专利名称：鸭源性冠状病毒夹心elisa试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒检测技术，具体涉及一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒及其应用。
背景技术：
河南省郑州某养殖场2004年5月发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB 疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率达 10%以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳头肿大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”，肺脏无明显变化， 法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株(保藏编号CGMCC NO. 3842)，其专利文献公开号为CN 101906404A，此为首次有关家鸭感染IBV的报道。本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖场，其不仅引起鸡的大批发病及死亡，还感染了鸭群，严重影响了家鸭的生长发育并导致鸭的死亡。与其它禽类的冠状病毒相比，鸭源性冠状病毒ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更广。目前，国内外已建立了许多IBV相关的诊断技术，主要分为抗体检测和抗原检测两大类。抗体检测方法包括间接免疫荧光法、ELISA法、免疫过氧化物酶单层细胞试验、中和试验等。目前所有针对抗体的检测方法都无法区分免疫鸡群和感染鸡群，从而影响疫病的及时、有效防控。而抗原检测方法则结果较直接，能明确病毒感染。针对IBV抗原检测的方法主要有RT-PCR法、病毒分离、免疫组化等，各方法均存在一些不足之处。例如，病毒分离方法耗时、费力；免疫组化方法操作繁琐，影响因素较多，并且结果判断具有一定的主观性； RT-PCR方法对检测人员实验操作技能要求较严格，且成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、精确度高、操作简便、检测快速的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒，并公开了其应用方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是
一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒，包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液，其还包括
(1)包被抗体的酶标板以抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗作为包被抗体，用包被液将单抗稀释到lOPg/ml，每孔加入ΙΟΟμ ，4°C冰箱中过夜，用洗涤液PBST洗涤2 4次，再向酶标板中加入5% (g/mL)的BSA封闭液，ΙΟΟμ ν孔，37°C反应2h，洗涤液PBST洗涤2 4次；
(2)捕获抗体兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗；
(3)酶标抗体HRP标记的羊抗兔IgG。所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗由保藏编号为CGMCC NO. 4171的杂交瘤细胞株3H10分泌制得。所述兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗的制备方法如下
将病毒进行纯化，选择2. 0 2. 5 kg之间的大白兔进行四次免疫，时间分别为第1天， 第14天，第28天和第30天，第4次免疫后一周进行心脏采血，分离血清，即得兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗。所述鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法，包括以下步骤
(1)加待检样品取试剂盒中的包被抗体的酶标板，向其中加入经过处理的待检样品， ΙΟΟμ ν孔，同时分别设立阳性对照和阴性对照，37°C下反应25 35min，洗涤液PBST洗涤 2 4次；
(2)添加捕获抗体取试剂盒中的捕获抗体，按1:100倍稀释后加入到上述酶标板中， ΙΟΟμ ν孔，37°C反应25 35min，洗涤液PBST洗涤2 4次；
(3)添加酶标抗体取试剂盒中的酶标抗体，用洗涤液PBST按照1:1000的比例进行稀释并混勻，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反应25 35min，以洗涤液PBST洗涤2 4次；
(4)显色加入TMB显色液，ΙΟΟμ ν孔，在室温下显色8 12min，用2M的H2SO4为终止液终止显色；
(5)测OD值用酶标仪进行测量，测OD值。所述待检样品的前处理方法如下
采集相应的待检组织器官1. 0g，进行研磨，加入Iml灭菌的PBS缓冲液，IOOOrpm离心 IOmin,取上清，8000rpm离心lOmin，取上清。在所述步骤(5 )中，当P/N值> 2时，待检样品为阳性，其中P为待检样品的OD值， N为阴性对照的OD值。本发明具有积极有益的效果
1.本发明中所用的包被抗体为单克隆抗体，有力地排除了多种非特异性的干扰，特异性强，精确度高；
2.本发明仅涉及的简单的检测仪器，操作步骤简便，普通技术人员也易于操作使用，易于推广普及；
3.本发明适用于大量样品的检测，快速便捷，且检测成本低。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常 规方法。下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试齐Ll商店。实施例1 一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒，包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液，以及
(1)包被抗体的酶标板用抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗作为包被抗体，用包被液将单抗稀释到lOPg/ml，每孔加入10(^L，4°C冰箱中过夜，用洗涤液PBST洗涤3次；向酶标板中加入5%的BSA封闭液，ΙΟΟμΙ/孔，37°C反应2h，洗涤液PBST洗涤3次；
上述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗由保藏编号为CGMCC NO. 4171的杂交瘤细胞株3H10分泌制得，详细制备方法可参见发明人的另一项专利文献CN 101993856A。(2)捕获抗体兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗；其制备方法为将病毒进行纯化，选择2. 0 2. 5 kg之间的日本大白兔进行免疫，免疫分四次，时间分别为第1天，第14 天，第28天和第30天，第4次免疫后一周进行心脏采血，分离血清，即为兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗。(3)酶标抗体HRP标记的羊抗兔IgG (购于宝赛生物公司)； 以上述鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒应用方法如下
(1)加待检样品分别采集人工感染鸭源性冠状病毒ZZ2004株的鸡的心脏、肝脏和肾脏组织1. 0g，进行研磨，加入Iml灭菌的PBS缓冲液，IOOOrpm离心lOmin，取上清，8000rpm 离心lOmin，取上清；取试剂盒中的包被抗体的酶标板，向其中加入上步所得上清，每孔中加入100μ ，同时分别设立阳性对照和阴性对照，37°C反应30min，洗涤液PBST洗涤3次。(4)添加捕获抗体用兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗作为捕获抗体，1 100 倍稀释，ΙΟΟμ /孔，37°C下反应30min，洗涤液PBST洗涤3次。(5)添加酶标抗体取HRP标记的羊抗兔IgG，用PBST按照1:1000的比例进行稀释并混勻，ΙΟΟμ /孔，37°C下反应30min，洗涤液PBST洗涤3次。(6)显色每孔中加入TMB显色液100μ1，在室温下显色10分钟，用2Μ的H2SO4终止显色。(7)测OD值用酶标仪进行测量，测OD值，测得各样品及阳性对照、阴性对照的OD 值如表1所示。其阳性判定标准为Ρ/Ν大于2即为阳性(其中P为待检样品的OD值，N为阴性对照的OD值)，从表1中可知，人工感染的鸡的心脏、肝脏和肾脏中均含有鸭源性冠状病毒 ΖΖ2004 株。表1各待检样品及阳性对照、阴性对照酶标仪测量的OD值_
权利要求
1.一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒，包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液， 其特征在于，它还包括(1)包被抗体的酶标板以抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗作为包被抗体，用包被液将单抗稀释到lOPg/ml，每孔加入ΙΟΟμ ，4°C冰箱中过夜，用洗涤液PBST洗涤2 4次，再向酶标板中加入5%的BSA封闭液，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反应2h，洗涤液PBST洗涤2 4次；(2)捕获抗体兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗；(3)酶标抗体HRP标记的羊抗兔IgG。
2.根据权利要求1所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗由保藏编号为CGMCC NO. 4171的杂交瘤细胞株3H10分泌制得。
3.根据权利要求1所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗的制备方法如下将病毒进行纯化，选择2. O 2. 5 kg之间的大白兔进行四次免疫，时间分别为第1天， 第14天，第28天和第30天，第4次免疫后一周进行心脏采血，分离血清，即得兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗。
4.权利要求1所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法，包括以下步骤(1)加待检样品取试剂盒中的包被抗体的酶标板，向其中加入经过处理的待检样品， ΙΟΟμ ν孔，同时分别设立阳性对照和阴性对照，37°C下反应25 35min，洗涤液PBST洗涤 2 4次；(2)添加捕获抗体取试剂盒中的捕获抗体，按1:100的体积比稀释后加入到上述酶标板中， οομ ν孔，37°C下反应25 35min，洗涤液PBST洗涤2 4次；(3)添加酶标抗体取试剂盒中的酶标抗体，用洗涤液PBST按照1:1000的比例进行稀释并混勻，ΙΟΟμ ν孔，37°C下反应25 35min，以洗涤液PBST洗涤2 4次；(4)显色加入TMB显色液，ΙΟΟμ ν孔，在室温下显色8 12min，用2M的H2SO4为终止液终止显色；(5)测OD值用酶标仪进行测量，测OD值。
5.根据权利要求4所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法，其特征在于， 所述待检样品的前处理方法如下采集相应的待检组织器官1. 0g，进行研磨，加入Iml灭菌的PBS缓冲液，IOOOrpm离心 IOmin,取上清，8000rpm离心lOmin，取上清。
6.根据权利要求5所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法，其特征在于， 在所述步骤(5)中，当P/N值>2时，待检样品为阳性，其中P为待检样品的OD值，N为阴性对照的OD值。
全文摘要
本发明涉及一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒及其应用。该试剂盒包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液、包被抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗的酶标板、捕获抗体及酶标抗体；其检测方法为将待检样品放入包被抗体的酶标板，再依次添加捕获抗体、酶标抗体反应后加显色剂显色，测OD值。本发明中所用的包被抗体为单克隆抗体，有力地排除了多种非特异性的干扰，特异性强，精确度高；本发明仅涉及的简单的检测仪器，操作步骤简便，普通技术人员也易于操作使用，易于推广普及；本发明适用于大量样品的检测，快速便捷，且检测成本低。
文档编号G01N33/577GK102221611SQ20111010351
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者刘兴友, 刘明成, 王丽荣, 胡建和 申请人:河南科技学院