专利名称：一种生物标志抗体芯片、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质芯片领域，具体涉及ー种生物标志抗体芯片、其制备方法及其应用。
背景技术：
抗体芯片(Antibody Microarray)是蛋白质芯片的ー种主要类型,最新发展的抗体芯片技术的原理类似于常规的酶联免疫反应，即将特异性抗体或抗原固定在载体上，待测样本按一定的比例稀释后与载体上的抗体或抗原进行反应，再加入荧光标记的抗体或抗原，通过激光共聚焦扫描仪或CCD相机读取荧光強度，由计算机软件对荧光信号进行分析， 得到准确的定性结果或定量数据。因为在抗体芯片上可分布成千上万的抗体或抗原，因此可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度，从而极大促进蛋白质组的研究和利用。抗体芯片主要受制于如下技术关键I、样本点样条件的优化；2、微阵列载体选择及其表面化学修饰；3、芯片设计和分析系统；4、样本制备，处理和检测技术。因此，现有技术中的抗体芯片一般设计不合理，而且未很好的解决抗体芯片生产过程中点样条件，载体处理和修饰，抗体固定以及样本处理等关键环节，故产品检测的通量小，产品不稳定，特异性不高且可靠性也不强，另外由于涵盖量少，很易产生假阳性或假阴性。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供ー种生物标志抗体芯片、其制备方法及其应用。ー种生物标志抗体芯片，将相关生物标志抗体集中在载玻片大小的载体上。 所述生物标志抗体芯片为前列腺癌抗体芯片。所述载体为利用纳米技术进行化学修饰的载体。所述的生物标志抗体芯片进一歩包括阳性和阴性对照。所述生物标志抗体芯片的制备方法，具体包括抗体芯片的设计与验证；载玻片的处理；载玻片的化学修饰；抗体稀释液的制备、抗体的预处理和质检；微阵列点样仪的设置，预冷和试点样；微阵列点样抗体芯片；抗体芯片的封闭和固定；抗体芯片的质量控制，包装和入库。所述对载玻片的化学修饰包括在载玻片表面偶联活性基团、构建三维聚合物涂层并利用分子自组装技术形成单分子膜。所述抗体的质检包括特异性抗原、细胞系和组织的检测。
所述微阵列点样抗体芯片采用拉丁方实验设计。所述的生物标志抗体芯片的制备方法还包括多模型交互验证统计策略。所述生物标志抗体芯片的应用。本发明提供的生物标志抗体芯片克服了抗体芯片产业化过程中的技术瓶颈，解决了样品点样弥散，不均一；载体的处理和化学修饰不理想而致抗体无法长期保存以及活性不稳定；检测特异性不高、实用性不强；芯片设计和数据分析落后等常见问题。与非生物标志抗体芯片相比，检测通量更高，灵敏度更好，往往ー个产品可检测超过1300个的抗体。由于本发明提供的生物标志抗体芯片采用了特有的载体和化学修饰，使得检测的背景更小，特异性更高。利用本发明提供的样本处理试剂盒和检测试剂盒，使得操作更简便，检测更容易。
图I示出了根据本发明的生物标志抗体芯片的制备方法；图2示出了根据本发明的前列腺癌等肿瘤生物标志抗体芯片检测エ艺流程图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进ー步的详细描述。根据本发明的生物标志抗体芯片将相关生物标志抗体集中在载玻片大小的载体上，可以利用血清或血浆样品进行检测，使得无创伤性、大規模、快速、准确的早期诊断成为可能，同时也疾病的个体化治疗和预后提供及时和准确的參考。本发明的生物标志抗体芯片的基本原理包括按照使用目的的不同，在载玻片大小的载体上点布相同或不同种类的抗体，然后再与标记了荧光染料的样本中的蛋白质结合，经扫描仪读出荧光强弱，计算机分析检测結果。该方法具有一次性检测样本巨大、相对低消耗、计算机自动分析结果以及敏感度，特异性高和快速、准确等特点。根据本发明的生物标志抗体芯片适用样本范围广，既可用于冰冻组织，也可用于蜡块组织和血清等各种体液。随同产品提供的蛋白抽提试剂以及标记溶液，洗脱溶液和检测溶液保证了检测的低背景，高灵敏度。同时也维持了样本制备过程中的完整性和一致性。根据本发明的生物标志抗体芯片专门设置了阳性和阴性对照，从而保证了检测结果的可靠性，避免了假阳性或假阴性。整个操作可在几个小时内完成，方法简单，可操作性闻。根据抗体芯片检测时对样本要求高这ー技术难点，为此，本发明提供相应的蛋白质提取试剂盒，待测样本的处理试剂和标记液以及封闭液和结合液等，上述试剂中含有非常温和的去垢剂并能在高效抽提蛋白(相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白)的同时保持蛋白的天然活性(非变性条件)，这样能够保证抽提的蛋白的溶解性和代表性，确保了实验结果的真实性和原始材料的一致性。提高了检测的灵敏度，降低了非特异性表达。客户只需提供样本和ー些基本耗材，就可以在几个小时内完成样本的检测。根据本发明的生物标志抗体芯片的制备方法如图I所示，具体包括抗体芯片的 设计与验证；载玻片的处理；载玻片的化学修饰；抗体稀释液的制备、抗体的预处理和质检；微阵列点样仪的设置，预冷和试点样；微阵列点样抗体芯片；抗体芯片的封闭和固定；抗体芯片的质量控制，包装和入库。所有优化的单克隆抗体在点样前都经过特异性抗原、细胞系和组织的检测，从而保证了灵敏度(可检测到Pg水平的蛋白质)和特异性。本发明选择耐久性好、表面光滑、来源方便的玻璃载玻片作为主要载体，并利用纳米技术成功的对载体进行有效的化学修饰，在玻片表面偶联活性基团、构建三维聚合物涂层并利用分子自组装技术形成单分子膜，从而保证抗体结构完整，保持与抗原结合的能力，从而解决了现有技术中将抗体固定在芯片的表明并保持它的生物学活性的关键技木。另ー方面，通过纳米技术处理后的抗体芯片，点样点不扩散，能够高密度固定抗体；不同批次芯片之间以及同一芯片上各点样点整齐均一；非特异性吸附较小、信噪比高；抗体結合牢固， 不易脱落。采用本发明的纳米技术开发的产品并经过特殊的化学处理和修饰，保证了结合的抗体能保持三维结构和功能，且不易降解和脱落。为避免芯片中点与点之间的变异，提高检测的准确率，本发明开拓性的将拉丁方实验设计应用于芯片点样的实验设计，这样大大消除了同一芯片上的行间变异和列间变异，减低了抗体结合样品间的差异反应，从而大幅提高检测的准确率。根据本发明的采用拉丁方设计的抗体点样方法，每个抗体在芯片中重复点样6次以上，从而确保了数据的可靠性和持续性。同时，发明中还将多模型交互验证(Multimodel Cross-Validation)统计策略替代了传统的单模型交互验证策略，用多个统计模型同时预测ー个样品，从而使得每ー个未知样品得到更加准确的无偏估计(unbiased estimate)。进ー步提高了准确率。根据本发明的ー个优选实施例，所述的生物标志抗体芯片示例为前列腺癌抗体芯片。本发明在收集，研发已有的和肿瘤相关的生物标志物蛋白的同时，利用高通量的生物抗体芯片，以前列腺癌为切入点，和临床医院通力合作研发并验证新的前列腺癌生物标志蛋白，同时开展对其他肿瘤生物标志物的发现和验证，建立各种肿瘤相关的生物标志蛋白信息和抗原库。具体包括I)根据收集到的前列腺癌生物标志蛋白以及相关序列，设计并生产鼠单克隆抗体；根据本发明的另ー个方面，从市场上直接购买现有的前列腺癌生物标志抗体，以保证产品的及时生产；2)对生产或购买的抗体进ー步加以质控的检测包括特异性，敏感度以及和其他种系的交叉反应；3)进行芯片的设计，在ー张载玻片上除了阳性和阴性作为对照，还将函盖所有能收集到的跟前列腺癌相关的生物标志抗体；4)载玻片的处理和化学修饰；5)芯片的制备和质检；6)产品批号的申报。根据本发明的前列腺癌等肿瘤生物标志抗体芯片检测エ艺流程图如图2所示。根据本发明的另ー个优选实施例，所述的生物标志抗体芯片示例为肺癌，乳腺癌，食道癌或肠癌等抗体芯片。根据本发明的生物标志抗体芯片的应用包括疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域。以上所述的，是根据本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的技术内容为本领域技术人员的公知常识。
权利要求
1.ー种生物标志抗体芯片，其特征在干，将相关生物标志抗体集中在载玻片大小的载体上。
2.如权利要求I所述的生物标志抗体芯片，其特征在于，所述生物标志抗体芯片为前列腺癌抗体芯片。
3.如权利要求I所述的生物标志抗体芯片，其特征在于，所述载体为利用纳米技术进行化学修饰的载体。
4.如权利要求I所述的生物标志抗体芯片，进一歩包括阳性和阴性对照。
5.如权利要求1-4中任一项所述的生物标志抗体芯片的制备方法，具体包括抗体芯片的设计与验证；载玻片的处理；载玻片的化学修饰；抗体稀释液的制备、抗体的预处理和质检；微阵列点样仪的设置，预冷和试点样；微阵列点样抗体芯片；抗体芯片的封闭和固定；抗体芯片的质量控制，包装和入库。
6.如权利要求5所述的生物标志抗体芯片的制备方法，其特征在于，所述对载玻片的化学修饰包括在载玻片表面偶联活性基团、构建三维聚合物涂层并利用分子自组装技术形成单分子膜。
7.如权利要求5所述的生物标志抗体芯片的制备方法，其特征在于，所述抗体的质检包括特异性抗原、细胞系和组织的检测。
8.如权利要求5所述的生物标志抗体芯片的制备方法，其特征在于，所述微阵列点样抗体芯片采用拉丁方实验设计。
9.如权利要求5所述的生物标志抗体芯片的制备方法，还包括多模型交互验证统计策略。
10.如权利要求1-4中任一项所述的生物标志抗体芯片的应用。
全文摘要
本发明提供一种生物标志抗体芯片，将相关生物标志抗体集中在载玻片大小的载体上。本发明还提供所述生物标志抗体芯片的制备方法，具体包括抗体芯片的设计与验证；载玻片的处理；载玻片的化学修饰；抗体稀释液的制备、抗体的预处理和质检；微阵列点样仪的设置，预冷和试点样；微阵列点样抗体芯片；抗体芯片的封闭和固定；抗体芯片的质量控制，包装和入库。本发明还提供所述生物抗体芯片的应用。根据本发明的生物标志抗体芯片检测通量更高，灵敏度更好；检测的背景更小，特异性更高；操作更简便，检测更容易。
文档编号G01N33/543GK102692501SQ20111007120
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月23日 优先权日2011年3月23日
发明者范盘生 申请人:上海安瑞生物科技有限公司