专利名称：蛋白质复合物及其在肿瘤诊断和/或预后评估中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了蛋白质复合物，还提供了所述蛋白质复合物在制备用于诊断和/或预后评估癌症的试剂中的用途，及利用所述蛋白质复合物的相关信息诊断和/或预后评估哺乳动物包括人的癌症的方法。本发明通过分析血清中蛋白质复合物的存在形式和定量分析，可以对肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和甲状腺癌等及其它慢性疾病进行辅助诊断和/或预后评估。
背景技术：
目前使用的癌症标志物主要指癌细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，或是宿主对体内新生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质。临床上常用的癌症标志物有前列腺特异性抗原(PSA，可辅助诊断前列腺癌)；甲胎蛋白(AFP，可辅助诊断急慢性肝炎、 原发性肝癌等)；癌胚抗原(CEA，在结肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和乳腺癌中有较高的表达)；糖蛋白抗原CA125(可辅助诊断卵巢癌)；CA19-9(在胰腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、胆囊癌、肺癌和乳腺癌等中均有高表达)；鳞状细胞相关抗原(SCC，可辅助诊断鳞状上皮癌)；细胞角蛋白19 (与CEA联合应用可辅助诊断肺癌)。这些标志物都是单一肽链蛋白，其检测方法是利用免疫发光法检测，其操作复杂，费用较高，敏感性或特异性不高(Sturgeon，C.M. etal.Serumtumour markers how to order and interpret them. BMJ. 2009,339 :852-858.Hartwell, L et al.Cancer biomarkers a systems approach. Nat Biotechnol.2006，24(8) :905-908.)。这些标志物有的不存在于正常人体内，有的在癌症病人体内含量超过健康人体内含量。通过测定其存在或含量可辅助诊断肿瘤、分析病程、指导治疗、监测复发或转移、判断预后。一般认为好的癌症标志物应具有下列特点(I)敏感性高，能早期测出癌症患者；(2)特异性好；(3)有器官特异性，能对癌症定位；(4)血清中浓度与瘤体大小、临床分期相关，可用以判断预后；(5)半衰期短，能反映癌症的动态变化，监测治疗效果、复发和转移；(6)测定方法准确性高，操作简便，价廉。但至今为止，还没有发现这类癌症标志物。蛋白质复合物(protein complex)是指具有两个或两个以上多肽链非共价键相互作用所形成的复合物。一般蛋白质复合物可分为结构型蛋白质复合物和功能型蛋白质复合物。蛋白质复合物在多种生物学过程中发挥着重要作用。这种相互作用存在于机体细胞的生命活动过程中，参与代谢、物质转移、信息传递等，不同的蛋白质复合物具有不同的生物学功倉泛(Babusiak, M. , et al. Native proteomic analysis of protein complexesin murine intestinalbrush border membranes. Proteomics. 2007, 7(I) :121-129.)。血液中蛋白质复合物在调节凝血过程、疾病发生过程中发挥着重要的生物学功能，例如甲胎蛋白-IgM的复合物在原发性肝细胞癌患者血清中含量升高，利用免疫学方法检测此复合物可诊断原发性肝细胞癌，其灵敏性和特异性优于单独使用甲胎蛋白(Jingting，J.，et al. Clinical evaluation of serumalpha—fetoprotein—IgM immune complexes onthe diagnosis of primary hepatocellular carcinoma. JClin Lab Anal. 2009，23 (4)213-218.)。因此，如果能发现新的可用于诊断恶性疾病，特别是肿瘤的蛋白质复合物及利用所述蛋白质复合物简便地诊断和/或辅助诊断或预后评估恶性疾病，特别是肿瘤的方法将具有重要的经济、健康和社会效益
发明内容
因此，本发明的技术目的在于发现新的蛋白质复合物及其在慢性疾病，特别是肿瘤诊断和/或预后评估中的用途。因此，本发明的第一方面涉及一种蛋白质复合物，其具有通式I :[ (HPT) nl (CFH) n2 (C3) n3 (C4A) n4 (C5) n5 (C7) n6 (IgGl)n7 (ApoA-I) n8 (IgAl)n9],其中，HPT代表触珠蛋白，Apo A-I代表载脂蛋白A_I，CFH代表补体H，C3代表补体3，C4A代表补体4A，C5代表补体5，Cl代表补体7，IgGl代表免疫球蛋白Gl, IgAl代表免疫球蛋白Al ；其中，nl= 1、2、3、4 或 5, n2 = 0 或 I, n3 = 0 或 I, n4 = 0 或 I, n5 = 0 或 I, n6=0或1,117 = 0、1、2、3、4或5,118 = 0或1,119 = 0或1;且其中该蛋白质复合物的分子量范围为140 1400kDa。优选地，所述蛋白质复合物具有选自通式II至VII的通式，其中通式II [ (HPT)nl (CFH)n2(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n2 = l，n3 =1，n4 = 1，n7 = 1，n9 = I ；通式III [ (HPT)nl(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (Apo A_I)n8 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3 = 1，n4 = 1，n7 = 1，n8 = 1，n9 = I ；通式IV :[ (HPT)nl (C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n3 = 1，n4 = 1，n7=1，n9 = I ;通式V:[ (HPT)nl (C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6 (IgGl)n7 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3= 1，n4 = 1，n5 = 1，n6 = 1，n7 = 1，n9 = I ；通式VI [ (HPT)nl (C3)n3(Apo A_I)n8(IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3,n3 = I, n8 = I, n9 = I或通式VII:[ (HPT)nl (CFH)n2(C3)n3 (IgGl)n7 (IgAl)n9L 其中 nl = 1、2、3、4 或 5，n2 = l，n3 = 1，n7 = 1、2、3、4 或 5，n9 = I。本发明的第二方面涉及上述的蛋白质复合物，其用于制备诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的试剂，优选地，所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。本发明的第三方面涉及上述的蛋白质复合物在制备诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的试剂中的用途，优选地，所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。本发明的第四方面涉及一种诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的方法，其包括以下步骤A)获取患者或健康状况未知的哺乳动物包括人血液，经离心后得到血清或血浆，作为样本；B)分别取0. 5 100 ii L样本和等体积的0. 5 100 U L外参照血清，进行native-PAGE电泳,所述外参照血清为混合的健康人血清,其中native-PAGE电泳的条件按本领域的常规条件进行，分离胶的浓度为4% -10%质量体积比；C)电泳完毕后，用本领域已知的凝胶染色方法将凝胶染色，然后扫描凝胶，获得凝胶电泳图，优选地，所述凝胶染色方法为银染或考马斯亮蓝染色；D)根据上述步骤C)电泳图中的凝胶条带，对照说明书附图
I中的条带类型，将样本血清归类，其中标记凝胶条带时按条带分子量从大到小的顺序从I开始进行；E)利用Quantity One软件分析上述步骤C)凝胶电泳图中样本和对照的目标条带，以代表转铁蛋白相关复合物的第19个凝胶条带为内参照，将其含量归一化，利用软件，输出归一化后每个凝胶条带的光密度值，记为NQn，其中n为凝胶条带的标记；F)利用下面的公式依次计算样本中每个凝胶条带的相对表达量，记为ratio，
ration = [NQn]样本/[NQn]外参照,其中n为凝胶条带的标记；G)根据上述步骤D)中样本血清的类型，选择相应的相对表达量值带入到回归方程，计算分值，记为score，然后对比下表中癌症的阈值，判断样本是否为癌症或其它慢性疾病，
权利要求
1.一种蛋白质复合物，其具有通式I: [(HPT) nl (CFH) n2 (C3) n3 (C4A) n4 (C5) n5 (C7) n6 (IgGl)n7 (ApoA-I) n8 (IgAl)n9], 其中，HPT代表触珠蛋白，Apo A-I代表载脂蛋白A-I，CFH代表补体H，C3代表补体3，C4A代表补体4A，C5代表补体5，C7代表补体7，IgGl代表免疫球蛋白Gl，IgAl代表免疫球蛋白Al ； 其中，nl = 1、2、3、4或5,112 = 0或1,113 = 0或1,114 = 0或1,115 = 0或1,116 = 0或 l,n7 = 0、1、2、3、4 或 5,n8 = 0 或 l,n9 = 0 或 I ; 且其中该蛋白质复合物的分子量范围为140 1400kDa。
2.根据权利要求I所述的蛋白质复合物，其特征在于所述蛋白质复合物具有选自下述通式II至通式VII的通式，其中 通式II [(HPT)nl (CFH)n2(C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n2 = 1，n3 = 1，n4 = I, n7 = I, n9 = I ； 通式III [(HPT)nl (C3)n3 (C4A)n4 (IgGl)n7 (Apo A_I)n8 (IgAl)n9]，其中 nl = 1、2 或 3，n3 = l，n4 =I, n7 = I, n8 = I, n9 = I ； 通式IV [(HPT)nl (C3)n3(C4A)n4 (IgGl)n7 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3，n3 = l，n4 = l，n7 = 1，n9 = I ； 通式V [(HPT)nl (C3)n3 (C4A)n4 (C5)n5 (C7)n6 (IgGl)n7 (IgAl)n9]，其中 nl = I、2 或 3，n3 = I，n4 =I, n5 = I, n6 = I, n7 = I, n9 = I ； 通式VI [(HPT)nl (C3)nS (Apo A-I)n8 (IgAl)n9],其中 nl = 1、2 或 3, n3 = I, n8 = I, n9 = I 或 通式VII [(HPT)nl (CFH)n2(C3)n3 (IgGl)n7 (IgAl)n9L 其中 nl = 1、2、3、4 或 5，n2 = 1，n3 = 1，n7=1、2、3、4 或 5,n9 = I。
3.根据权利要求I或2所述的蛋白质复合物，其用于制备诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的试剂。
4.根据权利要求3所述的蛋白质复合物，其特征在于所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。
5.根据权利要求I或2所述的蛋白质复合物在制备诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的试剂中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。
7.—种诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的方法，其包括以下步骤 A)获取患者或健康状况未知的哺乳动物包括人血液，经离心后得到血清和血浆，作为样本； B)分别取0.5 100 ii L样本和等体积的0. 5 100 ii L外参照血清，进行native-PAGE电泳，所述外参照血清为混合的健康人血清，其中native-PAGE电泳的条件按本领域的常规条件进行，分离胶的浓度为4% -10%质量体积比； C)电泳完毕后，用本领域已知的凝胶染色方法将凝胶染色，然后扫描凝胶，获得凝胶电泳图，优选地，所述凝胶染色方法为银染或考马斯亮蓝染色； D)根据上述步骤C)电泳图中的凝胶条带，对照说明书附图I中的条带类型，将样本血清归类，其中标记凝胶条带时按条带分子量从大到小的顺序从I开始进行； E)利用QuantityOne软件分析上述步骤C)凝胶电泳图中样本和对照的目标条带，以代表转铁蛋白相关复合物的第19个凝胶条带为内参照，将其含量归一化，利用软件，输出归一化后每个凝胶条带的光密度值，记为NQn，其中n为凝胶条带的标记； F)利用下面的公式依次计算样本中每个凝胶条带的相对表达量，记为ratio， ration = [NQJ样本/[NQn]外参照,其中n为凝胶条带的标记； G)根据上述步骤D)中样本血清的类型，选择相应的相对表达量值带入到回归方程，计算分值，记为score，然后对比下表中癌症的阈值，判断样本是否为癌症或其它慢性疾病
8.根据权利要求7所述的诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的方法，其特征在于所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。
全文摘要
本发明涉及蛋白质复合物及其在肿瘤诊断和/或预后评估中的应用。具体而言，本发明涉及一种蛋白质复合物、用于制备诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的试剂的蛋白质复合物、诊断哺乳动物包括人癌症的方法。本发明利用积累的资料总结出了人类血清或血浆在非变性PAGE电泳上蛋白质复合物的主要类型及主要蛋白质复合物的组成并建立了蛋白质复合物含量与肿瘤间的关系，为肿瘤及其它慢性疾病的诊断和/或预后评估提供一种新的方法。
文档编号G01N33/68GK102633882SQ20111003763
公开日2012年8月15日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者李智立, 王彦英 申请人:中国医学科学院基础医学研究所