专利名称：大型蚤类对水质物质急性毒性测定试剂盒及其制作和用法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂，具体是一种利用大型蚤类对水质物质急性毒性进行测定的试剂盒及其制作方法和使用方法。
背景技术：
目前，利用大型蚤类对水质物质急性毒性进行测定试验中使用的试剂，要求生物大型蚤(Daphnia magna)即甲壳纲枝角亚目的大型蚤的来源是通过保持良好的培养条件， 使大型蚤的繁殖控制在孤雌生殖状态下，选用试验室条件下培养3代以上的、出生6 24h 的幼蚤为试验蚤。该方法必须保证实验室始终对大型蚤进行培养传代，实验测定程序复杂， 无法灵活控制测定时间，而且检测可比性不高。因此，需要对现有的试剂进行改进。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提出一种大型蚤类对水质物质急性毒性测定试剂盒及其制作和用法，在该试剂盒中既有用于孵化幼蚤的纯体系大型蚤休眠卵，又附带有标准稀释水母液及饲喂幼蚤的饵料。纯体系大型蚤休眠卵可以根据需要随时进行孵化，孵化后的幼蚤饲喂后可以直接用来进行水质物质急性毒性测定。而且只用一个试剂盒就可以对水质物质急性毒性进行测定，大大简化了原实验室测定程序，检测时间可以灵活控制，检测可比性提高，具有检测经济、快速、高效的优点。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明的大型蚤类对水质物质急性毒性测定试剂盒，设有盒外壳，外壳上部设有上开盒盖，其特征是在外壳里面后部设有可取下的30孔测试板和孵化皿，测试板和孵化皿之间设有滴管和筛网，在盒内前部从左至右依序设置数个稀释水母液瓶、饵料瓶和大型蚤卵瓶。本发明的试剂盒的制作方法，其特征是具有以下步骤1)纯品系大型蚤幼虫的制备(1)挑取幼蚤选用试验室条件下培养3代以上的、出生6 24h的幼蚤进行挑取， 挑取的标准是发育良好，运动能力强；(2)引种引种的方法是使用一次性滴管从上述蚤群中吸取所选定的幼蚤，将其移至新的培养皿中；(3)饲喂选用新培养的羊角月牙藻饲喂大型蚤，饲喂量维持在培养液呈浅绿色；(4)选择选择体大、健康的母体数个，用50mL小烧杯单个培养，选择繁殖量最大的一代为母蚤，单克隆化，使之成为纯品系；2)饲喂幼蚤采用绿藻为饵料进行幼蚤的饲喂，条件昼长14h，25°C，35% RH， 20%光照，夜长 10h，25°C，60% RH，培养 7-15 天；3)成蚤的分离根据蚤体型大小，将成年蚤与幼蚤进行分离，得到成蚤；4)制备休眠卵培养大型蚤的温度变至15 20°C继续饲喂绿藻，此时大型蚤成熟个体进入产卵状态，24 7 后收集所产休眠卵；5)净化及保存休眠卵将收集到的休眠卵使用纯净水进行冲洗，冲洗后放入装有保存液的大型蚤卵瓶中保存，所述保存液由10% 50%的甘油制成；6)制备饵料绿藻经过实验室培养后进行离心收集，冷冻干燥后制备冻干粉作为饵料，放入饵料瓶中保存；7)制备稀释水母液稀释水母液使用电导率小于10μ S/cm，lmS/m的蒸馏水或去离子水，以下简称水，按下述方法配制四种母液(a)氯化钙溶液将588mg氯化钙(CaCl2 · 2H20)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；(b)硫酸镁溶液将123mg硫酸镁(MgSO4 · 7H20)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；(c)碳酸氢钠溶液将65mg碳酸氢钠(NaHCO3)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；(d)氯化钾溶液将6. 25mg氯化钾(KCl)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；8)制作配件并装盒用无毒材料制成方形带有凹凸结构的30孔板，孔板上标记有空白对照及实验组字样；用无毒材料制成圆形由盒底和盒盖构成的孵化皿；配以滴管、筛网和盒外壳；把上述步骤中制备的饵料瓶、稀释水母液瓶、大型蚤休眠卵瓶和配件装入盒外壳内。本发明的试剂盒的使用方法，其特征是有以下步骤1)配置标准稀释水取一 2L容量瓶，加入IL超纯水；取试剂盒中的母液a，b，c, d，依次加入容量瓶，最后用超纯水定容至2L，混合均勻备用；标准稀释水应容许大型蚤在其中生存至少48h，并尽可能检查稀释水中不含有任何已知的对大型蚤有毒的物质氯、重金属、农药、氨、多氯联苯中任何一种；2)大型蚤卵的孵化将瓶中大型蚤卵倒入筛网中；使用纯净水进行冲洗，以保证将保存介质冲洗干净；将冲洗干净的大型蚤卵转至孵化皿中，加入已配好的稀释水15ml ； 将孵化皿放入光照培养箱中进行孵化，条件20-22°C，6000LUX，7ai ；3)根据预试验的结果确定正式试验的浓度范围，按几何级数的浓度系列，即等比级数间距设计5-7个浓度；等比级系数不超过2. 2，如1、2、4、8、16等比级系数为2，最高浓度处理组抑制或死亡率为100%，最低浓度处理组抑制或死亡率为0，系列浓度中以能出现一个大型蚤运动抑制率在40% 60%的浓度最为理想；4)孔板中每个孔中置蚤4-6个，平均每蚤的试验液不低于2mL，每个浓度处理不少于4个平行，以不添加样品的空白处理作为对照，内装相等体积的稀释水，如检测物质使用溶剂，则还需设置最大浓度的溶剂组作为空白对照；5)试验开始后应于Mh_48h内每隔1 定期进行观察，记录每个孔中仍能活动的水蚤数，测定0 100%大型蚤不活动或死亡的浓度范围，并记录它们任何不正常的行为； 在计算试验蚤的不活动或死亡的百分数之后，立即测定试验液的溶解氧浓度；6)结果计算即EC5tl的估算试验结束，计算每个浓度中不活动的试验蚤，包括死亡蚤，占试验总数的百分比， 用概率单位目测法，计算EC5tl，也可用计算机EC5tl程序即寇氏修正法处理，获得EC5Q。
试剂盒蚤卵的孵化率能够达到80%以上，一个试剂盒可以测定100个以上的样品。由于该试剂盒使用测定过程是使用大型蚤休眠卵直接孵化进行测定的，因此节省了长期培养的人力和经济成本。蚤卵的采用不仅可以减少由于蚤的体差异导致的检测误差10% 以上，而且可以很好的降低实验室间的检测误差。说明书附1是本发明的试剂盒的结构示意图；图2是本发明的测试板的结构示意图。
具体实施例方式下面结合附图
和实施例对本发明做进一步的说明。实施例大型蚤类对水质物质急性毒性测定试剂盒，设有盒外壳1，外壳上部设有上开盒盖3，在外壳里面后部设有可取下的30孔21测试板2和孵化皿5，测试板和孵化皿之间设有滴管和筛网4，在盒内前部从左至右依序设置数个稀释水母液瓶8、饵料瓶7和大型蚤卵瓶6。本发明的试剂盒的制作方法实施例按以下步骤制作1)纯品系大型蚤幼虫的制备(1)挑取幼蚤选用试验室条件下培养3代以上的、出生12h的幼蚤进行挑取，挑取的标准是发育良好，运动能力强；(2)引种引种的方法是使用一次性滴管从上述蚤群中吸取所选定的幼蚤，将其移至新的培养皿中；(3)饲喂选用新培养的羊角月牙藻饲喂大型蚤，饲喂量维持在培养液呈浅绿色；(4)选择选择体大、健康的母体数个，用50mL小烧杯单个培养，选择繁殖量最大的一代为母蚤，单克隆化，使之成为纯品系；2)饲喂幼蚤采用绿藻为饵料进行幼蚤的饲喂，条件昼长14h，25°C，35% RH， 20%光照，夜长 10h，25°C，60% RH，培养 10 天；3)成蚤的分离根据蚤体型大小，将成年蚤与幼蚤进行分离，得到成蚤；4)制备休眠卵培养大型蚤的温度变至15 20°C继续饲喂绿藻，此时大型蚤成熟个体进入产卵状态，4 后收集所产休眠卵；5)净化及保存休眠卵将收集到的休眠卵使用纯净水进行冲洗，冲洗后放入装有保存液的大型蚤卵瓶中保存，所述保存液由30%的甘油制成；6)制备饵料绿藻经过实验室培养后进行离心收集，冷冻干燥后制备冻干粉作为饵料，放入饵料瓶中保存；7)制备稀释水母液稀释水母液使用电导率小于10 μ S/cm, lmS/m的蒸馏水或去离子水，以下简称水，按下述方法配制四种母液(a)氯化钙溶液将588mg氯化钙(CaCl2 · 2H20)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；(b)硫酸镁溶液将123mg硫酸镁(MgSO4 · 7H20)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；(c)碳酸氢钠溶液将65mg碳酸氢钠(NaHCO3)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；
(d)氯化钾溶液将6. 25mg氯化钾(KCl)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；8)制作配件并装盒用无毒材料制成方形带有凹凸结构的30孔板，孔板上标记有空白对照及实验组字样；用无毒材料制成圆形由盒底和盒盖构成的孵化皿；配以滴管、筛网和盒外壳；把上述步骤中制备的饵料瓶、稀释水母液瓶、大型蚤休眠卵瓶和配件装入盒外壳内。本发的试剂盒的使用方法实施例按以下步骤进行1)配置标准稀释水取一 2L容量瓶，加入IL超纯水；取试剂盒中的母液a，b，c, d，依次加入容量瓶，最后用超纯水定容至2L，混合均勻备用；标准稀释水应容许大型蚤在其中生存至少48h，并尽可能检查稀释水中不含有任何已知的对大型蚤有毒的物质氯、重金属、农药、氨、多氯联苯中任何一种；2)大型蚤卵的孵化将瓶中大型蚤卵倒入筛网中；使用纯净水进行冲洗，以保证将保存介质冲洗干净；将冲洗干净的大型蚤卵转至孵化皿中，加入已配好的稀释水15ml ； 将孵化皿放入光照培养箱中进行孵化，条件^rCj(KK)LUXja1 ；3)根据预试验的结果确定正式试验的浓度范围，按几何级数的浓度系列，即等比级数间距设计6个浓度；等比级系数不超过2. 2，如1、2、4、8、16等比级系数为2，最高浓度处理组抑制或死亡率为100%，最低浓度处理组抑制或死亡率为0，本实施例中，系列浓度中出现一个大型蚤运动抑制率在50%的理想浓度；4)孔板中每个孔中置蚤4-6个，平均每蚤的试验液不低于2mL，每个浓度处理不少于4个平行，以不添加样品的空白处理作为对照，内装相等体积的稀释水，如检测物质使用溶剂，则还需设置最大浓度的溶剂组作为空白对照；5)试验开始后于3 内每隔1 定期进行观察，记录每个孔中仍能活动的水蚤数， 测定O 100%大型蚤不活动或死亡的浓度范围，并记录它们任何不正常的行为。在计算试验蚤的不活动或死亡的百分数之后，立即测定试验液的溶解氧浓度；6)结果计算即半效应浓度EC5tl的估算试验结束，计算每个浓度中不活动的试验蚤，包括死亡蚤，占试验总数的百分比， 用计算机EC5tl程序即寇氏修正法处理，计算EC5tl，获得EC5tl为O 100%。本实施例的测试盒和测试方法与常规的测试方法相比，方法简单，效果好，测试结果准确，节约成本约30%，缩短测试时间40%，而且测试结果准确，精确程度明显提高。
权利要求
1.一种大型蚤类对水质物质急性毒性测定试剂盒，设有盒外壳(1)，外壳上部设有上开盒盖(3)，其特征是在外壳里面后部设有可取下的30孔测试板( 和孵化皿(5)，测试板和孵化皿之间设有滴管和筛网，在盒内前部从左至右依序设置数个稀释水母液瓶 (8)、饵料瓶(7)和大型蚤卵瓶(6)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒的制作方法，其特征是具有以下步骤1)纯品系大型蚤幼虫的制备(1)挑取幼蚤选用试验室条件下培养3代以上的、出生6 24h的幼蚤进行挑取，挑取的标准是发育良好，运动能力强；(2)引种引种的方法是使用一次性滴管从上述蚤群中吸取所选定的幼蚤，将其移至新的培养皿中；(3)饲喂选用新培养的羊角月牙藻饲喂大型蚤，饲喂量维持在培养液呈浅绿色；(4)选择选择体大、健康的母体数个，用50mL小烧杯单个培养，选择繁殖量最大的一代为母蚤，单克隆化，使之成为纯品系；2)饲喂幼蚤采用绿藻为饵料进行幼蚤的饲喂，条件昼长14h，25°C，35%RH，20%光照，夜长 10h，25°C，60% RH，培养 7-15 天；3)成蚤的分离根据蚤体型大小，将成年蚤与幼蚤进行分离，得到成蚤；4)制备休眠卵培养大型蚤的温度变至15 20°C继续饲喂绿藻，此时大型蚤成熟个体进入产卵状态，24 7 后收集所产休眠卵；5)净化及保存休眠卵将收集到的休眠卵使用纯净水进行冲洗，冲洗后放入装有保存液的大型蚤卵瓶中保存，所述保存液由10% 50%的甘油制成；6)制备饵料绿藻经过实验室培养后进行离心收集，冷冻干燥后制备冻干粉作为饵料，放入饵料瓶中保存；7)制备稀释水母液稀释水母液使用电导率小于10μ S/cm, lmS/m的蒸馏水或去离子水，以下简称水，按下述方法配制14种母液(a)氯化钙溶液将588mg氯化钙(CaCl2· 2H20)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；(b)硫酸镁溶液将123mg硫酸镁(MgSO4· 7H20)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；(c)碳酸氢钠溶液将65mg碳酸氢钠(NaHCO3)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；(d)氯化钾溶液将6.25mg氯化钾(KCl)溶于15ml水中，装入20ml母液瓶中；8)制作配件并装盒用无毒材料制成方形带有凹凸结构的30孔板，孔板上标记有空白对照及实验组字样；用无毒材料制成圆形由盒底和盒盖构成的孵化皿；配以滴管、筛网和盒外壳；把上述步骤中制备的饵料瓶、稀释水母液瓶、大型蚤休眠卵瓶和配件装入盒外壳内。
3.根据权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征是有以下步骤1)配置标准稀释水取一2L容量瓶，加入IL超纯水；取试剂盒中的母液a，b，c，d，依次加入容量瓶，最后用超纯水定容至2L，混合均勻备用；标准稀释水应容许大型蚤在其中生存至少48h，并尽可能检查稀释水中不含有任何已知的对大型蚤有毒的物质氯、重金属、 农药、氨、多氯联苯中任何一种；2)大型蚤卵的孵化将瓶中大型蚤卵倒入筛网中；使用纯净水进行冲洗，以保证将保存介质冲洗干净；将冲洗干净的大型蚤卵转至孵化皿中，加入已配好的稀释水15ml ；将孵化皿放入光照培养箱中进行孵化，条件20-22°C，6000LUX，7ai ；3)根据预试验的结果确定正式试验的浓度范围，按几何级数的浓度系列，即等比级数间距设计5-7个浓度；等比级系数不超过2. 2，如1、2、4、8、16等比级系数为2，最高浓度处理组抑制或死亡率为100%，最低浓度处理组抑制或死亡率为0，系列浓度中以能出现一个大型蚤运动抑制率在40% 60%的浓度最为理想；4)孔板中每个孔中置蚤4-6个，平均每蚤的试验液不低于2mL，每个浓度处理不少于 4个平行，以不添加样品的空白处理作为对照，内装相等体积的稀释水，如检测物质使用溶剂，则还需设置最大浓度的溶剂组作为空白对照；5)试验开始后应于Mh-48h内每隔1 定期进行观察，记录每个孔中仍能活动的水蚤数，测定0 100%大型蚤不活动或死亡的浓度范围，并记录它们任何不正常的行为；在计算试验蚤的不活动或死亡的百分数之后，立即测定试验液的溶解氧浓度；6)结果计算即半效应浓度EC5tl的估算试验结束，计算每个浓度中不活动的试验蚤，包括死亡蚤，占试验总数的百分比，用概率单位目测法，计算EC5tl，也可用计算机EC5tl程序即寇氏修正法处理，获得EC5Q。
全文摘要
本发明公开了一种大型蚤类对水质物质急性毒性测定试剂盒及其制作和用法，试剂盒设有外壳、测试板、孵化皿、滴管和筛网、稀释水母液瓶、饵料瓶和大型蚤卵瓶。试剂盒的制作方法1.纯品系大型蚤幼虫的制备；2.饲喂幼蚤；3.成蚤的分离；4.制备休眠卵；5.净化及保存休眠卵；6.制备饵料；7.制备稀释水母液；8.制作配件并装盒。试剂盒的使用方法1.配置标准稀释水；2.大型蚤卵的孵化；3.根据预试验的结果确大型蚤类对水质物质急性毒性测定定正式试验的浓度范围；4.作空白对照；5.试大型蚤类对水质物质急性毒性测定验开始；6.结果计算即半效应浓度EC50的估算本发明适用于利用大型蚤类对水质物质急性毒性测定，成本低，使用方便，测定准确。
文档编号G01N33/18GK102183619SQ20111002256
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者周军, 宫飞蓬, 李魁晓, 甘一萍 申请人:北京城市排水集团有限责任公司