专利名称：一种检测目标微生物的方法及生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，特别是ー种检测目标微生物的方法及生物传感器。
背景技术：
1990年，两名科学家采用体外筛选与PCR相结合的新技术从人工构建的寡核苷酸文库中分别筛选到了与有机染料和噬菌体DNA聚合酶特异性结合的寡核苷酸序列。这种新技术后来被命名为指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment, SELEX),筛选 到的寡核苷酸被命名为适配子(aptamer)。适配子是人工合成的单链寡核苷酸(DNA或RNA)，能够与靶物质进行高特异性与亲和性地结合，其功能类似抗体，但比抗体具有更多的优势，包括如下几个方面(I)靶分子范围广。可以从金属离子等小分子到蛋白质这样的大分子乃至整个细胞。(2)高特异性与亲和性。适配子能够识别出靶分子结构上如甲基与羟基这样的细微区別，且与靶分子结合后的解离常数处于纳摩尔和皮摩尔水平。(3)体外筛选，易人工合成。可以通过SELEX技术的自动化进行大批量低成本生产，且批间差异较小，同时也能针对毒素及免疫原性较弱的物质进行筛选。(4)稳定性好。对温度及PH不敏感，易于保存与运输。(5)易修饰，便于标记。可以在适配子寡核苷酸的精确位点进行修饰，增强其稳定性，同时能够连接各种标记分子与药物，进行临床诊治。(7)分子小，空间位阻小。可以与靶分子高效绑定，也易实现细胞内药物运送与治疗。如此优良的特性越来越受学者们的青睐。随着SELEX技术的不断发展，目前科学家已经将整个细胞、病毒及细菌作为靶物质对其进行适配子的筛选，并且取得了较大的进展。2010年，0hk，S.H.等通过SELEX技术筛选到了单核细胞增生李斯特氏菌的适配子(AS)，这段单链DNA寡核苷酸序列能够高特异性与亲和性地与单核细胞增生李斯特氏菌结合。胶体金又称金纳米颗粒，是指尺寸在I-IOOnm的金颗粒，具与宏观物质不同的特性，如比表面积大、量子尺寸效应等。除此之外，金纳米颗粒自身还具有很多特殊的性质(I)光谱学性质纳米金属颗粒由于粒子表面导电，电子振荡强度的聚集会形成特征等离子体共振吸收峰(520nm左右)，井随粒子尺寸的变化，吸收峰位置也发生一定程度的红移。如果金纳米颗粒发生聚集，吸收峰会转移至600-700nm范围内。最大吸收峰位置不同，不同尺寸的金颗粒颜色会发生改变，即随着半径的増大、粒子间距离的变化，颜色发生由黄色、红色到蓝色的变化。将此方法用于生物检测中，不但简化了操作步骤，而且还可以获得较高的灵敏度。目前，在生化及医学领域受到了广泛的重视，并产生了很多检测试纸，主要就是应用了纳米金聚集产生颜色变化来判断检测結果。(2)化学性质。金纳米颗粒可以与ー些亲和试剂发生吸附，生成ー些具有特殊功能的基团。例如，金颗粒可以与氨基发生非共价键的静电吸附；可以与巯基产生强的共价键，不改变金纳米颗粒相似的光谱学性质，为其在生物检测中的应用提供了依据。此外柠檬酸钠处理过的纳米金颗粒在NaCl存在的情况下极为不稳定，很容易发生聚集，这ー性质也经常用于生物学的研究，目前常用的纳米金颗粒均经过柠檬酸钠处理。
但是目前没有纳米金与适配子结合起来进行病原微生物检测的报道。
发明内容
本发明根据上述领域的空白，提供一种种检测目标微生物的方法及生物传感器。能够简便、快速、准确地检测是否存在目标，如致病菌、病毒等。一种检测目标微生物的方法，其特征在于，将待测微生物制成的菌悬液加入到含有目标微生物的适配子和适配子互补链的胶体金颗粒溶液中孵育，所述适配子互补链连接在胶体金颗粒I表面，通过目标微生物与适配子的识别结合使胶体金颗粒的聚散状态发生改变产生的溶液颜色变化来判断检测结果。所述适配子连接在胶体金颗粒II表面。所述胶体金颗粒溶液的溶剂为1OmM PB, O. 3M NaCl, pH 7. 4的PBS溶液。所述菌悬液与所述胶体金颗粒溶液的体积比为0. 5 3 1
所述胶体金颗粒溶液中适配子的浓度为O. 5uM。所述菌悬液的溶剂为IOmM PB, O. 3M NaCl，pH7. 4的PBS溶液所述目标微生物为单核细胞增生李斯特氏菌，所述适配子的核苷酸序列如Seq IDNo. 2所示，所述孵育温度为4摄氏度。所述菌悬液在加入到胶体金颗粒溶液之前先在4摄氏度孵育2 5分钟。根据上述检测目标微生物的方法制作的生物传感器，包含目标微生物的适配子和纳米金颗粒I，所述纳米金颗粒I表面连接有适配子互补链，所述适配子互补链与适配子互补配对相连。所述目标微生物的适配子连接在纳米金颗粒II表面。本发明基于适配子与纳米金颗粒的特性，提供ー种新的目标微生物的检测方法。以单核细胞增生李斯特氏菌为例，根据Ohk, S. H.等发表的文章"Antibody-aptamerfunctionallzea fibre-optic Diosensor for specmc detection of Listeriamonocytogenes from food. " Journal of Applied Microbiology(2010)109(3)808-817.中记载的单核细胞增生李斯特氏菌适配子序列信息，设计出用于本发明的具有如Seq ID No. I所示核苷酸序列的适配子；适配子的互补链修饰纳米金颗粒构成纳米金颗粒1，纳米金颗粒I与适配子结合形成具有DNA双链修饰的纳米金颗粒传感器-即生物传感器
1。在含有该生物传感器的PBS溶液中，由于双链DNA之间带有负电荷，发生静电排斥，使纳米金处于分散状态，因此呈现红色。用于检测时，在含有生物传感器I的溶液中加入单核细胞增生李斯特氏菌悬液时，适配子与单核细胞增生李斯特氏菌结合后脱离纳米金颗粒表面，纳米金颗粒由于都经过柠檬酸钠修饰，在PBS溶液中NaCl成分的作用下聚集到一起，使溶液呈现蓝色。根据相同原理，本发明还提供生物传感器II，即将适配子也连接在纳米金颗粒上制得纳米金颗粒II，在这种实施方式下，本发明的生物传感器II是携带有适配子的纳米金颗粒II与携帯有适配子互补链的纳米金颗粒I通过适配子与其互补链互补连接构成的聚合物，即納米金颗粒I和纳米金颗粒II两种颗粒之间通过碱基互补原理使得两种纳米金颗粒聚集在一起，因此试剂为使用时呈现蓝色。用于检测时，在含有生物传感器II的PBS溶液中，加入单核细胞增生李斯特氏菌悬液后，适配子与单核细胞增生李斯特氏菌发生高亲和性的特异性结合，携带适配子的纳米金颗粒与携带适配子互补链的纳米金颗粒之间失去连接作用，各自分散在溶液中，呈现红色。通过颜色的变化对单核细胞增生李斯特氏菌的有无进行检测筛查。从本发明的生物传感器的检测原理及本发明实施例中特异性试验、敏感性试验结果可以看出，本发明的生物传感器及方法具有快速检测，避免了繁琐的步骤，廉价，只需要肉眼即可观察；低技术含量，不需要专业人士及特殊培训等优点，非常适用于临床及食品质检中心对目标微生物的筛查和半定量測量。单核细胞增生李斯特氏菌是ー种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壌、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为O. 6-16%，有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及 其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。尤其是食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4°C的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视，因此本发明本发明的实施例以单核细胞增生李斯特氏菌为例提供验证本发明的方法和生物传感器，另ー方面为检测该菌提供了直接可用的检测方法。但本发明的生物传感器不限于单核细胞增生李斯特氏菌，随着适配子研究的进展，人们可能获得有越来越多种属的细菌、真菌、病毒、原虫等微生物各自的特异性适配子，本发明的生物传感器适用于所有这些具有特异性适配子的微生物的检测，因为本发明的核心在于以下构思目标微生物与适配子之间的特异性识别作用来改变生物传感器溶液中纳米金颗粒的聚散状态，井根据纳米金颗粒的聚散变化带来的颜色变化来判断待测微生物是否是目标微生物。
图I本发明的生物传感器I检测原理示意图，图2本发明的生物传感器II检测原理示意图，其中I-胶体金颗粒1，2_适配子互补链，3-适配子，4-目标菌，5_胶体金颗粒II。图3敏感性试验結果，横坐标为菌液浓度。单位为cfu/ml，纵坐标为颜色強度。图4特异性试验结果横坐标为菌组合，纵坐标为颜色強度。
具体实施例方式实施例I.生物传感器I的制备材料纳米金颗粒商购于海德创业生物有限公司，货号为25516。单核细胞增生李斯特氏菌适配子AS :
5， -ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3，在其5’端进行延长及疏基修饰，委托上海生物工程公司合成，得到用于试验的适配子，其序列如下5，-TTTATGTTGATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGGTTGAT-3，适配子互补链，其序列如下5， -TAGGTACCCCGCCTCTACTCCCCCTCCTCCCGCCCATGGGCCAACTA-3’方法
步骤I.纳米金颗粒I和生物传感器I的制备准备EP管1，加入纳米金颗粒400uL与IOOuL 2. 5uM适配子互补链；调整PH值为
8.2，将其置于室温避光反应24h。然后于高速离心机中16000rp/min，离心20分钟，弃去上清以除去多余的适配子及其对应的互补链，然后用枸櫞酸钠4mM洗涤，重复离心洗涤一次。步骤2、生物传感器的构建在步骤I得到的EP管I加入IOOuL 2. 5uM适配子，溶解于装有PBS (IOmM PB, O. 3MNaCl,pH 7.4)的EP管3中，置于70°C的水浴箱中反应lOmin，取出置于室温2h，可见EP管3中发生颜色改变，显示为红色，说明在PBS溶液中生成了生物传感器I。然后用PBS溶液洗漆，之后8000rmp/min离心5min,重复洗漆离心步骤两次,将其溶解于500uL PBS溶液中，
储存于4°C备用。实施例2.生物传感器II的制备步骤I.纳米金颗粒I和纳米金颗粒II的制备材料纳米金颗粒适配子及其互补链同实施例I准备EP管I，加入纳米金颗粒400uL与100uL2. 5uM适配子互补链；准备EP管2，加入金纳米颗粒400uL与IOOuL 2.5uM适配子。调整PH值为8. 2，将其置于室温避光反应24h。然后将两支EP管至于高速离心机中16000rp/min，离心20分钟，弃去上清(除去多余的适配子及其对应的互补链)，然后用枸櫞酸钠4mM洗涤，重复离心洗涤一次，管I、管2中分别为纳米金颗粒I和II。步骤2、生物传感器II的构建材料PBS溶液10mM Tris-HCl (pH 7. O)，4mM MgCl2,10 μ M ニ硫苏糖醇。将步骤2得到EP管I、EP管2的核苷酸修饰的纳米金颗粒溶解于装有500ulPBSdOmM PB, O. 3M NaCl，pH 7.4)的EP管3中，置于70°C的水浴箱中反应lOmin，取出置于室温2h，可见EP管3中发生颜色改变，显示为蓝色，说明在PBS溶液中生成了生物传感器
II。然后用PBS溶液洗涤，之后8000rmp/min离心5min，重复洗涤离心步骤两次，将其溶解于500uLPBS溶液中，储存于4°C。按步骤1、2同时制备多管生物传感器II备用。实施例3.生物传感器灵敏度检测材料单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，菌株号为15313，本实验室也有保存，可向公众发放用于验证试验。步骤I :将单核细胞增生李斯特氏菌悬于PBS溶液中，并进行如下倍比稀释8 个样品空白对照，I X 102CFU/ml, I X 103CFU/ml, I X 104CFU/ml, I X 105CFU/ml,I X 106CFU/ml, I X 107CFU/mlo置于4摄氏度冰箱中2min取8支EP反应管中，加入实施例2中制得的生物传感器II的PBS溶液200uL，调整PH值在6. 5-6. 8之间，置于4摄氏度冰箱中2min。将8个样品细菌悬浮液500uL分别加入到8支EP反应管中，置于4摄氏度冰箱中2min，观察8支管的颜色变化，菌悬液为I X 102CFU/ml的样品，显色为橘红色，反应原理见图1，即本发明的生物传感器检测灵敏度可到lX102CFU/ml以下。如图3所示。采用实施例I的生物传感器I检测，反应原理见图2，结果与生物传感器II的反应一致，只是显示顔色为从浅至深的蓝色。上述结果也提示，经过设置标准浓度梯度的菌悬液，浓度与检测出现的颜色強度之间制成相关曲线，可以用于半定量待测菌。实施例4.生物传感器特异性检测材料金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌，这些菌均为已知菌，本实验室均有保存，可向公众方法用于验证试验。制备非单核细胞增生李斯特氏菌PBS菌悬液，浓度均为lX105CFU/ml，采用生物传感器I，如实施例3的操作进行检测，其中设置空白对照与单核细胞增生李斯特氏菌lX105CFU/ml的阳性对照。结果显示，非单核细胞增生李斯特氏菌均观察不到颜色的变化。如图4所示的柱状图，五组柱状图左右组合依次为单核细胞增生李斯特氏菌/金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌/大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌/肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特氏菌/铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌/肺炎链球菌，左侧柱状图均为红色，右侧颜色依次 为灰色、淡蓝、橘黄、紫兰、橘黄。
权利要求
1.ー种检测目标微生物的方法，其特征在干，将待测微生物制成的菌悬液加入到含有目标微生物的适配子和适配子互补链的胶体金颗粒溶液中孵育，所述适配子互补链连接在胶体金颗粒I表面，通过目标微生物与适配子的识别结合使胶体金颗粒的聚散状态发生改变从而产生的溶液颜色变化来判断检测結果。
2.根据权利要求I所述的方法，所述适配子连接在胶体金颗粒II表面。
3.根据权利要求I或2所述的方法，所述胶体金颗粒溶液的溶剂为IOmMPB,O. 3MNaCl，pH 7.4 的 PBS 溶液。
4.根据权利要求I或2所述的方法，所述菌悬液与所述胶体金颗粒溶液的体积比为.O. 5 3 I。
5.根据权利要求I或2所述的方法，所述胶体金颗粒溶液中适配子的浓度为O.5uM。
6.根据权利要求I或2所述的方法，所述菌悬液的溶剂为IOmMPB, O. 3MNaCl, pH 7. 4的PBS溶液。
7.根据权利要求I或2所述的方法，所述目标微生物为单核细胞增生李斯特氏菌，所述适配子的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示，所述孵育温度为4摄氏度。
8.根据权利要求7所述的方法，所述菌悬液在加入到胶体金颗粒溶液之前先在4摄氏度预处理2 5分钟。
9.根据权利要求I 8任一所述的方法制作的生物传感器,其特征在于包含目标微生物的适配子和纳米金颗粒I，所述纳米金颗粒I表面连接有适配子互补链，所述适配子互补链与适配子互补配对相连。
10.根据权利要求9所述的生物传感器，所述目标微生物的适配子连接在纳米金颗粒II表面。
全文摘要
本发明涉及一种检测目标微生物的方法及生物传感器，属于生物检测领域。其特征在于，将待测微生物制成的菌悬液加入到含有目标微生物的适配子和适配子互补链的胶体金颗粒溶液中孵育，所述适配子互补链连接在胶体金颗粒I表面，通过目标微生物与适配子的识别结合使胶体金颗粒的聚散状态发生改变从而产生的溶液颜色变化来判断检测结果。本发明根据该方法还提供了生物传感器。能够简便、快速、准确地检测是否存在目标微生物，如致病菌、病毒等。
文档编号G01N21/78GK102645430SQ20111003958
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者刘星, 府伟灵, 张晓莉, 王丰, 苗杰, 陈栋, 黄君富, 黄庆 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院