专利名称：苯达松敏感性水稻快速鉴定方法
技术领域：
本发明属于植物鉴定技术领域，具体涉及苯达松敏感性水稻快速鉴定方法。
背景技术：
苯达松(bentazon)是一种广谱、高效、低毒的苯并噻二唑(benzothiadiazole， BTH)类除草剂，常用商品名称有Basagra、灭草松、百草克、噻草平、排草丹等。苯达松的有效成分能通过植物的根、叶吸收，其对绝大多数双子叶植物[除大豆(Glycine max Merrill L.)、花生(Arachis hypogaca L.)外]和莎草(Cyperus L.)科杂草有杀除作用，对禾本科植物无害。苯达松作为一种选择性内吸性除草剂，普遍认为其作用靶位点为光系统II的D1 蛋白，可阻断非环式光合电子传递链，抑制光合作用，从而引起敏感型植物死亡。野生型水稻品种具有苯达松的抗性，5000 mg · L-I苯达松溶液喷施于水稻苗期仍表现安全无害。1984年日本学者Mori通过、射线辐照‘农林8号，(‘NorinS，，‘N8，)，发现一个对苯达松极其敏感的突变体‘农林8号m，( ‘Norin8m，，‘N8m，),0. 5 500 mg · L-I 的苯达松对3. 5、叶期的‘农林8号m’表现为不同程度的伤害(叶卷曲直至全株死亡)。 此外，我国湖北省农科院张集文等采用350 Gy 6tlCoY射线辐射处理水稻光-温敏雄性不育系‘W6154S，，获得苯达松敏感突变体‘8077s，。研究证明两种不同来源的苯达松敏感基因均为核基因控制的隐性单基因。杂交水稻在我国已受到广大农民的普遍欢迎，为我国粮食生产作出了重要贡献。 但杂交水稻制种过程仍存在制种劳动强度大、制种纯度难以保障等问题。苯达松敏感基因作为一个化学致死标记，在水稻杂交制种中有广阔的应用前景，主要体现在以下两方面。 (1)将苯达松敏感基因转育到水稻恢复系中，水稻授粉后通过喷施苯达松，去除含有苯达松敏感基因的恢复系，从而实现混播混收的机械化制种。同时也有利于提高不育系异交结实率。( 苯达松敏感基因转育到水稻不育系，保证水稻杂种纯度。因此，建立一种快速准确的苯达松敏感性水稻鉴定方法，能有效提高水稻敏感突变体及其转育后代的筛选效率， 加速苯达松敏感基因在杂交水稻制种中的应用。目前，鉴定苯达松敏感性水稻一直没有较好的方法，广泛采用的有两种一、利用苯达松喷施田间水稻，或者涂抹水稻标记叶片，7-10天后观察水稻涂抹处理材料的叶色变化，叶片焦枯的为敏感性水稻，叶色无明显变化的为抗性水稻。但该方法存在以下缺点1、 处理时间较长，需要处理7-10天以上。2、鉴定的准确性低，由于鉴定处理时间长，降雨、高温及病虫害等环境因子对除草剂作用效果又很大影响，很难用叶片颜色改变判定水稻敏感性；3、鉴定过程费工费时。二、利用与苯达松敏感基因紧密连锁的分子标记来辅助鉴定水稻的苯达松敏感性。如；朱必凤等从210个随机引物中找到2个水稻苯达松敏感池和抗感池之间表现多态性的特异引物——S20和S316。Pan等通过分子精细定位发现该基因位于水稻第三染色体长臂的末端，其紧密连锁标记为SSR71314，两者相距71.8351Λ。但是，利用分子标记辅助鉴定的方法存在以下缺点1、方法复杂，需要提取水稻DNA、基因的PCR扩增以及琼脂糖电泳等；2、实验器材、分子试剂、耗材价格昂贵；3、仅为苯达松敏感性鉴定的实验室辅助方法，不适合田间大规模鉴定。
发明内容
为了解决苯达松敏感性水稻鉴定中成本高、鉴定时间长、鉴定误差大的问题，本发明方法根据苯达松作用靶位点为PSII的D1蛋白，利用叶片苯达松处理后叶绿素荧光参数 YielcKPS II有效光化学量子产量)的抑制率来快速鉴定水稻的敏感性方法。本发明方法的具体操作步骤如下
苯达松敏感性水稻快速鉴定方法，其特征在于包括以下操作步骤 (1)、配液
A、用苯达松除草剂配置体积百分比0.02%(V/V)的苯达松处理液，其中含有体积百分比 0. 25%(V/V)的吐温 20 ；
B、体积百分比0.25%(V/V)的吐温20溶液为吐温20对照液； O)、水稻叶片标记
于水稻6叶期，在同一株水稻上选取两片健康的叶片，一片用于苯达松处理，一片为空白对照；在距叶尖10-11 cm处标记叶片； (3)、苯达松涂抹处理
用毛笔或棉签蘸取体积百分比0.02% (V/V)的苯达松处理液，在一片叶片的标记处至叶尖均勻涂抹苯达松处理液，在另一片叶片从标记处至叶尖均勻涂抹对照液，作为空白对照；放置7 h ；
G)、荧光参数测定
利用调制式叶绿素荧光仪，分别检测两片叶片的光饱和脉冲光存在时最大荧光、稳态下荧光，计算作用光存在时光系统II (PS II )有效光化学量子产量；所述PS II有效光化学量子产量计算公式为=Yield= (Fm，- Ft)/Fm，；
上式中Yield为作用光存在时光系统II (PS II )有效光化学量子产量，Fm’为光饱和脉冲光存在时最大荧光，Ft为稳态下荧光； (5)、敏感性水稻快速鉴定
利用如下公式计数苯达松对叶片PS II有效光化学量子产量的抑制率；根据抑制率高低判断待测水稻的苯达松敏感性，抑制率大于50%为敏感性水稻，而抑制率小于50%为抗性水稻；
抑制率(%) = ( Yieldck - Yield 处理)/ Yieldck 氺 100%，
上式中Yield处理和Yieldck分别为苯达松处理叶片和对照叶片的PS II有效光化学
量子产量。所述苯达松除草剂为浓度为体积百分比25%(V/V)的苯达松除草剂。本发明的有益技术效果体现在以下方面
1、本发明方法简单，人工成本低，可在苯达松处理7小时后即可完成突变体鉴定；
2、本发明方法鉴定的准确性高，可有效排出假阳性干扰；
3、苯达松除草剂使用浓度仅为0.02%,显著低于传统鉴定方法的使用浓度(0. 1%)，有效减少了除草剂大量使用对生态环境的危害。
图1 0. 02% (V/V)苯达松处理对水稻叶片光系统II (PS II )有效光化学量子产量 (Yield)的影响图。图2苯达松处理浓度与水稻叶片光系统II (PS II )有效光化学量子产量(Yield) 抑制率的线性回归分析图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。实施例1
主要设备
1.叶绿素荧光仪；2.微量移液器；3.电子称。材料与试剂
1.材料不同敏感类型的水稻叶片
2.主要试剂
(1) 25%苯达松除草剂市售。(2)吐温 2O:市售。(3)体积百分比0.02% (V/V)的苯达松处理液取25%苯达松除草剂0.8 mL，加 2. 5 mL吐温20，蒸馏水定容至1000 mL,即为体积百分比0. 02% (V/V)苯达松处理液。(4)对照液1000 mL蒸馏水中加入2. 5 mL吐温20，即为不含苯达松的体积百分比0.25% (V/V)的吐温20对照液。苯达松敏感性水稻快速鉴定方法包括以下操作步骤
(1)、水稻叶片标记田间栽培水稻，正常管理。于6叶期，在同一株水稻上选取两片健康的叶片，一片用于苯达松处理，一片为空白对照。分别在距叶尖约10 cm处用记号笔标记叶片；
O)、用毛笔或棉签蘸取体积百分比0.02% (V/V)的苯达松处理液，在一片叶片的标记处至叶尖均勻涂抹苯达松处理液，在另一片叶片从标记处至叶尖均勻涂抹对照液，作为空白对照；放置7 h ； (3)、荧光参数测定
利用调制式叶绿素荧光仪，分别检测两片叶片的光饱和脉冲光存在时最大荧光、稳态下荧光，计算作用光存在时光系统II (PS II )有效光化学量子产量；所述光系统II (PS II ) 有效光化学量子产量计算公式为=Yield= (Fm，- Ft)/Fm，；
上式中Yield为作用光存在时PS II有效光化学量子产量，Fm’为光饱和脉冲光存在时最大荧光，Ft为稳态下荧光； G)、敏感性水稻快速鉴定
利用如下公式计数苯达松对叶片光系统II (PS II )有效光化学量子产量的抑制率；根据抑制率高低判断待测水稻的苯达松敏感性，抑制率大于50%为敏感性水稻，而抑制率小于50%为抗性水稻；
抑制率(%) = ( Yieldck - Yield 处理)/ Yieldck 氺 100%，
上式中Yield处理和Yieldck分别为苯达松处理叶片和对照叶片的光系统II (PS II )有效光化学量子产量。实施例2
主要设备
1.叶绿素荧光仪；2.微量移液器；3.电子称；4.打孔器。材料与试剂
1.材料不同敏感类型的水稻叶片，在4°C储藏备用；
2.主要试剂
(1) 25%苯达松除草剂市售。(2)吐温 20:市售。(3)体积百分比0.02% (V/V)的苯达松处理液取25%苯达松除草剂0.8 mL，加 2. 5 mL吐温20，蒸馏水定容至1000 mL,即为体积百分比0. 02% (V/V)的苯达松处理液。(4)对照液:1000 mL蒸馏水中加入2. 5 mL吐温20，即为不含苯达松的0. 25% (V/ V)吐温20对照液。操作方法
(1)、水稻叶片标记将田间水稻叶片取回实验室，标记后，放置在铺有湿纱布的培养皿中，以防止叶片失水；
(2)、苯达松涂抹处理用棉签蘸取苯达松处理液，均勻涂抹在标记叶片上。以不含苯达松的0. 25% (V/V)吐温20溶液涂抹作为空白对照；
(3)、荧光参数测定苯达松处理7h后，利用采用调制式荧光仪测定叶绿素荧光参数， 自然光照射下，分别检测光饱和脉冲光存在时最大荧光(Fm’)，稳态下荧光(Ft)，计算作用光存在时光系统II (PS II )有效光化学量子产量(Yield)；
G)、敏感性水稻快速鉴定利用如下公式计数苯达松对叶片光系统II (PS II )有效光化学量子产量的抑制率。根据抑制率高低判断待测水稻的苯达松敏感性，抑制率大于50% 为敏感性水稻，而抑制率小于50%为抗性水稻。抑制率(%)= ( Yieldck - Yield 处理)/ Yieldck 氺 100%，
上式中Yield处理和Yieldck分别为苯达松处理叶片和对照叶片的光系统II (PS II ) 有效光化学量子产量。技术特点说明
1、叶绿素荧光指标的选取
不同浓度苯达松标准液涂抹敏感性水稻叶片后，光下处理7 h，然后用黑布遮盖暗处理 20min，测荧光指标(暗适应后得到的最小荧光产量)、Fm (暗适应的样品照射饱和脉冲后得到的最大荧光产量)、Fv/m (暗适应样品光系统II的最大量子产量)，再作用光处理5min 后测R)’、Fm’(光照下打开饱和脉冲时得到的最大荧光产量)、Yield。从表1可以看出， 苯达松处理浓度和叶绿素荧光指标中的Fv/m、Fo\Fm'和Yield显著相关，相关系数分别为-0. 92,0. 99,0. 91和-0. 99。但从上述荧光指标的标准差上看，Fo，、Fm，等荧光指标的精确度较差，而Fv/m和Yield等荧光指标的精确度较高。结合以上分析，最终确定叶绿素荧光指标Yield作为本发明方法鉴定指标。表1不同苯达松溶液处理下叶绿素荧光指标的变化及相关分析表。
权利要求
1.苯达松敏感性水稻快速鉴定方法，其特征在于包括以下操作步骤 (1)、配液A、用苯达松除草剂配置体积百分比0.02%的苯达松处理液，其中含有体积百分比 0. 25%的吐温20 ；B、体积百分比0.25%的吐温20溶液为吐温20对照液； O)、水稻叶片标记于水稻6叶期，在同一株水稻上选取两片健康的叶片，一片用于苯达松处理，一片为空白对照；在距叶尖10-11 cm处标记叶片； (3)、苯达松涂抹处理用毛笔或棉签蘸取体积百分比0. 02%的苯达松处理液，在一片叶片的标记处至叶尖均勻涂抹苯达松处理液，在另一片叶片从标记处至叶尖均勻涂抹对照液，作为空白对照；放置 7 h；G)、荧光参数测定利用调制式叶绿素荧光仪，分别检测两片叶片的光饱和脉冲光存在时最大荧光、稳态下荧光，计算作用光存在时光系统II (PS II )有效光化学量子产量；所述PS II有效光化学量子产量计算公式为=Yield= (Fm，- Ft)/Fm，；上式中Yield为作用光存在时光系统II (PS II )有效光化学量子产量，Fm’为光饱和脉冲光存在时最大荧光，Ft为稳态下荧光； (5)、敏感性水稻快速鉴定利用如下公式计数苯达松对叶片PS II有效光化学量子产量的抑制率；根据抑制率高低判断待测水稻的苯达松敏感性，抑制率大于50%为敏感性水稻，而抑制率小于50%为抗性水稻；抑制率(%) = ( Yieldck - Yield 处理)/ Yieldck 氺 100%，上式中Yield处理和Yieldck分别为苯达松处理叶片和对照叶片的PS II有效光化学量子产量。
2.根据权利要求1所述的苯达松敏感性水稻快速鉴定方法，其特征在于所述苯达松除草剂为浓度为体积百分比25%的苯达松除草剂。
全文摘要
本发明涉及苯达松敏感性水稻快速鉴定方法，解决了公知技术中苯达松敏感性水稻鉴定方法成本高、鉴定时间长、鉴定误差大的问题。本发明方法包括水稻叶片标记、苯达松涂抹处理和敏感性水稻快速鉴定三个步骤，其中利用叶片苯达松处理后叶绿素荧光参数Yield(PSⅡ有效光化学量子产量)的抑制率来鉴定水稻的敏感性。本发明方法简单，人工成本低，可在苯达松处理7小时后即可完成突变体鉴定；鉴定的准确性高，可有效排出假阳性干扰；而且苯达松除草剂使用浓度仅为0.02%(V/V)苯达松，显著低于传统鉴定方法的使用浓度0.1%(V/V)苯达松，有效减少了除草剂大量使用对生态环境的危害。
文档编号G01N21/64GK102175660SQ20111002290
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者周俊峰, 张平泰, 王云生, 王景龙, 高丽萍 申请人:安徽农业大学