专利名称：苯并芘金标检测试纸及其制备方法以及检测试纸盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及粮油、水体以及肉类制品中苯并芘(BaP)含量的检测，具体涉及一种苯并芘金标检测试纸及其制备方法以及检测试纸盒，属于生物工程产品技术领域。
背景技术：
目前已经检查出的400多种主要致癌物中，一半以上属于多环芳烃类化合物。苯并芘(BaP)是由一个苯环和一个芘分子结合而成的多环芳烃类化合物，是多环芳烃类化合物中的一种具有明显致癌作用的有机化合物，是一种强致癌物。苯并芘释放到大气中以后， 总是和大气中各种类型微粒所形成的气溶胶结合在一起，在8 μ m以下的可吸入尘粒中，吸入肺部的比率较高，经呼吸道吸入肺部，进入肺泡甚至血液，导致肺癌和心血管疾病。根据国家《食用植物油卫生标准》，食用油中苯并芘含量的最高上限为10μ g/kg， 而国家质检总局此前关于湖南省部分茶油的抽检结果显示，苯并芘含量已达到60 μ g/kg， 为最高上限的6倍。因此，建立快速方便的苯并芘检测方法至关重要。目前，苯并芘的检测方法主要是色谱分析法，包括薄层层析、液相色谱法、气相色谱法以及气相-质谱联用等。色谱法虽然准确性较高，但是仪器昂贵、对操作人员技术水平要求高、样品前处理复杂、耗时，不利于现场快速检测。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种成本低、可快速检测样品中苯并芘含量是否超标的金标检测试纸。为此，本发明还提供一种该金标检测试纸的制备方法以及使用该金标检测试纸的检测试纸盒。本发明提供的一种苯并芘金标检测试纸，在试纸条背衬上依次粘贴有样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜及吸水纸；所述样品垫为注样区，所述玻璃纤维膜为反应区，所述硝酸纤维素膜为测试区，所述吸水纸为吸水区；所述硝酸纤维素膜处于所述背衬上的最下一层，其两端分别搭接有所述玻璃纤维膜及所述吸水纸，所述玻璃纤维膜上搭接有所述样品垫；所述玻璃纤维膜上吸附有胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物，所述硝酸纤维素膜上从反应区到吸水区方向依次喷涂有苯并芘-卵清蛋白作检测线、羊抗兔IgG作质控线，再用牛血清白蛋白封闭所述硝酸纤维素膜。进一步地，所述试纸条背衬采用聚氯乙烯或聚乙烯，厚度为100 μ m ；所述硝酸纤维素膜的厚度为120 μ m，蛋白质负载量为5-20 μ g/cm2 ；所述试纸条的尺寸为(55-65) mmX (3-5) mm,所述检测线及所述质控线的宽度为0. 5-lmm ；所述胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物的浓度为0. 5-2 μ g/mL，所述苯并芘-卵清蛋白的浓度为100-500 μ g/mL，所述羊抗兔IgG的浓度为50-200 μ g/mL，所述牛血清白蛋白的浓度为1%。本发明提供的一种苯并芘金标检测试纸盒，包括盒壳体，所述盒壳体内封装有所述试纸条，所述盒壳体上开有注样孔及观察孔，所述注样孔的位置对应于所述试纸条的样品垫，所述观察孔的位置对应于所述试纸条的硝酸纤维素膜。
进一步地，所述注样孔的形状为椭圆形，所述观察孔的形状为矩形。本发明提供的一种苯并芘金标检测试纸的制备方法，包括以下步骤
1、将苯并芘与牛血清白蛋白偶联，作为免疫抗原，用该免疫抗原免疫获得苯并芘多克隆抗体；在氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液制得胶体金溶液；将苯并芘多克隆抗体加入胶体金溶液中，制得胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物，并用磷酸盐缓冲液稀释到 0.5-2 μ g/mL ；
2、将苯并芘与卵清蛋白偶联，作为检测抗原，该检测抗原用磷酸盐缓冲液稀释到 100-500 μ g/mL ；
3、羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液稀释到50-200μ g/mL ；
4、将玻璃纤维膜浸泡在上述胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物中10-20分钟后烘
干；
5、在硝酸纤维素膜上喷涂上述苯并芘-卵清蛋白作检测线，喷涂上述羊抗兔IgG作质控线，再用牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜，并烘干；
6、在试纸条背衬的测试区粘贴上述硝酸纤维素膜；在背衬的反应区粘贴上述玻璃纤维膜，并使玻璃纤维膜搭接在硝酸纤维素膜上；在背衬的注样区粘贴样品垫，并使样品垫搭接在玻璃纤维膜上；在背衬的吸水区粘贴吸水纸，并使吸水纸搭接在硝酸纤维素膜上。本发明采用金标检测法，通过金标检测试纸上的检测线和质控线的变色情况来确定样品中苯并芘的含量是否超标，本发明不需要大型检测仪器，样品不需前期处理，试纸条及试纸盒制作方便、成本低，检测快速、准确、明显、灵敏度高。
图1为本发明中的金标检测试纸的结构示意图。图2为本发明中的金标检测试纸盒的结构示意图。图3为本发明中的金标检测试纸盒的检测结果示意图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步的说明。图广图3中，包括试纸条1、试纸条背衬2、玻璃纤维膜3、硝酸纤维素膜4、检测线 5、质控线6、吸水纸7、注样孔8、观察孔9、盒壳体10、样品垫11等。如图1所示，是一种苯并芘金标检测试纸，该试纸条1包括采用厚度为100 μ m的聚氯乙烯或聚乙烯制成的试纸条背衬2，试纸条1的尺寸为(55-65)mmX (3_5)mm。在试纸条背衬2上依次粘贴有样品垫11、玻璃纤维膜3、硝酸纤维素膜4及吸水纸7，样品垫11为注样区，玻璃纤维膜3为反应区，硝酸纤维素膜4为测试区，吸水纸7为吸水区；样品垫11 与玻璃纤维膜4、硝酸纤维素膜4与玻璃纤维膜3、硝酸纤维素膜4与吸水纸7的连接处设置有重叠区，硝酸纤维素膜4处于背衬2上的最下一层，其两端分别搭接有玻璃纤维膜3及吸水纸7，玻璃纤维膜3上搭接有样品垫11，样品垫11重叠在玻璃纤维膜3上、玻璃纤维膜 3重叠在硝酸纤维素膜4上，吸水纸7重叠在硝酸纤维膜4上。玻璃纤维膜3上吸附有胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物，胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物的浓度为0. 5-2 μ g/mL,硝酸纤维素膜4上从反应区到吸水区方向依次喷涂有浓度为100-500 μ g/mL的苯并芘-卵清蛋白(BaP-OVA)作检测线5、浓度为50-200 μ g/mL的羊抗兔IgG作质控线6。硝酸纤维素膜4的厚度为120 μ m，蛋白质负载量为5-20 μ g/cm2 ；检测线5及质控线6的宽度为0. 5-lmm ；再用牛血清白蛋白(BSA)封闭硝酸纤维素膜4。如图2所示，是使用如图1所示的试纸条1制成的一种苯并芘金标检测试纸盒，包括盒壳体10，盒壳体10内封装有试纸条1，盒壳体10上开有注样孔8及观察孔9，注样孔8 的位置对应于试纸条1的样品垫11，观察孔9的位置对应于试纸条1的硝酸纤维素膜4。注样孔8与观察孔9的形状可以为任意一种形状，本实施例中，注样孔8的形状为椭圆形，观察孔9的形状为矩形。本发明中的检测试纸盒的使用方法如下将检测样品滴入注样孔8中，稍许，即可在观察孔9中观察到试纸条1上的检测线5和质控线6的变色情况，确定样品中苯并芘含量是否超标。如果检测线5和质控线6都呈红色，则样品中苯并芘含量未超标；如果检测线 5不变色，仅质控线6变色，则样品中苯并芘含量超标。本发明采用金标检测法，通过金标检测试纸上的检测线和质控线的变色情况来确定样品中苯并芘的含量是否超标，用于检测粮油、水体以及肉制品中苯并芘的含量，与现有的检测方法相比，本发明不需要大型检测仪器，样品不需前期处理，试纸条及试纸盒制作方便、成本低，检测快速、准确、明显、灵敏度高。如图1所示的试纸条1的一种制备方法，包括以下步骤 1、免疫抗原5-氨基-3，4-苯并芘-牛血清白蛋白的合成 1)5-硝基_3，4-苯并芘的合成
50mg苯并芘先以少量的苯溶解，再加入5-8mL乙酸，然后加入硝酸溶液50-100 μ L硝化。混勻静置反应，溶液首先变成暗紫红色，然后逐渐变浅至橙色。反应过程中有黄色结晶析出。结晶析出完全后冷却，收集结晶即得产物。2) 5-氨基-3，4-苯并芘的合成
上述制得的硝基苯并芘溶于10-20mL的冰乙酸中，加入含20-30g氯化亚锡的盐酸溶液，将此混合液回流。在此过程中，橙黄色悬液变成浅黄色溶液。加入500-1000 μ L浓盐酸， 形成大量微小的黄色沉淀。冷却圆底烧瓶，加入水以使沉淀完全。用稀盐酸和乙酸混合液洗涤后，混合物溶于2-5mL氨水，室温下搅拌10-30min。加入苯萃取，干燥。石油醚重结晶。3) 5-氨基-3，4-苯并芘-牛血清白蛋白偶联物的合成
将;3mg 5-氨基-3，4-苯并芘溶解于500-1000 μ L 0. 01mol/L碳酸盐缓冲液中 (pH9. 6)，将6-10mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于l_3mL 0. Olmol/L碳酸盐缓冲液中，将两种溶液混合均勻，再加入碳化二亚胺(EDC)溶液ImL (1. 5mgEDC溶解于ImL 0. 01mol/L碳酸盐缓冲液中)，混合均勻，室温反应2小时。将溶液移入透析袋中，4°C，0. Olmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中透析，透析好后的溶液分装，_20°C保存。2、苯并芘(BaP)多克隆抗体的制备 1)动物免疫
取雄性新西兰大白兔，体重1.5-2 kg。免疫前一周从耳缘静脉采血作阴性对照。初次免疫用Img BaP-BSA与等量的完全弗氏佐剂乳化完全，进行背部多点皮下注射。一个月后进行第一次加强免疫，用Img BaP-BSA与等量的不完全弗氏佐剂乳化完全，进行四肢内部肌
5肉注射。以后每隔2周加强免疫1次，方法同前。2)抗体的制备
效价合格后，兔颈动脉采血。将采集的血液于室温下静置，待血液凝集后放入37°C保温箱静置1 h，4°C静置过夜后，4°C、3000 r/min离心20 min后，得上清液即为抗血清。抗血清再用33%以及50%的硫酸铵分级沉淀。4°C，0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中透析，得到苯并芘(BaP)多克隆抗体。3、抗体与胶体金结合物的制备 1)胶体金的制备
用新制双蒸水配制IOOmL 0.01%氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸(110°C左右)，在lOOr/min磁力搅拌下，迅速加入预先在37°C保温的1%柠檬酸三钠溶液4. 5mL，保持温度和转速不变，继续搅拌加热15min左右，直至溶液呈现清亮的酒红色。室温冷却，4 °C冰箱保存备用。2)抗体的准备
标记前抗体用葡聚糖凝胶(S^hadex) G-25脱盐。3)抗体与胶体金结合物的制备
取纯化好的抗体加入胶体金溶液中，体积比为1:50，总浓度为30-45 μ g/mL，室温搅拌均勻。加入10%BSA，终浓度为0. 4%，再加入10%PEG (MW20000),终浓度为0. 2%，室温搅拌均勻。加入与胶体金-抗体结合物溶液同体积的10%NaCl，静置1小时。12000r/min离心 60min，沉淀溶解于适量0. 01mol/L PBS中，用0. 45 μ m滤膜过滤，终浓度为20-25 μ g/mL。 用0. 01mol/L PBS稀释到所需浓度0. 5-2 μ g/mL，用于浸泡玻璃纤维膜使之吸附。4、检测抗原5-氨基-3，4-苯并芘-卵清蛋白的合成
合成方法与免疫抗原相同，所用偶联蛋白为卵清蛋白(0VA)。产物同样以O.Olmol/L PBS透析，分装保存于-20°C。用0. 01mol/L PBS稀释到所需浓度100-500 μ g/mL，用于喷涂检测线。5、羊抗兔 IgG
羊抗兔IgG为市售产品，购买于上海华美试剂公司。羊抗兔IgG用O.Olmol/L PBS稀释到所需浓度50-200 μ g/mL，用于喷涂质控线。6、试纸条的组装
用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬，在背衬上先将干燥好的硝酸纤维素膜粘贴在相应位置， 再将吸水纸和干燥好的玻璃纤维膜(吸附有胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物)粘贴在相应位置并稍微压住硝酸纤维素膜，最后将样品垫粘好并压住玻璃纤维膜，吸水纸粘好并压住硝酸纤维膜上，即制得苯并芘金标检测试纸。
权利要求
1.一种苯并芘金标检测试纸，在试纸条背衬(2)上依次粘贴有样品垫(11)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维素膜(4)及吸水纸(7)；所述样品垫(11)为注样区，所述玻璃纤维膜(3) 为反应区，所述硝酸纤维素膜(4)为测试区，所述吸水纸(7)为吸水区；所述硝酸纤维素膜 (4)处于所述背衬(2)上的最下一层，其两端分别搭接有所述玻璃纤维膜(3)及所述吸水纸(7)，所述玻璃纤维膜(3)上搭接有所述样品垫(11)，其特征是所述玻璃纤维膜(3)上吸附有胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物，所述硝酸纤维素膜(4)上从反应区到吸水区方向依次喷涂有苯并芘-卵清蛋白作检测线(5)、羊抗兔IgG作质控线(6)，再用牛血清白蛋白封闭所述硝酸纤维素膜(4)。
2.按照权利要求1所述的苯并芘金标检测试纸，其特征是所述试纸条背衬(2)采用聚氯乙烯或聚乙烯，厚度为100 μ m。
3.按照权利要求1所述的苯并芘金标检测试纸，其特征是所述硝酸纤维素膜4的厚度为120 μ m，蛋白质负载量为5-20 μ g/cm2。
4.按照权利要求1所述的苯并芘金标检测试纸，其特征是所述试纸条(1)的尺寸为 (55-65) mmX (3-5) mm，所述检测线(5)及所述质控线(6)的宽度为0. 5_lmm。
5.按照权利要求1所述的苯并芘金标检测试纸，其特征是所述胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物的浓度为0. 5-2 μ g/mL，所述苯并芘-卵清蛋白的浓度为100-500 μ g/mL, 所述羊抗兔IgG的浓度为50-200 μ g/mL，所述牛血清白蛋白的浓度为1%。
6.一种使用权利要求1所述的苯并芘金标检测试纸制成的检测试纸盒，包括盒壳体 (10)，其特征是所述盒壳体(10)内封装有所述试纸条(1 )，所述盒壳体(10)上开有注样孔(8)及观察孔(9)，所述注样孔(8)的位置对应于所述试纸条(1)的样品垫(11)，所述观察孔(9)的位置对应于所述试纸条(1)的硝酸纤维素膜(4)。
7.按照权利要求6所述的检测试纸盒，其特征是所述注样孔(8)的形状为椭圆形，所述观察孔(9)的形状为矩形。
8.—种权利要求1所述的苯并芘金标检测试纸的制备方法，其特征是，包括以下步骤(1)将5-氨基-3，4-苯并芘与牛血清白蛋白偶联，作为免疫抗原，用该免疫抗原免疫获得苯并芘多克隆抗体；在氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液制得胶体金溶液；将苯并芘多克隆抗体加入胶体金溶液中，制得胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物，并用磷酸盐缓冲液稀释到0. 5-2 μ g/mL ；(2)将5-氨基-3，4-苯并芘与卵清蛋白偶联，作为检测抗原，该检测抗原用磷酸盐缓冲液稀释到 100-500 μ g/mL ；(3)羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液稀释到50-200μ g/mL ；(4)将玻璃纤维膜浸泡在上述胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物中10-20分钟后烘干；(5)在硝酸纤维素膜上喷涂上述苯并芘-卵清蛋白作检测线，喷涂上述羊抗兔IgG作质控线，再用牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜，并烘干；(6)在试纸条背衬的测试区粘贴上述硝酸纤维素膜，在背衬的反应区粘贴上述玻璃纤维膜，并使玻璃纤维膜搭接在硝酸纤维素膜上；在背衬的注样区粘贴样品垫，并使样品垫搭接在玻璃纤维膜上；在背衬的吸水区粘贴吸水纸，并使吸水纸搭接在硝酸纤维素膜上。
全文摘要
本发明涉及一种苯并芘金标检测试纸及其制备方法以及检测试纸盒。本发明的检测试纸，用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬，在背衬上依次粘贴有样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜及吸水纸；样品垫为注样区，玻璃纤维膜为反应区，硝酸纤维素膜为测试区，吸水纸为吸水区；玻璃纤维膜上吸附有胶体金-抗苯并芘多克隆抗体结合物；硝酸纤维素膜上喷涂苯并芘-卵清蛋白作检测线、羊抗兔IgG作质控线，再用牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜。本发明采用金标检测法，通过金标检测试纸上的检测线和质控线的变色情况来确定样品中苯并芘的含量是否超标，本发明不需要大型检测仪器，样品不需前期处理，试纸条及试纸盒制作方便、成本低，检测快速、准确、明显、灵敏度高。
文档编号G01N33/558GK102175857SQ20111002212
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月19日 优先权日2011年1月19日
发明者周智慧, 毛飞君, 王捷, 王欣, 赵晓联, 金萍 申请人:无锡市金坤生物工程有限公司