专利名称：中药注射剂鞣质检查方法
技术领域：
本发明涉及中药注射剂杂质检查领域，用于中药注射剂鞣质类杂质，以控制中药注射剂的质量。
背景技术：
中药注射剂最早产生在上世纪四十年代，由钱信忠等学者开创。在中国，中药注射剂已经广泛应用于临床并得到了业界的认可。2010年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵等单方和复方注射剂。中药注射剂在推进中药剂型发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。安全、有效、质量可控依然是中药注射剂的基本质量要求。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的有效性问题(尽管作用机制尚不完全清除)，而安全性问题依然是业界难题。然而，随着中药注射剂的广泛应用于临床，其不良反应日益暴露，特别是致死性不良反应也屡有报道。根据目前公开的不良反应资料，中药注射剂的不良反应可以累及各个系统和脏器，甚至导致死亡。中药注射剂的不良反应与特定的杂质是分不开的。中药注射剂大多为植物提取物。作为生物提取物，在原料提取过程中会带来多种植物大分子杂质，如蛋白质、核酸等。鞣质能与蛋白质结合，是常见的中药注射剂致痛物质。 鞣质的种类较多，鞣质的单体如鞣酸、没食子酸等小分子，也有不同缩合程度的鞣质大分子聚合物。鞣质不稳定，容易氧化、聚合、变色，甚至产生沉淀，是影响中药注射剂质量的主要物质之一。一般认为缩合鞣质不大可能参与中药注射剂的药理作用。因为缩合鞣质的分子量较大，口服不吸收，如果中药注射剂从口服制剂开发而来，那么缩合鞣质是不可能参与疗效的，相反还会导致不良反应。因此2010年版《中华人民共和国国药典(一部)》(以下称 《药典》)也有专门控制鞣质的中药注射剂杂质检查。存在中药注射剂中的鞣质属于混合物，鞣质的分子量是个不确定值，因此分子量和理化性质可能有较大的差别，很难用HPLC和/或质谱等仪器分析方法进行检查。由于鞣质，特别是存在中药注射剂中的缩合鞣质是影响中药注射剂的重要杂质， 因此有必要从严控制。本发明是针对中药注射剂的特点而建立的，对鞣质类杂质检查具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点。
发明内容
本发明利用蛋白质能高强度吸附沉淀鞣质的特点建立本方法，以提高中药注射剂鞣质检查的灵敏性和特异性。本方法包括以下步骤1、将蛋白质吸附膜用蛋白质包被；2、将中药注射剂溶液与蛋白质包被的膜进行接触；3、用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质包被膜；4、观察点样斑点的颜色深浅，判断中药注射剂中的鞣质。在以上步骤1中，用蛋白质包被的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜(Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜)，所用的蛋白质包括但不限于蛋清、牛血清白蛋白。在以上步骤2中，中药注射剂溶液与蛋白质包被膜接触的方式包括但不限于点样方式和过滤方式，与蛋白质包被膜接触之前可以先用甲醇等有机溶剂进行湿润处理。在以上步骤3中，洗涤蛋白质包被膜的有机溶液浓度为0-100%，有机溶剂包括但不限于甲醇和DMSO(二甲基亚砜)。采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限。步骤4进行结果判断时，可以和标准鞣质样品进行对照，以此判断中药注射剂中的鞣质含量。本方法实施的效果是，检查中药注射剂鞣质的灵敏性和特异性高，抗干扰能力强。本发明方法的推荐条件是蛋白质包被的膜采用PVDF膜，注射液与蛋白质包被膜的接触方式为过滤方式，洗涤蛋白质包被膜的有机溶液为DMS0，点样后洗涤3次，每次10分钟。
图1为采用蛋白质包被的PVDF膜以点样方式建立鞣质检查方法，确定本发明检查限的结果图A为在普通PVDF膜上点不同浓度鞣质溶液被甲醇洗涤后的结果；B为采用经10%蛋清溶液包被PVDF膜点样洗涤后的图片；点1到8的焦性没食子酸含量分别为 20. 00,6. 67,2. 22,0. 74,0. 25,0. 08,0. 03、0mg/ml。点样量 1 μ 1。图2为采用蛋白质包被的硝酸纤维素膜(NC膜)以点样方式建立鞣质检查方法， 确定本发明检查限的结果图Α为在普通NC膜上点不同浓度鞣质溶液被甲醇洗涤后的结果；B为采用经10%蛋清溶液包被NC膜点样洗涤后的图片；点1到8的焦性没食子酸含量分别为20. 00,6. 67,2. 22,0. 74,0. 25,0. 08,0. 03、0mg/ml。点样量 1 μ 1。图3为蛋白包被PVDF膜用过滤方式检查溶液中的鞣质限量Α为蛋白包被PVDF 膜，B为普通PVDF膜。点1-5的鞣质浓度为2. 00,0. 67,0. 22,0. 07、0mg/ml (按焦性没食子酸计)，滤过体积为0. 5ml。图4为蛋白质包被PVDF膜点样后被甲醇DMSO混合溶液洗涤的结果图点样的鞣质浓度为20. 00mg/ml (按焦性没食子酸计)；点样量1 μ 1。图5为本发明以点样方式检查酚性中药成分野黄芩苷的结果图Α为将饱和浓度的野黄芩苷水溶液点在普通PVDF膜上，经甲醇洗涤前后的斑点图；B为将饱和浓度的野黄芩苷水溶液点在蛋白质包被PVDF膜上，经甲醇洗涤前后的斑点图；点样量Iy 1。图6为梯度浓度的鞣质按照《中国药典》方法沉淀鞣质后，再取上清液以点样方式用本法检查的结果图点1-7的鞣质理论浓度> 1000、333、111、37· 0,12. 3,4. 11、0μ g/ml。 点样量 μ 。图7为本发明以点样方式检查标准鞣质溶液和蛋清溶液混离心上清液的结果图从左至右各点鞣质的含量分别为20，000、6，667、2，222、741、246、82、27、9、3、1. 5、 0 μ g/ml (按焦性没食子酸计)，点样量1 μ 1。图8为采用吸收曲线法检查标准鞣质溶液吸收光谱图R1-10的鞣质浓度分别为 20，000,6, 667,2, 222、741、246、82、27、9、3、1. 5 μ g/ml (按焦性没食子酸计)，R0 不含鞣质。图9为采用吸收曲线法检查标准鞣质溶和1 %蛋清溶液混离心上清液混合离心上清液的吸收光谱图=Rl-IO的鞣质浓度分别为20，000、6，667、2，222、741、246、82、27、9、3、 1. 5 μ g/ml (按焦性没食子酸计)，RO不含鞣质。图10为本发明以点样方式检查四种中药注射剂鞣质的结果图1、2、3、4分别为清开灵注射液，双黄连注射液，丹参注射液和为灯盏细辛注射液的斑点。图11为本发明以过滤方式检查四种中药注射剂鞣质的结果图1、2、3、4分别为清开灵注射液，双黄连注射液，丹参注射液和为灯盏细辛注射液的斑点。滤过量0. 5ml。
具体实施例方式实施示例1采用点样方式用蛋白质包被的PVDF膜建立中药注射剂鞣质检查方法，确定检查限取一张PVDF膜，用甲醇湿润后浸泡在10%的蛋清溶液中，室温振摇3小时后，取出风干备用。用蒸馏水配制出浓度为20mg/ml的焦性没食子酸溶液5ml，室温自然放置，等溶液的吸光度GlOnm，d = lcm)达到3以上作为鞣质标准储备溶液。取8支1. 5ml试管编号 1-8。1号管加入标准鞣质储备溶液1.5ml。随后于2-8号管各加入蒸馏水lml，从1号管中溶液0. 5ml加入到2号管，混勻后再取0. 5ml加入到3号管，依次配制到7号管。即得到浓度梯度为3倍的一组鞣质标准溶液，鞣质的浓度从1号管到8号管依次为20. 00,6. 67、 2.22、0·74、0·25、0· 08、0. 03、0mg/ml。将被蛋白质包被的PVDF膜用甲醇润湿后，分别点梯度鞣质标准溶液1 μ 1。然后把此膜浸泡在甲醇溶液中洗涤3次，每次10分钟。随后将此膜风干拍照，结果如图1所示。从图1可见，样品点在未被蛋白质包被的PVDF膜上，经甲醇洗涤后此膜基本上无色(图1Α)，而把鞣质标准溶液点在蛋白质包被的PVDF膜上经甲醇洗涤后仍能显示出鞣质的颜色(图1Β)。采用蛋白质包被的PVDF膜，本法检查鞣质的限量为0. 75-0. 25mg/ml。实施示例2采用点样方式用蛋白质包被的NC膜建立中药注射剂鞣质检查方法，确定检查限取一张NC膜浸泡在10%的蛋清溶液中，室温振摇3小时后，取出风干备用。用蒸馏水配制出浓度为20mg/ml的焦性没食子酸溶液5ml，室温自然放置，等溶液的吸光度GlOnm，d = lcm)达到3以上作为鞣质标准储备溶液。取8支1. 5ml试管编号 1-8。1号管加入标准鞣质储备溶液1.5ml。随后于2-8号管各加入蒸馏水lml，从1号管中溶液0. 5ml加入到2号管，混勻后再取0. 5ml加入到3号管，依次配制到7号管。即得到浓度梯度为3倍的一组鞣质标准溶液，鞣质的浓度从1号管到8号管依次为20. 00,6. 67、 2.22、0·74、0·25、0· 08、0. 03、0mg/ml。在被蛋白质包被的NC膜上分别点梯度鞣质标准溶液1 μ 1。然后把此膜浸泡在 50%甲醇溶液中洗涤3次，每次10分钟。随后将此膜风干拍照，结果如图1所示。从图2可见，样品点在未被蛋白质包被的NC膜上，经50%甲醇洗涤后此膜基本上无色(图2Α)，而把鞣质标准溶液点在蛋白质包被的NC膜上经50%甲醇洗涤后点1仍能显示出鞣质的颜色(图2Β)。采用蛋白质包被的NC膜，本法检查鞣质的限量为20mg/ml，对比采用蛋白质包被的PVDF膜，蛋白质包被的NC膜检查效果较劣。
实施示例3采用滤过方式建立蛋白质包被PVDF膜鞣质检查方法，确定检查限量将6mg/ml的焦性没食子酸溶液(pH4_5)，于80°C恒温3天，当410nm吸收值达到3以上后作为鞣质标准物，并按照3倍梯度配制鞣质稀释液；取一张用10%蛋清包被 PVDF膜，安装在小孔滤器上，一头连接真空泵；先用0. Iml甲醇湿润滤膜，随后加入不同浓度的鞣质水溶液0. 5ml，负压通过滤膜；将滤膜取出，加入甲醇(DMSO)溶液置于摇床上振摇 30min ；如此用未被蛋白质包被的PVDF膜进行操作作为对照；洗涤至对照膜基本无色终止洗涤，与凝胶成像仪上拍照，结果如图3所示。结果显示，过滤方式检查鞣质的限量至少在0.07mg/ml以下。因此滤过方式比点样方式检查限低，如果增加检测体积，检测的限量将进一步下降。实施示例4蛋白质包被PVDF膜鞣质斑点的稳定性考察取一张PVDF膜，用甲醇湿润后浸泡在10%的蛋清溶液中，室温振摇3小时后，取出风干备用。用蒸馏水配制出浓度为20mg/ml的焦性没食子酸溶液5ml，室温自然放置，等溶液的吸光度GlOnm，d = lcm)达到3以上作为鞣质标准储备溶液。将蛋白质包被的PVDF膜用甲醇润湿后，多处点20mg/ml的鞣质标准溶液1 μ 1。然后把此膜浸泡在甲醇溶液中洗涤3次，每次10分钟。随后将此膜剪开再浸泡在含不同甲醇和DMSO的混合溶液中洗涤3次，每次10分钟，随后取出拍照。另用未被蛋白质包被的PVDF 膜平行进行试验。结果如图4所示。从图4可见，鞣质点在蛋白质包被的PVDF膜上，经甲醇洗涤后再次用甲醇DMSO混合溶液洗涤，阳性斑点依然存在(图3Α)，而把鞣质标准溶液点在未被蛋白质包被的PVDF膜上经相同方法处理后阳性斑点消失(图3Β)。实施示例5用本法点样方式检查中药酚性成分野黄芩苷取一张PVDF膜，用甲醇湿润后浸泡在10%的蛋清溶液中，室温振摇3小时后，取出风干备用。取一支含野黄芩苷的注射用粉末，用蒸馏水配制野黄芩苷的饱和水溶液备用，溶液为金黄色。将蛋白质包被的PVDF膜用甲醇润湿后，点野黄芩苷饱和水溶液1 μ 1。然后把此膜浸泡在甲醇溶液中洗涤3次，每次10分钟。此膜洗涤前拍照，洗涤风干后也拍照。结果如图5所示。从图5可见，野黄芩苷鞣质点在普通PVDF膜上和蛋白质包被的PVDF膜上，未被甲醇洗涤前均可见一斑点，但经甲醇洗涤后斑点均消失。表明中药中的小分子有色酚性物质对此法的干扰较小。实施示例6本法点样方式检查鞣质与药典方法的比较取一张PVDF膜，用甲醇湿润后浸泡在10%的蛋清溶液中，室温振摇3小时后，取出风干备用。另制备蛋清生理盐水溶液。
用蒸馏水配制出浓度为6mg/ml的焦性没食子酸溶液5ml，室温自然放置，等溶液的吸光度GlOnm，d = lcm)达到3以上作为鞣质标准储备溶液。取8支1. 5ml试管编号 1-7。1号管加入标准鞣质储备溶液1. 5ml。随后于2-8号管各加入蒸馏水1ml，从1号管中溶液0. 5ml加入到2号管，混勻后再取0. 5ml加入到3号管，依次配制到6号管。即得到浓度梯度为3倍的一组鞣质标准溶液，鞣质的浓度从1号管到8号管依次为6. 00,2. 00,0. 67、 0.22、0·07、0. 02、0mg/ml。取各标准鞣质液Iml加入到比色管中，再加入5ml 1 %蛋清生理盐水溶液，放置10 分钟，观察结果。随后从比色管取液体Iml加入到1. 5ml离心管中，经15，OOOg离心5分钟， 观察有无沉淀。结果如表1所示。表1结果表明《中国药典》检查鞣质的限量>6mg/ml，而离心法的限量约为6mg/ml。表1各标准鞣质管的蛋白质沉淀变化
权利要求
1.一种检查中药注射剂鞣质的方法，其特征在与按以下步骤进行1)将蛋白质吸附膜用蛋白质包被；2)将中药注射剂溶液与蛋白质包被膜接触；3)用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质包被膜；4)观察点样斑点的颜色深浅，判断中药注射剂中的鞣质。
2.根据权利要求1所描述的中药注射剂鞣质检查方法，其特征在于蛋白质吸附膜包括但不限于PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)、硝酸纤维素膜(NC膜)，包被膜的蛋白质包括但不限于蛋清、牛血清白蛋白。
3.根据权利要求1所描述的中药注射剂鞣质检查方法，其特征在于中药注射剂溶液与蛋白质包被膜接触的方式包括但不限于点样方式和过滤方式。
4.根据权利要求1所描述的中药注射剂鞣质检查方法，其特征在于洗涤蛋白质包被膜所用的有机溶液浓度为0-100%，有机溶剂包括但不限于甲醇和DMSO(二甲基亚砜)，以及它们两种或两种以上任意比例的混合；采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限。
全文摘要
一种能够检查中药注射剂鞣质的检查方法，用于检查中药注射剂的鞣质类杂质，以控制中药注射剂的质量。其特征在于按以下步骤进行1)将蛋白质吸附膜用蛋白质包被，2)将中药注射剂溶液与蛋白质包被膜进行接触，3)用含有有机溶剂的溶液洗涤蛋白质包被膜，4)观察点样斑点的颜色深浅，判断中药注射剂中的鞣质。本法点样方式检查中药注射剂所含鞣质的浓度可达0.75-0.25mg/ml，采用滤过方式可达0.07mg/ml，检查限量低于2010年版《中华人民共和国药典(一部)》，同时较强的抗干扰能力强，适用于中药注射剂鞣质的检查。
文档编号G01N33/15GK102221599SQ20111004649
公开日2011年10月19日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者李奇峰, 林青, 柯瑾, 段为钢, 殷华 申请人:云南中医学院