专利名称：用于检测生物标本中的过氧化物还原酶ⅳ的双抗夹心elisa试剂盒及其方法与运用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验领域，特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒及其方法与运用。
背景技术：
类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜炎为基本病理改变，以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病，大多病情呈进行性，最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残，严重影响患者生活质量。未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈，甚至导致关节畸形。作为自身免疫性疾病，致病抗原驱动的自身反应性CD4+T细胞活化是类风湿关节炎发病的核心途径。对于类风湿关节炎的诊断，现在主流仍然沿用1987年美国风湿病学学会RA的分类标准，其主要靠临床表现并排除其他关节炎从而对RA进行判断。另外，X线改变和类风湿因子也是判断RA的常用标准。但上述方法操作繁琐且特异性不高，且不适用于早期诊断。众所周知，RA的病理改变从滑膜组织开始逐渐向软骨到骨发展。RA在早期若未得到有效治疗，将会引起关节功能障碍甚至劳动力丧失，并导致全身多脏器受累进而危及生命。如果能尽早对RA病情做出诊断，及早治疗，从而阻止或延缓其发展，将能有效的提高RA 的治疗效果并减少其并发症的发生。而针对RA早期有高度敏感性和特异性的检测指标是实现RA早期诊断和治疗的前提。早期诊断指标中，IL-8、IL-6水平在巨细胞病毒DNA阳性的类风湿关节炎患者中升高和CMV基因组出现之间存在联系，但特异性和敏感性低。在RA自身抗体作为检测指标方面类风湿因子(RF)存在灵敏度低的缺点；在早期RF阴性的类风湿关节炎病人中可 53. 3%的病人抗核周因子(APF)呈阳性，但APF抗原片的保存时间较短(仅为1 2周)，检测稳定性低fa抗体在类风湿关节炎中阳性率为40%，特异性为98. 9%，但类风湿关节炎早期仅约23% ；过氧化物还原酶IV和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种试剂盒，该试剂盒能快速检测过氧化物还原酶IV 的含量，操作简单，成本低廉。为实现上述目的，本发明的技术方案为
1、用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，包括以抗过氧化物还原酶IV的特异性单抗和/或多抗组成的捕获剂、酶标二抗、样品稀释液和底物。2、进一步，所述捕获剂为小鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG。
3、进一步，小鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG作不大于640倍体积稀释，其稀释液为捕获剂。4、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，所述捕获剂附于固相支持物上。5、根据4所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，所述固相支持物为酶标板或生物芯片。6、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，所述生物标本为血清、尿液、细胞组织物或血浆。7、根据6所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，所述生物标本为血清。8、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，所述酶标二抗为HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG。9、根据8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，将所述HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG作不大于640倍体积稀释液，其稀释液为酶标二抗。10、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，所述捕获剂与酶标二抗的用量比为1:1。本发明的目的之二在于提供上述试剂盒的用途，该用途能弥补过氧化物还原酶IV 检测领域的技术空白，并为类风湿关节炎及其它免疫性疾病提供了诊断思路，特别适用于生物标本的检测。为实现上述目的，本发明的技术方案为
11、1-10任一项所述双抗夹心ELISA试剂盒在检测过氧化物还原酶IV含量的应用。12、根据11所述的双抗夹心ELISA试剂盒应用，所述试剂盒在检测类风湿关节炎中的应用。13、根据11所述的双抗夹心ELISA试剂盒应用，所述试剂盒检测待测血清与正常人血清的过氧化物还原酶IV的含量，当待测血清的OD45tlnm值大于0. 257为过氧化物还原酶 IV阳性，小于或等于0. 257为过氧化物还原酶IV阴性。本发明的目的之三在于提供过氧化物还原酶IV含量的方法，该方法敏感性高，操作简单。为实现上述目的，本发明的技术方案为
14、运用1-10任一项所述双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法， a、将生物标本与双抗夹心ELISA试剂盒中的捕获剂接触并保温；b、将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物；C、在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入双抗夹心ELISA试剂盒中的酶标二抗，得双抗夹心复合物；d、检测结合于捕获剂的过氧化物还原酶IV的含量。15、根据14所述的运用所述双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，还包括将步骤d所得的过氧化物还原酶IV的含量与正常人进行比较判断。16、根据14所述的方法，步骤a中，将捕获剂包被酶标板，将待测生物标本与捕获剂接触，保温并用封闭液封闭；所述生物标本为不大于200倍体积稀释的血清稀释液，所述捕获剂为小鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG作不大于640倍体积稀释的稀释液。
17、根据14所述的运用所述双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，步骤b中，将步骤a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分离， 得抗原-抗体复合物。18、根据14所述的运用所述双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，步骤c中，在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入双抗夹心ELISA试剂盒中的酶标二抗进行保温反应，得双抗夹心复合物；所述酶标二抗为HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG作不大于640倍体积稀释液的稀释液。19、根据14所述的运用所述双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，步骤d中，在步骤c所得的双抗夹心复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液，通过测显色样品液的OD45tlnm值检测结合于捕获剂的过氧化物还原酶IV的含量。
20、根据14所述的运用所述双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，所述方法还包括阴性对照组和空白对照组，所述阴性对照组为源自于正常人的生物标本。21、根据20所述的运用所述双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，所述待测生物标本的OD45tlnm值大于阴性对照组样本的OD45tlnm值平均值与其2倍标准方差之和时，判定为过氧化物还原酶IV阳性，小于或等于则为阴性。本发明的有益效果在于本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶IV的含量，其成本低，敏感性佳；运用本试剂盒检测过氧化物还原酶IV的含量，并与正常人的过氧化物还原酶IV的水平进行比较，可特异性教高的诊断类风湿关节炎，所以该试剂盒可以制备成类风湿关节炎诊断试剂盒，尤其适用于早期诊断。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为不同疾病组血清当中过氧化物还原酶IV双抗体夹心法ELISA检测结果图。图2为过氧化物还原酶IV双抗体夹心法ELISA标准曲线，横坐标为过氧化物酶IV 标准品的稀释浓度，纵坐标为各稀释浓度标准品对应的OD450值。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。本实施例中将所述人过氧化物还原酶IV的获得是通过构建原核表达质粒、转化表达菌并发酵培养，收集到大量的含有过氧化物还原酶IV的菌体沉淀，再通过超声波破碎菌体、过氧化物还原酶IV包涵体冼涤、纯化及梯度透析而获得的；用所述人过氧化物还原酶IV对大鼠进行常规免疫程序和纯化，获得大鼠抗人过氧化物还原酶IV多克隆抗体IgG，在此抗体上标记辣根过氧化物酶(HRP)，作为双抗体夹心法ELISA的二抗；进一步确定了小鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG和大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG的最佳浓度范围及阴阳性临界值的确定，制定了一种特异性和敏感性高的类风湿关节炎抗原过氧化物还原酶IV检测方法，其能捕获7. 8ng/mL过氧化物还原酶IV抗原。实施例
一抗体IgG的制备
1构建人过氧化物还原酶IV表达质粒，用PET原核表达系统制备重组抗原TRX-过氧化物还原酶IV融合蛋白。1. 1根据GenBank中检索到的人过氧化物还原酶IV成熟蛋白序列编码，设计合成编码过氧化物还原酶IV蛋白的DNA ；
1. 2分别在DNA5 ‘端和3 ‘端设计EcoR I和Hind III酶切位点，经聚合酶链反应 (PCR)、构建重组质粒pET过氧化物还原酶IV ； 1. 3在BL21 (DE3)经IPTG诱导表达； 1. 4 Ni-NTA亲和层析制备TRX-过氧化物还原酶IV ；
1.5通过DNA测序、融合蛋白的相对分子质量分析及Western印迹来鉴定TRX-过氧化物还原酶IV质粒及表达的过氧化物还原酶IV抗原的正确性。2大鼠抗人过氧化物还原酶IV多克隆抗体的制备和纯化 2.1弗氏佐剂
a弗氏不完全佐剂液体石蜡油3份，羊毛脂1份，混合均勻，115°C,15min高压灭菌后得弗氏不完全佐剂。使用前加热融化，冷却至50°C左右，加抗原进行乳化处理；b弗氏完全佐剂在上述基础上添加卡介苗至终浓度lmg/mL即可，使用时将抗原溶液与其等量混合， 充分乳化。2. 2大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG的制备和纯化
2.2. 1大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体的制备(重复进行三次此试验，每次间隔1周， 以制备三个不同批次的抗体)
a免疫原的制备将表达纯化后的过氧化物还原酶IV，首免与等量完全弗氏佐剂混合并充分乳化，第二、三免与不完全弗氏佐剂混合并充分乳化，第四免不加佐剂。b免疫程序选择健康雄性Wistar大鼠4只，首免前一天分别采血，分离血清作为阴性对照。制备大鼠抗人过氧化物还原酶IV高免血清免疫程序如下表
表1制备大鼠抗人过氧化物还原酶IV高免血清免疫程序
四免后14d颈动脉放血，收集血液。37°C放置lh，4°C冰箱过夜。第二天析出血清，血凝块以4000r/min离心15min再次收集血清，_20°C保存备用。
大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG的纯化
7除使用大鼠外，也可以采用其它动物制备抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG。a正辛酸-硫酸铵法粗提大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG 粗提大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG，步骤如下(1)取分离的IOmL血清加入等量的0. 06mol/L pH4. 8醋酸盐缓冲液，混勻；(2)室温搅拌下逐滴加入正辛酸75yg/mL血清，室温搅拌30min，4°C 静置>3h，使其充分沉淀后，13，000r/min离心30min ； (3)取上清用滤纸过滤，向滤液中加入1/10体积的10mmol/L pH7. 4的PBS，用2 mol/L NaOH调节pH=7. 4 ； (4)冰浴下向液体中缓缓加入饱和硫酸铵0. 277g/mL使其终浓度达到4596，搅拌30min，置4°C静置 >池或过夜，13，000r/min离心30min弃上清液；⑷按1 4的比例向沉淀中加入PBS，充分吹打使其充分溶解；(5)将溶解液装入透析袋中，在4°C下用lOmmol/L pH7. 4 PBS透析，每他换液一次，直至奈氏试剂检测透析液中无沉淀产生为止。b High Q柱阴离子交换色谱法纯化大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG:纯化抗体IgG，步骤如下(1)样品前处理将粗提IgG用0. 45 μ m滤膜过滤去除杂质，以缓冲液A (pH8.0,20 mmol/L Tris-HCl缓冲液)在4°C条件下进行透析平衡过夜；(2)色谱柱前处理 经过0. 5mol/L NaOH、水洗、1. Omo 1/L NaCl、水洗等前处理，且以缓冲液A平衡HighQ色谱柱；(3)上样取5mL的粗提IgG样品；(4)清洗用50 mL缓冲液A平衡并洗下未结合的蛋白质和杂质；(5)洗脱以缓冲液B (1.0 mol/L NaCl)进行线性梯度离子强度洗脱，流速 0. 5 mL/min，洗脱时间为200min，分部收集洗脱组分。c抗体IgG纯度和浓度测定将收集到的洗脱峰样品处理后，进行SDS-PAGE电泳 (图3-B和图5)，测定抗体IgG的纯度，并用Bradford法测定抗体IgG的最终浓度，并将其稀释为ang/mL，分装后于_20°C保存备用。3戊二醛二步法HRP标记大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG a称取HRP25mg溶于1. 25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
b反应后的酶溶液经kphadex G_25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在Iml / 1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。c将待标记的抗体12. 5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。d用IM PH9. 5碳酸缓冲液0. 25ml，继续搅拌3小时。 e加0. 2M赖氨酸0. 25ml，混勻后，置室温2小时。
f在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C 1小时。g 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0. 15M PH7.4 的 PBS 中。
h将上述溶液装入透析袋中，对0. 15M PH7. 4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10，OOOrpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。4包被抗体
由Abcam公司提供。5实验方法待测血清样品的获得
所有待测类风湿关节炎(RA)、骨关节炎(OA)血清由第三军医大学附属西南医院中医科提供；系统性红斑狼疮(SLE)血清由第三军医大学附属西南医院皮肤科提供；正常人血
8清由第三军医大学附属西南医院健康查体中心提供。
待测血清样品的处理和保存
4°C过夜后经3，OOOrpm离心30分钟，取上清，IOOul分装，-70°C保存。最佳小鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG包被浓度和大鼠抗人过氧化物还原酶 IV抗体IgG最佳浓度的确定
采用方阵滴定法，具体步骤如下(1)将小鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG用包被液倍比稀释(1 20、1 40、1 80、1 160、1 320、1 640)，包被酶标板，IOOul/ 孔，置 4°C湿盒孵育过夜，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(2)加入100 μ 1/孔封闭液，37°C湿盒封闭lh，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(3)加入待测血清样品，100 μ 1/孔，37°C湿盒作用lh，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(4)将HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG倍比稀释 (1 20、1 40、1 80、1 160、1 320、1 640)，加入酶标板中，100 μ 1/L，37°C湿盒孵育 30 分钟， 洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(5)加入TMB底物100 μ 1/孔，37°C避光显色15min后，加 Λ 100 μ 1/孔2mol/L硫酸终止反应；(6)检测用酶标仪测OD450nm值。同时以1%的BSA/ PBS溶液作空白对照，以P/N值最大的小鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG和大鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG的稀释度为最佳工作浓度。分别将小鼠抗人过氧化物还原酶IV单克隆抗体IgG和大鼠抗人过氧化物还原酶 IV多克隆抗体IgG作系列稀释，进行方阵试验，结果见表1。方阵滴定结果显示，当小鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgGl 40倍稀释，大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG以1 :80倍稀释时，OD45tlnm值大于1.0，阴阳性血清OD45tlnm比值(P / N)最大。因此选择小鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG的最佳包被浓度为1 20，即浓度为7. 5 μ g/mL ；大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG的最佳稀释倍数为1:40，即最佳包被浓度为20 μ g/mL，上述最佳包被浓度均为阈浓度，在大于阈浓度时，同样可以实现相同的作用，但经济成本增加。表2鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG和兔抗过氧化物还原酶IV抗体IgG最佳工作浓度的确定
权利要求
1.用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括以抗过氧化物还原酶IV的特异性单抗和/或多抗组成的捕获剂、酶标二抗、样品稀释液和底物。
2.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA 试剂盒，其特征在于所述捕获剂为小鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG。
3.根据权利要求2所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA 试剂盒，其特征在于小鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG作不大于640倍体积稀释，其稀释液为捕获剂。
4.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA 试剂盒，其特征在于所述捕获剂附于固相支持物上。
5.根据权利要求4所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA 试剂盒，其特征在于所述固相支持物为酶标板或生物芯片。
6.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA 试剂盒，其特征在于所述生物标本为血液标本、体液标本以及细胞组织物。
7.根据权利要求6所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA 试剂盒，其特征在于所述血液标本为血清。
8.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA 试剂盒，其特征在于所述酶标二抗为HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG。
9.根据权利要求8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心ELISA 试剂盒，其特征在于将所述HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG作不大于640 倍体积稀释液，其稀释液为酶标二抗。
10.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV的双抗夹心 ELISA试剂盒，其特征在于所述捕获剂与酶标二抗的用量比为1:1。
11.权利要求1-10任一项所述双抗夹心ELISA试剂盒在检测过氧化物还原酶IV含量的应用。
12.根据权利要求11所述的双抗夹心ELISA试剂盒应用，其特征在于所述试剂盒在植被检测类风湿关节炎试剂盒中的应用。
13.根据权利要求11所述的双抗夹心ELISA试剂盒应用，其特征在于所述试剂盒检测待测血清与正常人血清的过氧化物还原酶IV的含量，当待测血清的OD45tlnm值大于0. 257 为过氧化物还原酶IV阳性，小于或等于0. 257为过氧化物还原酶IV阴性。
14.运用权利要求1-10任一项所述双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，a、将生物标本与双抗夹心ELISA试剂盒中的捕获剂接触并保温；b、将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物；c、在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入双抗夹心 ELISA试剂盒中的酶标二抗，得双抗夹心复合物；d、检测结合于捕获剂的过氧化物还原酶 IV的含量。
15.根据权利要求14所述的运用双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，其特征在于所述方法还包括将步骤d所得的过氧化物还原酶IV的含量与正常人进行比较判断。
16.根据权利要求14所述的运用双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，其特征在于步骤a中，将捕获剂包被酶标板，将待测生物标本与捕获剂接触，保温并用封闭液封闭；所述生物标本为不大于200倍体积稀释的血清稀释液，所述捕获剂为小鼠抗过氧化物还原酶IV抗体IgG作不大于640倍体积稀释的稀释液。
17.根据权利要求14所述的运用双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，其特征在于步骤b中，将步骤a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物。
18.根据权利要求14所述的运用双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，其特征在于步骤c中，在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入双抗夹心ELISA试剂盒中的酶标二抗进行保温反应，得双抗夹心复合物；所述酶标二抗为HRP标记的大鼠抗人过氧化物还原酶IV抗体IgG作不大于640倍体积稀释液的稀释液。
19.根据权利要求14所述的运用双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，其特征在于步骤d中，在步骤c所得的双抗夹心复合物中加入色原底物避光显色后， 加入终止液终止反应得显色样品液，通过测显色样品液的OD45tlnm值检测结合于捕获剂的过氧化物还原酶IV的含量。
20.根据权利要求14所述的运用双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，其特征在于所述方法还包括阴性对照组和空白对照组，所述阴性对照组为源自于正常人的生物标本。
21.根据权利要求20所述的运用双抗夹心ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV含量的方法，其特征在于所述待测生物标本的OD45tlnm值大于阴性对照组样本的OD45tlnm值平均值与其2倍标准方差之和时，判定为过氧化物还原酶IV阳性，所述待测生物标本的OD45tlnm值小于或等于阴性对照组样本的OD45tlnm值平均值与其2倍标准方差之和时则为阴性。
全文摘要
本发明涉及医学检验领域，特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ的双抗夹心ELISA试剂盒，其包括以抗过氧化物还原酶Ⅳ的特异性单抗和/或多抗组成的捕获剂、酶标二抗、样品稀释液、底物；该试剂盒可专用于过氧化物还原酶Ⅳ含量的检测，进而判断人体过氧化物还原酶Ⅳ水平是否超标；本试剂盒特异性和敏感性高。
文档编号G01N33/577GK102346190SQ20111002563
公开日2012年2月8日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者吴乔, 吴玉章 申请人:中国人民解放军第三军医大学