专利名称：生脉注射液中微量蛋白的测定方法
技术领域：
本发明涉及药物分析技术领域，具体是一种测定生脉注射液中微量蛋白的方法。
背景技术：
生脉注射液是临床应用多年的中药注射剂，主要用于治疗感染性休克、心源性休克和心肌梗塞等。生脉注射液临床不良反应包括过敏性皮疹、接触过敏性皮炎、腹胀、低血压、心动过速等，其中过敏反应发生率最高。引起生脉注射液过敏反应的原因很多，而蛋白等大分子物质是主要的致敏原。目前，检测过敏反应的方法一般采用动物试验的方法，例如用豚鼠、大鼠试验等。但这类试验至少有2个缺陷1.检测周期过长，不适于中间体的测定； 2.灵敏度低，对产品中含有潜在致敏危险的微量蛋白无法检出。鉴于以上情况，急需一种灵敏度高，可以快速测定生脉注射液中微量蛋白的方法， 以监控生脉注射液生产过程中的质量，防止临床使用中的过敏反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高，可以快速测定生脉注射液中微量蛋白的方法。本发明的目的是通过采用以下技术方案来实现的
具体地说，本发明采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定生脉注射液中微量蛋白的方法， 操作步骤如下
1.制备生脉抗原取人参、麦冬、五味子适量，加水提取，过滤，滤液加入乙醇，收取沉淀物，冻干，制得生脉抗原；
2.抗生脉抗原抗体的制备用生脉抗原免疫家兔制备兔抗生脉抗原抗体；
3.酶联免疫吸附试验(ELISA)采用酶联免疫吸附试验法测定生脉注射液中的微量蛋白。
生脉抗原的制备中，原药材人参、麦冬、五味子的质量比为10:32. 1:15.6。优选操作方法如下
1.制备生脉抗原取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮回流提取，回流液过滤，滤液用乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原；
2.抗生脉抗原抗体的制备抗原用完全福氏佐剂初次免疫后，用不完全佐剂新西兰兔足趾内或皮下多点注射，剂量以所含蛋白计为0.5-5mg/只。数次免疫后新西兰兔动脉采血，分离血清合并，封装，10-20°C冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体；
3.酶联免疫吸附试验(ELISA)
称取生脉抗原:3mg-15mg，加包被液配制为2-50mg/ml储存液备用。用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为100 μ g/ml-2ug/ml浓度范围，100 μ 1/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100 μ 1包被。4°C湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2-3遍，拍干；用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液溶液，pH7.4)封闭 10-15分钟；弃去溶液，加入100 μ 1 1 100稀释的兔抗生脉血清(一抗)1-3小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加入100 μ 1 1 3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗，磷酸盐缓冲溶液稀释)避光室温孵育1-3小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加100 μ 1邻苯二胺/过氧化氢(0PD/H202)底物磷酸缓冲液，临用前10-15分钟配制称取10-15mg邻苯二胺，用10_15ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10 μ 1 过氧化氢，混勻，每孔加100 μ 1进行显色。显色适当后，加100 μ 1的2mol · L硫酸终止反应，用酶标仪在490 nm处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。最佳操作方法如下
1.制备生脉抗原取质量比为10:32. 1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮提取 1-4小时，或回流10-180分钟，回流液过滤，滤液用45%-85%乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原。2.抗生脉抗原抗体的制备抗原用完全福氏佐剂配制，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行初次免疫，剂量以所含蛋白计为0. 5-3mg/只。2-3周后用不完全福氏佐剂配制抗原，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行1-4次免疫，新西兰兔耳中动脉采血Ι-aiil，分离血清，测定抗体滴度，如果抗体稀释度小于10_5时，仍然呈现阳性反应，则一周后加强免疫一次，再一周后新西兰兔颈总动脉采血，分离血清合并，封装，20°C冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体。3.酶联免疫吸附试验(ELISA)称取生脉抗原5mg_10mg，加包被液(0. 05mol. L—1 碳酸盐缓冲液，PH9.6)配制为5-20mg/ml储存液备用。用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为80 μ g/ml-10 μ g/ml浓度范围，100 μ 1/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100 μ 1包被。4°C湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2遍， 拍干；用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液溶液，pH 7. 4 )封闭10分钟；弃去溶液，加入ΙΟΟμΙ 1 100稀释的兔抗生脉血清(一抗)2小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干；加入100 μ 1 1 :3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗，磷酸盐缓冲溶液稀释)避光室温孵育2小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干； 加100μ 1邻苯二胺/过氧化氢(0PD/H202)底物磷酸缓冲液，临用前10分钟配制称取IOmg 邻苯二胺，用IOml磷酸缓冲液溶解，临用前加10 μ 1过氧化氢，混勻，每孔加100 μ 1进行显色。显色适当后，加100 μ 1的2mol · L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm处记录吸收度。 以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。生脉抗原系以生脉药材为原料，生产中醇沉工艺不彻底得到的残留物。由于醇沉工艺的主要目的是去除植物蛋白，得到的残留物又能与特异的Bradford蛋白反应试剂作用，提示制备的生脉抗原主要为残留的植物蛋白。经SDS电泳分析抗原是多种残留蛋白混合物。三味中药材中五味子抗原的蛋白含量最高，达到19.7%，红参次之约为8.0%，麦冬最少，仅为5. 4%。生脉抗原的蛋白含量约为11.标准曲线的建立，检测限及定量限的确定以J490 nm值为横坐标，抗原浓度的对数值为纵坐标，非线性四参数回归方程为 Y= (0. 147-2. 097)/(1+(χ/16. 247) L238) +2. 097，r2=0. 999。在 2. 0-30. 0 μ g · mL_1 呈明显线性，分别按照阴性平均值+3倍标准偏差和阴性平均值+10倍标准偏差(/7=12，重复次数=10)计算方法的检测限和定量限约为0.566和1.431yg ^mr1 (见表1)。由于所制备的生脉抗原的蛋白含量约为10%，因此本发明对抗原活性杂质的检测限和定量限应低于 0. 566μ g · ml-1 禾口 1. 431 μ g · ml-1。
表1. ELISA检测法的检测限及定量限
权利要求
1.一种生脉注射液中微量蛋白的测定方法，包括如下操作步骤(1)制备生脉抗原取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮回流提取，回流液过滤，滤液用乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原；(2)抗生脉抗原抗体的制备抗原用完全福氏佐剂初次免疫后，用不完全佐剂新西兰兔足趾内或皮下多点注射，剂量以所含蛋白计为0. 5-5mg/只；数次免疫后新西兰兔动脉采血，分离血清合并，封装，10-20°C冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体；(3)酶联免疫吸附试验称取生脉抗原:3mg-15mg，加包被液配制为2-50mg/ml储存液备用；用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为100 μ g/ml - 2ug/ml浓度范围，ΙΟΟμΙ/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100 μ 1包被；4°C湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2-3遍，拍干；用5%小牛血清溶液封闭 10-15分钟；弃去溶液，加入100 μ 1 1 100稀释的兔抗生脉血清1-3小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加入100 μ 1 1 3000辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G溶液避光室温孵育1-3小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加100 μ 1邻苯二胺 /过氧化氢底物磷酸缓冲液，临用前10-15分钟配制称取10-15mg邻苯二胺，用10_15ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10 μ 1过氧化氢，混勻，每孔加100 μ 1进行显色；显色适当后，加100 μ 1的2mol · L硫酸终止反应，用酶标仪在490 nm处记录吸收度；以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟，根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤(1)水煮提取1-4小时，所用乙醇浓度为45-85%。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤(1)回流10-180分钟，所用乙醇浓度为45-85%。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤(2)新西兰兔足趾内或皮下注射免疫，剂量以所含蛋白计为0. 5-;3mg/只。
全文摘要
本发明公开了生脉注射液中微量蛋白的测定方法，该方法包括水提取醇沉淀法制备抗原；家兔免疫法制备抗生脉抗原血清并进一步纯化制备抗体；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定生脉注射液中的微量蛋白含量。本发明解决了生脉注射液中微量蛋白含量无法快速检测的难题，对提高生脉注射液产品的质量，防止临床过敏反应具有重要意义。
文档编号G01N33/543GK102175854SQ20111000287
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者戴德玲, 林爱琴, 欧阳强, 王光凤 申请人:江苏苏中药业集团股份有限公司