专利名称：一种利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物及医学领域，具体涉及检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法。
背景技术：
淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)是I型跨膜糖蛋白，在哺乳动物进化过程中高度保守，其基因定位于人染色体21q，APP在大部分的组织细胞中都有表达。因APP基因突变或者缺失，会引起组织细胞中APP含量的变化，引起进而一些疾病，如皮肤基底细胞癌、阿尔茨海默病等。外周血的血小板APP含量能准确反映体内APP的水平，因此建立一种快速、微创、灵敏的血小板APP检测方法具有重要意义。传统检测血小板中APP的方法是生物化学的方法，其主要流程为提取血小板，用蛋白提取液将血细胞匀浆，然后应用免疫学的方法将APP吸附、分离、在胶片或计算机上成 像，利用灰度值反映APP含量。该方法需要的血小板量大、操作复杂、灵敏度低。因此，研究一种需血小板量少、操作步骤少、操作简单、灵敏度高的检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法成为该领域的重要课题。
发明内容
本发明的任务是提供一种利用拉曼光谱(Raman spectroscopy)扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，使其具有需血小板量少、操作步骤少、操作简单、灵敏度高等特点。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)的方法，包括以下步骤步骤一从待检血液样品中分离出血小板；步骤二 取分离出的血小板滴加到光滑的金片上；步骤三将滴加有血小板的金片置于激光拉曼显微镜下进行光谱扫描；步骤四对光谱扫描结果进行分析。上述步骤一所述的从待检血液样品中分离出血小板的具体方法包括以下步骤步骤a.抽取5ml新鲜血液置于含有EDTA抗凝剂的离心管中；步骤b.离心15分钟，离心条件为转速60g，温度4°C，去上清，分离出血浆；步骤c.离心15分钟，离心条件为转速60g，温度4°C，分离沉淀，取上清；步骤d.将上清液离心15分钟，离心条件为转速1500g，温度4°C，去上清，沉淀出血小板。其中步骤b和步骤c中的离心条件为转速60g，温度4°C ;步骤c中的离心条件为转速1500g，温度4°C。前述步骤二中滴加到金片上的血小板的量为l_5iil，具体可以是2iil。
前述步骤三中将滴加有血小板的金片置于激光拉曼显微镜下进行光谱扫描的扫描条件是所用光源为激发波长为633nm的半导体激光器，功率17mw，通过光栅和滤光片后，实际到达样品的功率不足lmw，确保样品成分完整。检测镜头为50倍长焦镜头(numerical apertufe (NA) 0. 50, Olympus, Japan),汇聚激光为直径约 I. 5 y m 的光斑；信号采集时间为30秒，累积扫描4次，采谱范围为600-1700(^^600线的光栅使光谱分辨率达到 5cm 1O前述步骤四中所述的对光谱扫描结果进行分析的具体方法是读取740cm—1与1654cm—1处峰强值，以757cm—1处的峰做参比，740cm—1与1654cm—1处峰强增加，为检测出有APP存在，且740cm—1峰强与APP含量呈正相关。本发明提供了一种利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，主要流程为提取血小板，将血小板置于拉曼显微镜下进行拉曼光谱扫描，从光谱值反映APP含量。与传统生化方法相比具有所需血小板量少(2 yl)、操作步骤少、灵敏度高等优点。 实验资料(一 )实验目的利用拉曼光谱扫描法检测转APP基因小鼠血小板APP，并与不含外源性APP基因的小鼠、血管性痴呆(VD)模型小鼠、帕金森病(PD)模型小鼠进行对照。( 二)实验材料及仪器血小板分别来源于转APP基因小鼠及其背景小鼠(C57小鼠)、血管性痴呆模型小鼠、帕金森病模型小鼠，制备方法见以下实验操作部分。离心机Sigma离心机。激光拉曼显微镜及载物金片HR800，Horbia Jobin Yvon，法国产。(三)实验操作I.制备血小板I. I抽取的5ml新鲜血液置于含有EDTA抗凝剂的离心管中；I. 2离心15分钟，离心条件为转速60g，温度4°C，去上清，分离出血浆；I. 3离心15分钟，离心条件为转速60g，温度4°C，分离沉淀，取上清；I. 4将上清液离心15分钟，离心条件为转速1500g，温度4°C，去上清，沉淀出血小板；2.拉曼光谱扫描将2 ill的血小板滴到光滑的金片上，置于激光拉曼显微镜(HR800，Horbia JobinYvon，法国产)下，进行光谱扫描。3.光谱分析利用MATLAB软件完成。在740(^1与1654(^1处峰强能反映血小板APP的变化。(四)结果I.图I为转APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光谱。720nm激发光下血红素的拉曼谱峰主要出现在759，1231，1568，1626and 1640cm—1，而从图I中除了 759CHT1之外，未明显出现和血红素有关的谱峰，说明血小板采集成功。2.图2显示的是不同小鼠模型的平均拉曼光谱对比。图2中的A图为4月龄，12月龄转APP基因小鼠的平均拉曼光谱对比，箭头所示的地方存在明显的光谱差异。第一个差异为740CHT1处的峰强变化，如果以旁边757CHT1处的峰做参比，4月龄的转APP基因小鼠血小板拉曼光谱在此处峰强明显的强于对照组的，并且此峰在12月龄的转APP基因小鼠血小板拉曼光谱中进一步增强，说明740cm—1峰强随APP增加而增大。第二个光谱差异就是1654cm-1处的峰强，4月龄及12月龄转APP基因小鼠血小板光谱中该处峰强要明显弱于对照组。图2中的B图显示的是转APP基因小鼠，VD及TO模型血小板的平均拉曼光谱。3.图3显示的是对4月龄，12月龄转APP基因小鼠及对照组的血小板光谱数据的分类结果。进一步对光谱数据进行分类分析表中的数字结果显示不仅能对转APP基因小鼠血小板和正常血小板进行区分，更能将不同月龄的转APP基因小鼠血小板和正常血小板都区分开来。4月龄转APP基因小鼠区分灵敏度为79%，12月龄转APP基因小鼠区分灵敏度也上升到93. 5%。4.图4中的A图显示了 12月龄转APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果图显示了 12月龄转APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果，W2和W3是对应的分类特征组合。很明显所有区分灵敏度都超过了 90%，说明该 方法可以有效的将APP基因小鼠血小板与VD、PD模型血小板区分。以上实验证明血小板拉曼光谱(如740CHT1峰强)能灵敏反映转APP基因小鼠血小板APP水平。
图I为转APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光谱。图2显示的是不同小鼠模型的平均拉曼光谱对比。图3显示的是对4月龄，12月龄转APP基因小鼠及对照组的血小板光谱数据的分
类结果。图4中A图显示了 12月龄转APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果；B图显示了 12月龄转APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果。
具体实施例方式实施例I利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白I制备血小板I. I抽取的5ml新鲜血液置于含有EDTA抗凝剂的离心管中；I. 2离心15分钟，离心条件转速60g，温度4°C，去上清，分离出血浆；I. 3离心15分钟，离心条件转速60g，温度4°C，分离沉淀，取上清；I. 4将上清液离心15分钟，离心条件转速1500g，温度4°C，去上清，沉淀出血小板。2拉曼光谱扫描将2 ill的血小板滴到光滑的金片上，置于激光拉曼显微镜(HR800，Horbia JobinYvon，法国产)下，进行光谱扫描。扫描条件所用光源为激发波长为633nm的半导体激光器，功率17mw，通过光栅和滤光片后，实际到达样品的功率不足lmw，确保样品成分完整。检测镜头为50倍长焦镜头(numerical aperture (NA) 0. 50, Olympus, Japan),汇聚激光为直径约I. m的光斑；信号采集时间为30秒，累积扫描4次，采谱范围为600-1700(^^600线的光栅使光谱分辨率达到5CHT1。3光谱分析读取740CHT1与1654CHT1处峰强值，以757CHT1处的峰做参比，740CHT1与1654CHT1处峰强增加说明存在APP，即为检测出有APP存在，而且740CHT1峰强与APP含量正相关。4 结果4. I图I为转APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光谱。720nm激发光下血红素的拉曼谱峰主要出现在759，1231，1568，1626and 1640CHT1，而从图I中除了 759cm_1之外，未明显出现和血红素有关的谱峰，说明血小板采集成功。4. 2图2显示的是不同小鼠模型的平均拉曼光谱对比。图2中的A图为4月龄，12月龄转APP基因小鼠的平均拉曼光谱对比，箭头所示的地方存在明显的光谱差异。第一个差异为740CHT1处的峰强变化，如果以旁边757CHT1处的峰做参比，4月龄的转APP基因小鼠血小板拉曼光谱在此处峰强明显的强于对照组的，并且此峰在12月龄的转APP基因小鼠血小板拉曼光谱中进一步增强，说明740CHT1峰强随APP增加而增大。第二个光谱差异就是1654cm-1处的峰强，4月龄及12月龄转APP基因小鼠血小板光谱中该处峰强要明显弱于对照组。图2中的B图显示的是转APP基因小鼠，VD及模型血小板的平均拉曼光谱。4. 3图3显示的是对4月龄，12月龄转APP基因小鼠及对照组的血小板光谱数据的分类结果。进一步对光谱数据进行分类分析表中的数字结果显示不仅能对转APP基因小鼠血小板和正常血小板进行区分，更能将不同月龄的转APP基因小鼠血小板和正常血小板都区分开来。4月龄转APP基因小鼠区分灵敏度为79%，12月龄转APP基因小鼠区分灵敏度也上升到93. 5%。4，4图4中的A图显示了 12月龄转APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果；B图显示了 12月龄转APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光谱数据分类结果，W2和W3是对应的分类特征组合。很明显所有区分灵敏度都超过了 90%，说明该方法可以有效的将APP基因小鼠血小板与VD、PD模型血小板区分。上述实施例证明血小板拉曼光谱(如740CHT1峰强)能灵敏反映转APP基因小鼠血小板APP水平。权利要求
1.ー种利用拉曼光谱扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，包括以下步骤 步骤ー从待检血液样品中分离出血小板； 步骤ニ 取分离出的血小板滴加到光滑的金片上； 步骤三将滴加有血小板的金片置于激光拉曼显微镜下进行光谱扫描； 步骤四对光谱扫描结果进行分析。
2.根据权利要求I所述的检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，其特征在于，步骤一所述的从待检血液样品中分离出血小板的具体方法包括以下步骤 步骤a .抽取5ml新鲜血液置于含有EDTA抗凝剂的离心管中； 步骤b.尚心15分钟，去上清,分尚出血衆； 步骤c .离心15分钟，分离沉淀,取上清； 步骤d .将上清液离心15分钟，去上清，沉淀出血小板。
3.根据权利要求2所述的检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，其特征在于，步骤b和步骤c中的离心条件为转速60g，温度4°C ;步骤c中的离心条件为转速1500g，温度4°C。
4.根据权利要求I所述的检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，其特征在于，步骤ニ中滴加到金片上的血小板的量为1-5 μ I。
5.根据权利要求3所述的检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，其特征在于，步骤ニ中滴加到金片上的血小板的量为2 μ I。
6.根据权利要求I所述的检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，其特征在于，步骤三中将滴加有血小板的金片置于激光拉曼显微镜下进行光谱扫描的扫描条件是所用光源为激发波长为633nm的半导体激光器，功率17mw，通过光栅和滤光片后，实际到达样品的功率不足Imw,确保样品成分完整,检测镜头为50倍长焦镜头(numerical aperture (NA)O.50, Olympus, Japan),汇聚激光为直径约I. 5Mm的光斑；信号采集时间为30秒,累积扫描4次，采谱范围为600-1700 CnT1JOO线的光栅使光谱分辨率达到δοπΓ1。
7.根据权利要求I所述的检测血小板膜上淀粉样前体蛋白的方法，其特征在于，步骤四中所述的对光谱扫描结果进行分析的具体方法是读取740 cm—1与1654cm—1处峰强值，以757CHT1处的峰做參比，740 cnT1与1654CHT1处峰强增加，为检测出有APP存在，且740 cnT1峰强与APP含量呈正相关。
8.拉曼光谱Ramanspectroscopy扫描法检测血小板膜上淀粉样前体蛋白AmyloidPrecursor Protein, APP 的应用。
全文摘要
本发明提供了一种利用拉曼光谱(Ramanspectroscopy)扫描法检测血小板膜淀粉样前体蛋白(AmyloidPrecursorProtein，APP)的方法，主要流程为提取血小板，将血小板置于拉曼显微镜下进行拉曼光谱扫描，从光谱值反映APP含量。与传统生化方法相比具有所需血小板量少(2μl)、操作步骤少、灵敏度高等优点。
文档编号G01N21/65GK102692403SQ20111007231
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者沈爱国, 王建枝, 田青, 胡继明 申请人:华中科技大学