专利名称：cyclin G1蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种cyclin Gl蛋白的应用，具体地说，涉及一种 cyclin Gl蛋白作为判断肝癌预后的蛋白质分子标记的应用。
背景技术：
肝癌是恶性程度极高、预后极差的肿瘤，在全世界肿瘤发病率位居第六，其病死率 更是高居第三位，为0. 96，居所有癌症之首，故号称“癌中之王”。临床肝癌诊疗中存在的早 期诊断难、复发转移率高、治疗缺乏针对性、源头创新药物和治疗手段少等难点问题的解决 仍未有很大进展。统计资料表明，肝癌术后高转移复发率(5年复发率达70%，小肝癌也达50%)已 成为进一步提高远期疗效的瓶颈，也是攻克肝癌的重要关键。复发转移的机理不明是临床 缺少肝癌预后判断指标和有效治疗手段的主要原因。肝癌转移是一个多因素参与并相互作用的复杂过程，涉及癌细胞本身、癌细胞与 癌周微环境及宿主免疫状态的相互作用；这些方面的多种因素异常参与了肝癌的转移过 程。国内外研究发现不少的癌基因、生长因子等与肝癌细胞侵袭性相关，多种细胞外基质成 分也有重要作用，且可能与原发瘤的基因特性有关。目前研究发现CK19、HSP27等可以作为 潜在的肝癌转移复发的预测指标，但是这些指标的敏感性及特异性尚难以满足临床预测要 求。由于传统的临床预后指标有其自身的局限性，尚不能完全反映肝癌的生物学特性。基 于肝癌诊断、治疗和预后判断的目的，研究在肝癌中高表达、敏感性及特异性能满足临床要 求的基因和/或蛋白，并进一步开发和应用具有重要的意义。
发明内容
本申请的发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测 cyclin Gl蛋白在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现远处转移的风险及术 后状况。基于cyclin Gl蛋白的相对表达量与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为分子 标记对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断。因此，本发明的首要目的在于提供一种cyclin Gl蛋白的应用。本发明提供的cyclin Gl蛋白的应用，用于制备判断手术后肝细胞癌患者的预后 的蛋白质分子标记。进一步的，所述检测是检测该蛋白在肝细胞癌组织中的相对表达量。本发明的另一个目的在于提供抗cyclin Gl蛋白的抗体的应用，用于制备判断肝 癌手术预后的制剂。进一步的，所述抗cyclin Gl蛋白的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗 体。本发明的再一个目的在于提供抗cyclin Gl蛋白的抗体的另一应用，用于制备判 断肝癌手术预后的试剂盒。进一步的，所述抗cyclin Gl蛋白的抗体包括单克隆抗体和多 克隆抗体。
本发明的又一目的在于提供体外检测肝细胞癌组织中cyclin Gl蛋白的相对表达 量的方法，该方法包括以下步骤(1)制备肝癌组织石蜡切片，60°C烤箱过夜；(2)切片脱腊至水；(二甲苯① IOmin —二甲苯② IOmin —二甲苯③ IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇5min — 85%乙醇5min — 75%乙醇5min —双蒸水5min)(3)3% H2O2 甲醇液，室温放置 2Omin ；(4)双蒸水洗 5minX3 ；(5)抗原修复切片放入0. OlM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸5min，停火 lOmin，再煮沸 5min ；(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5minX3 ；(7)1% BSA 封闭 30min，37°C ；(8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(兔cyclin Gl多克隆抗体，购自美国Santa Cruz生物技术公司，稀释比例1 75)。置入湿盒中30min，37°C，然后4°C冰箱过夜16小 时；(9)4°〇取出，室温复温1511^11，然后0.0说PBS洗5minX4;(10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无 需稀释)，45min，37°C ；(11)0. OlM PBS 洗 5minX4，DAB 显色 2-10min，镜下观察；(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；(14)脱水透明，盖玻片覆盖；(15)显微镜下观察阳性染色，分别于肝癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野， 拍照；(16)利用生物图像处理软件 Image-Pro plus (Media Cybernetics, Inc.)分析肿 瘤和瘤旁组织阳性信号强度，给出评分。具体方法为，所有的切片照片，均采用同样的参数 设置，测量每张切片的阳性染色区的整合光密度，并计算其和每张照片面积的比值，即为每 张切片阳性密度，用于后续的分析；(17)利用免疫组化染色切片的评分计算肿瘤组织中cyclin Gl蛋白分子相对表 达量(RG值)。具体方法为，将肿瘤组织cyclin Gl染色评分数据除以瘤旁组织评分数据， 得到的比值即为RG值。本发明的cyclin Gl蛋白与肝癌相关性的发现为预测肝细胞癌远处转移风险以及 患者术后的生存或死亡提供一条全新的途径，对判断肝细胞癌患者预后具有重要作用，对 于肝细胞癌病人术后监控和贯序治疗也具有重要的指导意义。当RG值高于1.43时，肝细 胞癌易出现复发或远处转移，肝癌患者术后易死亡。
图1为cyclin Gl在肝细胞癌和癌旁组织中免疫组化染色结果图，(a)显示为低 表达，(b)显示为高表达。
图2为cyclin Gl在60. 6% (103/170)的肝细胞癌组织中呈现高表达图。相对表 达量中位数为1.43。图3为cyclin Gl高表达病例肝癌组织切片免疫组化染色结果，肿瘤组织中可见 cyclin Gl强阳性着色。图4为cyclin Gl低表达病例肝癌组织切片免疫组化染色结果，肿瘤组织中未见 cyclin Gl明显阳性着色。图5为依据cyclin Gl表达高低将肝癌患者分组的总体生存曲线图。图6为依据cyclin Gl表达高低将肝癌患者分组的无瘤生存曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。在以下实施例中，肝癌患者的肿瘤组织切片均来自东方肝胆外科医院，由2名病 理科医生明确为肝细胞癌。本发明采用免疫组化方法检测cyclin Gl蛋白在肝癌组织中的相对表达量，具体 步骤为(1)制备肝癌组织石蜡切片，60°C烤箱过夜；(2)切片脱腊至水；(二甲苯① IOmin —二甲苯② IOmin —二甲苯③ IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇5min — 85%乙醇5min — 75%乙醇5min —双蒸水5min)(3)3% H2O2 甲醇液，室温放置 20min ；(4)双蒸水洗 5min X 3 ；(5)抗原修复切片放入0. OlM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸5min，停火 lOmin，再煮沸 5min ；(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5minX3 ；(7) 1 % BSA 封闭 30min，37 °C ；(8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(兔cyclin Gl多克隆抗体，购自美国 SantaCruz生物技术公司，稀释比例1 75)。置入湿盒中30min，37°C，然后4°C冰箱过夜 16小时；(9)4°〇取出，室温复温1511^11，然后0.0说PBS洗5minX4;(10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无 需稀释)，45min，37°C ；(11)0. OlM PBS 洗 5minX4，DAB 显色 2-10min，镜下观察；(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；(14)脱水透明，盖玻片覆盖；(15)显微镜下观察阳性染色，分别于肝癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野， 拍照；(16)利用生物图像处理软件 Image-Pro plus (Media Cybernetics, Inc.)分析肿瘤和瘤旁组织阳性信号强度，给出评分。具体方法为，所有的切片照片，均采用同样的参数 设置，测量每张切片的阳性染色区的整合光密度，并计算其和每张照片面积的比值，即为每 张切片阳性密度，用于后续的分析；(17)利用免疫组化染色切片的评分计算肿瘤组织相对瘤旁组织cyclin Gl蛋白 分子相对表达量(RG值)。具体方法为，将肿瘤组织cyclin Gl染色评分数据除以瘤旁组织 评分数据，得到的比值即为RG值。如图1所示，(a)和(b)分别为cyclin Gl在肝细胞癌和癌旁组织中的低表达和高 表达的免疫组化染色图片，经多组实验验证，如图2所示，cyclin Gl在60.6% (103/170) 的肝细胞癌组织中呈现高表达。实施例1样本某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检 测cyclin Gl蛋白在肝癌组织中的相对表达量。肝癌组织和癌旁组织的显微图片如图3所 示。经计算，RG值为3. 60。经术后随访知，该患者术后14个月死亡，无瘤生存期仅13个月。实施例2样本某肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检 测cyclin Gl蛋白在肝癌组织中的相对表达量。肝癌组织和癌旁组织的显微图片如图4所 示。经计算，RG值为0. 11。经术后随访知，该患者术后无瘤存活60个月，截止随访期结束仍健在。实施例3随机取肝癌患者手术切除肝组织，制备肝癌细胞癌患者肿瘤的组织切片，采用以 上免疫组化方法的试验步骤检测cyclin Gl蛋白在肝癌组织中的相对表达量，计算RG值。 依据cyclin Gl表达高低(RG值高于1. 43为高表达，RG值低于1. 43为低表达)将肝癌患 者分组，绘制总体生存曲线图(图5)和无瘤生存曲线图(图6)。结果表明肿瘤中cyclin Gl呈高表达的患者手术后总体生存期和无瘤生存期明显短于低表达者。由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测cyclin Gl蛋白分子相对表 达量能够预测肝细胞癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当RG值高于1. 43时， 肝细胞癌易出现远处转移，肝癌患者术后易死亡。显然，cyclin Gl蛋白与肝细胞癌患者预 后具有相关性，因此，以cyclin Gl蛋白作为蛋白质分子标记，检测其相对表达量能预测肝 细胞癌手术后复发转移等事件，并判断预后。相应的，特异性抗cyclin Gl蛋白的抗体，包 括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备确定肝癌手术预后的制剂或试剂盒，这对于本领 域技术人员来说是显而易见的。
权利要求
1.一种cyclin Gl蛋白的应用，其特征在于，用于制备判断肝癌手术预后的蛋白质分 子标记。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测是检测该蛋白在肝细胞癌组织中 的相对表达量。
3.一种抗cyclin Gl蛋白的抗体的应用，其特征在于，用于制备判断肝癌手术预后的 制剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗cyclinGl蛋白的抗体包括单克隆抗 体和多克隆抗体。
5.一种抗cyclin Gl蛋白的抗体的应用，其特征在于，用于制备判断肝癌手术预后的试齐U盒。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗cyclinGl蛋白的抗体包括单克隆抗 体和多克隆抗体。
7.—种体外检测cyclin Gl蛋白在肝癌组织中的相对表达量的方法，其特征在于，包括(a)将肝癌组织切片进行免疫组化染色；(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；(c)利用生物图像处理软件分析肿瘤和瘤旁组织阳性信号强度，给出评分；(d)根据评分计算肿瘤组织中cyclinGl蛋白分子表达量。
全文摘要
本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和计算机图像处理软件测定肿瘤组织相对瘤旁组织中cyclin G1蛋白相对表达量，并结合术后随访信息，确定cyclinG1蛋白相对表达量与手术后肝细胞癌患者预后存在相关性，cyclinG1蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝细胞癌病人术后监控和贯序治疗也具有重要的指导意义。
文档编号G01N33/68GK102135544SQ20111004462
公开日2011年7月27日 申请日期2011年2月23日 优先权日2011年2月23日
发明者丁劲, 吴琨, 文文, 王红阳 申请人:中国人民解放军第二军医大学