专利名称：一种周围神经切片染色的方法
技术领域：
本发明涉及周围神经模型，尤其涉及一种周围神经切片染色的方法。
背景技术：
周围神经损伤是临床常见的致残性疾病，尤其是那些造成神经缺损的损伤。临床上采用的修复方法有直接缝合、自体神经移植等。目前，可替代自体神经用于修复神经缺损的移植材料主要有人工合成材料、生物衍生材料和组织工程神经三大类，虽然大部分仍处于实验研究阶段，但也有部分材料已应用于临床。所有的修复方法都是为了恢复神经的连续性和完整性，为近端再生的神经轴突和相应的末梢靶器官重建突触联系提供条件。但不论哪种方法修复的神经，都有可能出现神经纤维的错长，使得靶器官得不到应有的神经支配，导致感觉和运动等功能恢复不良。要想解决这个问题，需要充分了解周围神经内部神经纤维的构造，特别是运动神经纤维和感觉神经纤维所构成的功能束是如何分布和走行的。 研究表明不同部分周围神经的内部构型不是完全一样的，但这些研究只是针对人体的部分神经，提供信息有限，关于功能束的走行和分布，仍无较为全面充分的阐述。由此，建立周围神经三维可视化模型及相关产品对于医学研究、临床治疗、组织工程神经的制备有重大意义。请参阅图1，目前建立周围神经三维可视化模型，都选用Karnovsky-Roots法染色后的周围神经切片来获取图像，这些图像在确定周围神经束轮廓和内部不同性质神经纤维分布时需要人工进行轮廓确定和可视化；而且每个神经切片只有几微米厚，要想建立全身周围神经系统三维可视化模型需要将周围神经制成极大数量的切片。这对于建立全身周围神经可视化模型既准确性欠佳又工作量巨大，使用该方法获得二维图像提供信息有限，不适合用于指导医学研究、临床治疗、组织工程神经的制备。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种制作周围神经横断面切片的方法，使染色后的切片图像中运动神经功能束和感觉神经功能束分布特征更加明显，能够经计算机平台自动进行轮廓获取和图像分割，有利于构建更加符合真实状态下人的周围神经三维可视化模型。为了实现上述目的，本发明的技术方案为一种周围神经切片染色的方法，依次包括获取周围神经标本的步骤、所述标本的切片步骤、所述标本切片的染色步骤以及风干步骤，所述切片的染色步骤包括第一次染色步骤、第二次染色步骤及第三次染色步骤。所述的第一次染色步骤包括利用常规的Karnovsky-Roots法染色，所述的第二次染色步骤包括利用甲苯胺蓝进行染色，所述的第三次染色步骤包括利用丽春红2R染色液进行染色。所述获取周围神经标本的步骤包括取出标本中神经周围其他组织，将神经用 10%,20%,30%蔗糖水依次过夜。
所述标本的切片步骤包括(1)将标本固定在软木片上，保持其伸直状态，与之长轴平行放置女性头发作为标志线，用组织包埋剂包埋标本，_80°C速冻，将标本切成1-1. 5cm 长度标本；(2)复温至_20°C条件，将标本切成5-10 μ m厚度切片。所述的第一次染色步骤进一步包括孵育液配方孵育标本12小时，蒸馏水洗去标本上多余的孵育液。所述的第二次染色步骤进一步包括1 %的甲苯胺蓝在37 °C下复染标本30分钟，蒸馏水洗去标本上多余的孵育液。所述的第三次染色步骤进一步包括丽春红2R染色液染色5分钟，的磷钨酸分色约1分钟，的冰醋酸处理10秒钟。所述标本切片的风干步骤进一步包括风干切片，依次浸泡90 %、95 %、无水酒精脱水，每次一分钟，浸泡二甲苯两次，每次5分钟透明。与现有技术相比，经Karnovsky-Roots法染色后的神经切片再依次采用甲苯胺蓝、丽春红染色，运动神经纤维轴突和髓鞘均可清晰显示，以这两个特征确定运动神经纤维的位置，使用计算机平台自动进行神经束轮廓获取和不同性质神经纤维分布区域分割，实现人体周围神经三维可视化模型的建立。
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。图1是单纯Karnovsky-Roots法染色后神经切片图像。图2是复染甲苯胺蓝后的切片图像。图3是丽春红复染髓鞘后的切片图像。
具体实施例方式本发明周围神经切片染色的方法如下1、解剖新鲜自愿捐献尸体，获取新鲜周围神经标本。2、取出神经周围其他组织，将神经用10%、20%、30%蔗糖水依次过夜。3、将标本固定在软木片上，保持其伸直状态，与之长轴平行放置女性头发作为标志线，用组织包埋剂(opti-mum cutting temperature compound, OCT)包埋标本，_80°C速冻，将标本切成1-1. 5cm长度标本。4、复温至_20°C条件，冰冻切片机将标本切成5-10 μ m厚度切片，切6 μ m厚度最佳。5、Karnovsky-Roots法孵育液配方孵育12小时，蒸馏水洗去多余孵育液。 (Karnovsky-Roots法孵育液配方碘化乙酰硫代胆碱12. 5mg ；0. lmol/L磷酸缓冲液 16mL (0. lmol/L 磷酸氢二钠 9mL, 0. lmol/L 磷酸二氢钾 7mL) ；0. lmol/L 柠檬酸钠 ImL ； 30mmol/L硫酸铜2. 5mL ；5mmol/L铁氰化钾2. 5mL ；蒸馏水^iiL。孵育液于用前20分钟配好。)6、1%甲苯胺蓝染色37°C复染30分钟(甲苯胺蓝lg、硼酸钠(四硼酸钠， Na2B407. 10H20) lg、加三蒸水100ml溶解)，蒸馏水洗去多余孵育液。7、丽春红跗染色液(配方比例丽春红跗lg，冰醋酸2. 5ml，蒸馏水97. 5ml)染5min，磷钨酸分色约1分钟，冰醋酸处理10秒。8、风干切片，依次浸泡90^^95%,无水酒精脱水，每次一分钟；浸泡二甲苯两次， 每次5分钟透明。请参阅图2，Karnovsky-Roots法染色后周围神经切片，再经过甲苯胺蓝复染后， 图像显示原有的阳性部位被加强，但阳性部位的面积和位置不发生变化，复染后切片仍可采用Karnovsky-Roots法染色规律进行定性定位运动神经纤维和感觉神经纤维。请参阅图3，采用丽春红复染髓鞘后的切片图像，图像显示红色的丽春红不影响甲苯胺蓝复染后的切片，并且可以在图像上形成蓝色和红色明显的对比，不同性质神经纤维特征更加明显，方便使用计算机平台在图像上自动进行不同性质神经纤维范围的划分。
权利要求
1.一种周围神经切片染色的方法，依次包括获取周围神经标本的步骤、所述标本的切片步骤、所述标本切片的染色步骤以及风干步骤，其特征在于，所述切片的染色步骤包括第一次染色步骤、第二次染色步骤及第三次染色步骤。
2.根据权利要求1所述的周围神经切片染色的方法，其特征在于，所述的第一次染色步骤包括利用常规的Karnovsky-Roots法染色，所述的第二次染色步骤包括利用甲苯胺蓝进行染色，所述的第三次染色步骤包括利用丽春红2R染色液进行染色。
3.根据权利要求1所述的周围神经切片染色的方法，其特征在于，所述获取周围神经标本的步骤包括取出标本中神经周围其他组织，将神经用10^^20^^30%蔗糖水依次过夜。
4.根据权利要求1所述的周围神经切片染色的方法，其特征在于，所述标本的切片步骤包括(1)将标本固定在软木片上，保持其伸直状态，与之长轴平行放置女性头发作为标志线，用组织包埋剂包埋标本，_80°C速冻，将标本切成1-1. 5cm长度标本；(2)复温至_20°C 条件，将标本切成5-10 μ m厚度切片。
5.根据权利要求2所述的周围神经切片染色的方法，其特征在于，所述的第一次染色步骤进一步包括孵育液配方孵育标本12小时，蒸馏水洗去标本上多余的孵育液。
6.据权利要求2所述的周围神经切片染色的方法，其特征在于，所述的第二次染色步骤进一步包括的甲苯胺蓝在37°C下复染标本30分钟，蒸馏水洗去标本上多余的孵育液。
7.权利要求2所述的周围神经切片染色的方法，其特征在于，所述的第三次染色步骤进一步包括丽春红2R染色液染色5分钟，1 %的磷钨酸分色约1分钟，1 %的冰醋酸处理10秒钟。
8.权利要求2所述的周围神经切片染色的方法，其特征在于，所述标本切片的风干步骤进一步包括风干切片，依次浸泡90^^95%,无水酒精脱水，每次一分钟，浸泡二甲苯两次，每次5分钟透明。
全文摘要
本发明公开了一种周围神经切片染色的方法，依次包括获取周围神经标本的步骤、所述标本的切片步骤、所述标本切片的染色步骤以及风干步骤，所述切片的染色步骤包括第一次染色步骤、第二次染色步骤及第三次染色步骤。本方法使得染色后的切片图像中运动神经功能束和感觉神经功能束分布特征更加明显，能够经计算机平台自动进行轮廓获取和图像分割，有利于构建更加符合真实状态下人的周围神经三维可视化模型。
文档编号G01N1/30GK102243154SQ201110084099
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者刘小林, 张毅, 戚剑, 朱庆棠, 罗鹏, 顾立强 申请人:中山大学附属第一医院