质上实现固定化； 步骤(b)，在切割上述固定化探针的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’一 3’外切核酸酶活性的酶相接触；上述固定化探针由具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的上述酶所切害IJ，使得上述单一标记从上述固定化探针分离，来引起上述固相基质上实现的信号减少； 步骤(c)，为了对上述步骤(a)及步骤(b)中未被切割的固定化探针进行追加切割，在与上述步骤(b)相同的条件下维持上述步骤(b)的结果物，由此追加地减少上述固相基质上的上述信号；以及 步骤(d)，检测上述固相基质上的上述信号减少；通过上述固定化探针的切割而引发的上述信号减少表示上述靶核酸序列的存在。
16.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述检测在上述步骤(c)的结束点实施。
17.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述检测按上述步骤(b)及步骤(c)期间的各个预定时间间隔实施。
18.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述单一标记为荧光分子。
19.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述固定化探针上的上述单一标记位于探针的5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-5核苷酸的位点。
20.根据权利要求19所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述固定化探针上的上述单一标记位于探针的5’ -末端。
21.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的酶为具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶。
22.根据权利要求21所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述具有5’一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶为具有5’一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
23.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤(a)中还包含上游引物或者探针，上述上游引物与上述固定化探针的杂交位点的下游位点进行杂交。
24.根据权利要求17所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法利用于上述靶核酸序列的定量检测。
25.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
26.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于， 上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列； 上述固定化探针包含至少两种探针。
27.根据权利要求15所述的在固相通过外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
28.—种在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含: (a)固相基质； (b)固定化探针，其包含:核苷酸序列，与上述靶核酸序列互补，以及单一标记，用于产生能够检测的信号；上述固定化探针通过其3’ -末端在固相基质上实现固定化；以及 (c)酶，其具有5’一 3’外切核酸酶活性。
29.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列`的试剂盒，其特征在于，上述具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的酶为具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶。
30.根据权利要求29所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的热稳定性酶为具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
31.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述单一标记为荧光分子。
32.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述固定化探针上的上述单一标记位于探针的5’ -末端或者从5’ -末端隔开1-5核苷酸的位点。
33.根据权利要求32所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述固定化探针上的上述单一标记位于探针的5’ -末端。
34.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包含反向引物，上述反向引物用于生成与上述固定化探针进行杂交的上述靶核酸序列。
35.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包含上游引物或者探针，上述上游引物与上述固定化探针的杂交位点的下游位点进行杂交。
36.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒利用于上述靶核酸序列的定量检测。
37.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包含扩增引物，上述扩增弓I物用于扩增上述靶核酸序列。
38.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述固定化探针包含至少两种探针。
39.根据权利要求28所述的在固相通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，上述固定化探针包含与核苷酸变异互补的核苷酸或者相当 于核苷酸变异的核苷酸。
全文摘要
本发明涉及一种在固相利用单一标记固定化探针且通过反复性外切核酸反应或者外切核酸反应检测靶核酸序列的新颖的方法。在本发明中，能够利用单一标记系统在固相检测靶核酸序列。对于探针设计及制备而言，利用单一标记探针的本发明与如双重标记法的多重标记系统相比，在方便性及有成本效益方面具有非常卓越的优点。并且，在本发明中反应期间的信号减少变化测定会引发更加准确的靶核酸序列的定性分析及定量分析。
文档编号G01N33/52GK103119175SQ201080069175
公开日2013年5月22日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年9月20日
发明者千钟润, 李荣祚 申请人:Seegene株式会社